高尔基体中糖基转移酶的信号介导的动态保留

高尔基体中糖基转移酶的信号介导的动态保留

Linna Tu, William C. S. Tai,* Lu Chen, David K. Banfield†

高尔基的糖基转移酶是一种酶家族的有序的修改糖蛋白的具体方式蛋白。第二类组成，这些膜蛋白的特点是短期暴露细胞质氨基末端尾巴和一腔酶域。细胞质尾巴发挥本地化的糖基转移酶的作用，外壳蛋白复合物COPI泡介导的逆行运输也在高尔基内工作。然而，这些酶缺乏的尾巴能识别COPI序列。在这里，我们发现Vps74p绑定到在多数的酵母细胞质尾巴五聚体主题目前高尔基本地化的糖基转移酶，以及COPI。我们建议Vps74p保持稳定，高尔基州的糖基转移酶动态定位到COPI通过促进其纳入小泡。

在高尔基体的功能，作为新合成的蛋白质分拣中心和作为糖蛋白的翻译后修饰的位置。蛋白糖基化是发起的内质网（ER）。糖蛋白，然后经过由高尔基组本地化广泛的顺序糖基转移酶糖链伸长和阐述介导的。虽然他们独特的催化糖基化反应，并显示脑池的分布特点，高尔基居民糖基转移酶都是II型膜蛋白组成的短期暴露细胞质N末端（尾）组成一个单独得薄膜区，一个导向主干区域和催化结构域的腔。

Avariety的功能已确定了影响这些酶（1-3）：在跨膜区（4-8），特定区的腔面向非催化区（6,8），催化域之间的相互作用（9，10）和细胞质尾（11-13）。稳态这些酶的分布状态维持一个动态的过程，它涉及到从晚期高尔基到早期生理池的检索，以及与高尔基和内质网，于是他们过境回到池对它们的功能（14，15 ）。虽然糖基转移酶的功能，直接的一个特定的酶一池或另一稳态变化，大概外壳蛋白复合物（COPI），小泡是由其中这些酶大部分被回收（14，16的主要手段）。然而，高尔基居民糖基转移酶缺乏规范COPI在其细胞质尾巴结合基序，我们设法查明的蛋白质，可以结合这些酶的尾巴，COPI可以促进其纳入小泡。

我们确定了一个基本与高尔基删除相关的杀伤力居民圈套遗传屏幕前部抑制Vps74p（水溶性N -乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体），Sft1p，高尔基内的（17）逆行运输所需的一种蛋白质。Vps74p是一个蛋白质家族，其中包括哺乳动物蛋白GPP34（GmX33a）和GPP34R（GmX33b）（18-21）的成员。虽然VPS74删除了对酵母细胞生长无明显影响，vps74D细胞已知非分类的羧肽酶Y，这说明Vps74p参与蛋白质的运输（22）。我们注意到，vps74D缺陷细胞中的糖基（GPI）的处理锚定蛋白Gas1p。Gas1p是修改增加了N -和O -连接碳水化合物，因为它穿越途中的高尔基体与细胞表面（图1A）（23）。在酵母中的Gas1p缺乏N中所涉及的酶菌株命运的比较和Oglycosylation揭示了在缺乏的A1 ,2 - mannosyltransferase，Kre2p（图1，A和B）（24）细胞类似的加工缺陷。我们考虑到Vps74p可能需要Gas1p运输和审查功能Gas1p贩运单体的可能性，红色荧光蛋白（Gas1p - mRFP）融合蛋白在细胞缺乏Vps74p（25）。然而，Gas1p位置在vps74D细胞mRFP是无法区别的，在野生型细胞（图1c）。

像GPP34（18），Vps74p是一个外周膜蛋白（图1，D和E），因此，只会有能力直接的物理与细胞质相互作用面向N端11个氨基酸的Kre2p。我们建造了一个混合体，其中蛋白质的Kre2p的细胞质和跨膜区域融合到N -端mRFP 结束（Kre2CT - mRFP）。在野生型细胞，Kre2CT - mRFP是局部的无数小点在整个细胞质中，这部分的重叠，绿色荧光蛋白（GFP）融合到高尔基体，居民蛋

