脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序

脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序

一、试剂准备

（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：

试剂名称浓度商品信息

1.极限必须培养基

(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L

(SH30021.01B, Hyclone)

2.胎牛血清

（Fetal Bovine Serum，FBS）10%

(ES-009-B, Millipore)

3.青霉素/链霉素

（Penicillin/Streptomycin）1%

（TMS-AB2C, CHEMICON）

4.地塞米松

(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46

(D4902-25MG, Sigma)

5.胰岛素

(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808

(91077C—1g, Sigma)

6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤

(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24

( I5879-100MG, Sigma)

7.吲哚美辛

(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79

(I7378—5G, Sigma)

（二）成脂分化诱导液浓储液配制

试剂名称质量浓缩倍数配制方法

1.Stock A

胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃

2.Stock B

青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃

3.Stock C

地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300

保存：-20℃

4.Stock D

胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100

保存：4℃

5.Stock E

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃

6.Stock F

吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100

保存：-20℃

（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）

1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;

2.加1管Stock A（1ml）；

3.加1管Stock B（0.1ml）；

4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；

5.加1管Stock E（0.05ml）；

6.加1管Stock F（0.02ml）；

7.加1管Stock D（0.1ml）；

8.测渗透压，调pH7.2-7.4;

9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。

（四）Stromal Medium配制（10ml）【２】：

1.取DMEM8.9ml加入15ml离心管（BD）;

2.加入1管Stock A（1ml）；

3.加入1管Stock B（0.1ml）；

4.调pH7.2-7.4;

5.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。

（五）0.5%油红“O”配制【３】

油红“O”0.5 g溶于100ml 无水乙醇（50%），分装备用，使用前0.22μm过滤

二、方法

（一）细胞诱导培养【4】

1.间充质干细胞传代培养至第三代，待细胞融合至80%左右，从培养箱内取出细胞至垂

直超净台；

2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；

3.1ml微量移液器吸弃培养液；

4.加入预温PBS，1ml/孔；

5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；

6.吸弃PBS；

7.重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次；

8.加入Trypsin/EDTA消化液，1ml/孔，5min，37℃；

9.加入等量Stromal Medium，终止消化；

10.1ml微量移液器彻底吹洗皿底，收集细胞悬液至15ml离心管内；

11.1400rpm,RT,5min;

12.小心取出离心管，吸弃上清；

13.加入Stromal Medium重悬消化下来的细胞；

14.按1× 104个/ml接种到24孔板内（此时若解冻细胞，按冻存密度5*105个/ml计算，可

铺6孔板10个孔，12孔板25个孔，24孔板50个孔），加入Stromal Medium培养基培养3天，设置对照组（一直使用Stromal Medium培养），空白组（添加DMEM 覆盖皿底即可）；

15.3天后，实验组吸弃原有培养基，换用成脂诱导培养基（AM）；

16.每2-3天换液一次；

17.诱导2周后，初始脂肪形成时用油红“O”染色进行评估。

（二）油红“O”染色：

1.从培养箱内取出细胞至普通实验台；

2.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；

3.1ml微量移液器吸弃培养液；

4.加入预温PBS，1ml/孔，；

5.X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向；

6.吸弃PBS；

7.重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次；

8.加入4%多聚甲醛液（覆盖所有细胞即可）固定1h，室温(或4℃过夜)，蒸馏水洗涤3

次；

9.用0.5%的油红“O”染色1h（覆盖所有细胞即可），室温；

10.放入70%的乙醇中分化至间质清晰，然后再用蒸馏水洗涤3次；

11.苏木素染液复染（覆盖所有细胞即可），1-2min，蒸馏水洗涤3次【5】；

12.染色的细胞可以用肉眼在相差显微镜下进行观察确认（为避免皿内干燥影响观察，可留

少许液体，且观察时间不宜超过15min或用甘油封盖后可长时间保存）。

三、结果

脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。

小鼠脂肪组织来源的脂肪干细胞（经成脂诱导2周后）

脂肪细胞油红O染色（X200）【6】

【1】【5】Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz

HP, Hedrick MH. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for Cell-Based therapies, Tissue Eng. 2001,7(2):211–228.

【２】【4】Yu G, Wu X, Kilroy G, Halvorsen YD, Gimble JM, Floyd ZE.

Isolation of murine adipose-derived stem cells. Methods Mol Biol. 2011;702:29-36.

【３】田玉旺，李琳，李丽，胡海. 介绍一种改良的油红O脂肪染色法，中国组织化学与细胞化学杂志，2007,16(6).