白质，Rer1p（绿色荧光蛋白- Rer1p）（图1楼）。此外，由于不Rer1p（26）和Mnn9p糖基转移酶复合物（16），高尔基体和内质网之间的Kre2CT -绿色荧光蛋白循环通过COPI建立依赖机制（图中一）。在vps74D细胞，但是，Kre2CT - mRFP是定位于液泡（图1）。这种效果是不是因为在高尔基保留一般不足驻地膜蛋白，因为绿色荧光蛋白本地化Rer1p到高尔基没有受到影响。这些调查结果是一致的为Vps74p的Kre2p在高尔基体的动态保存的作用，并确定了N -端11个氨基酸的蛋白质为保留足够的调解。

酵母基因中，尤其是在糖基化涉及被删除细胞显示减少了在场的可行性calcofluor白（连续）。细胞缺乏VPS74更为敏感，连续超过kre2D细胞（图中二），所以我们推断，Vps74p调解可能增加糖基转移酶的高尔基本地化。当VPS74从表达Mnn9 -绿色荧光蛋白，Mnn2 -绿色荧光蛋白，或Ktr6CTGFP菌株删除，这些蛋白的确非局部化，要么一泡状烟雾（Mnn9 - GFP）的，或对液泡（Mnn2 内腔- GFP和Ktr6CTGFP）（图2A）条。对齐的N端对酵母糖基转移酶家族成员细胞质尾巴暴露了一个semiconserved motif (F/L)-(L/V)-(S/T)（27）在对家庭的一些成员的（表1）细胞质尾巴。我们取代Phe4丙氨酸Leu5 - Ser6（滑膜）在Kre2p和评估的命运关于本地化的kre2这些替换（AAA6）的CT -绿色荧光蛋白，以及对突变全长蛋白的能力，kre2（AAA6），来处理Gas1p在kre2D细胞。kre2（AAA6）的CT -绿色荧光蛋白是非局部化对在野生型细胞（图2B条液泡内部），和细胞表达他们对酶的唯一来源kre2（AAA6）来自缺乏KRE2基因在细胞的功能相同的不能完全处理Gas1p （图2C型）。我们建议，在Gas1p加工缺陷有关的图的不稳定。1。Vps74p 是需要Kre2p在高尔基保留。（甲）的位置和顺序的糖基转移酶在Gas1p参与行动加工（29）。（乙）vps74D细胞缺陷类似Gas1p处理缺陷缺乏Kre2p 细胞。相对位置完全处理，糖化Gas1p（mGas1p）和急诊室驻留Gas1p前体形式（pGas1p）的说明。（c）运输的Gas1p - mRFP到细胞表面，在vps74D 细胞不受影响。比例尺，5毫米。（四）Vps74p结合膜。全细胞提取物（WCEs）遭到了离心连续弹一点三零零万克（13K）和10万克（10万）和颗粒（P）和上清液（S）的受SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE电泳）和染色。（五）Vps74p是一个外周膜蛋白。酵母WCEs提取裂解液与单（磅）或1％海卫X100（Tx100），0.1M的碳酸钠pH值11.5（pH值），或1 M氯化钠（盐）在裂解液。（六）Kre2CT - mRFP而不是绿色荧光蛋白，Rer1p是非局部化在vps74D细胞液泡流明。有关的试剂和方法的详细说明使用，见（24）。DIC的，微分干涉对比。Kre2p在缺乏Vps74p细胞。事实上，Kre2p明显减少丰富vps74D细胞，以及kre2丰富的野生型细胞非常相似vps74D细胞（图二维）到Kre2p的（AAA6）。此外，Gas1p处理kre2D细胞表达N -末端Kre2p杂交产生的蛋白质含有类似图案滑膜糖基转移酶[同Anp1异常（表1）]是从野生型细胞（图3a 区分）。进一步的证据表明，类似主题的财务和后勤系统是很重要的识别获得由Vps74p从酵母双杂交实验，其中野生型或滑膜丙氨酸取代胞质尾的Kre2p [kre2C3（AAA6）]是用来评估Vps74p约束力。虽然Vps74p是能够绑定到野生型的Kre2p胞质尾序列，发现没有互动和kre2C3之间Vps74p（AAA6）（图3B）款。Vps74p直接绑定的Kre2p胞质尾，和FLS主题替换减少约束力（图3C 和图。三）。

该Anp1-Kre2混合蛋白恢复Gas1p加工kre2D细胞（图3a）的无力令人费解，因此我们认为有可能承认的Vps74p glycosyltransferas中，除了滑膜样主