微生物检验技术知识点

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂在平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数,根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
菌落形成单位cfu，colony-forming unit。
I类危害：老人和婴幼儿食品及在食用前可能会增加危害的食品;
Ⅱ类危害：立即食用的食品，在食用前危害基本不变;
Ⅲ类危害：食用前经加热处理,危害减小的食品。
将检验指标对食品卫生的重要程度分成一般、中等和严重3档。
根据以上危害度的分类，又将取样方案分成二级法和三级法。
二级法：设定取样数n,指标值m,超过指标值m的样品数为C,只要C>0,就判定整批产品不合格。
2、样品送检时：必须认真填写送检申请单，以供检验人员参考。
3、送检过程：要注意防污染、防散漏、防变质。
4、检验人员接到送检单后应立即登记,填写序号,并按检验要求,立即将样品放入冰箱或冰盒中,并积极准备条件进行检验。
5、食品微生物检验室必须备有专用冰箱存放样品一般阳性样品发出报告后3d(特殊情况可适当延长)方能处理样品;进口食品的阳性样品,需保存6个月方能处理;阴性样品可及时处理。
(3)车间空气采样。直接降尘法。将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部,打开平皿盖5min,然后盖盖送检。
样品的送检要求
1、采集好的样品应及时送到食品微生物检验室：要快速运送，不要超过3小时；易变质的样品要冷藏，若路途遥远，无需冷冻样品可保持在1~5℃低温下运送；需保持冷冻状态的样品，可保存在泡沫塑料隔热箱，维持0℃。
一般采用100克或100毫升食品中的大肠菌群最可能数（MPN）来表示。
国标测定方法：乳糖九管发酵法。不仅表明样品中有无粪便污染，另方面还可根据数量的多少，判定样品受污染的程度
三级法：设定取样数n,指标值m,附加指标值M,介于m与M之间的样品数C。只要有一个样品值超过M或C规定的数就判整批产品不合格。
②美国FDA的取样方案
食品药品管理局(FDA)的取样方案与ICMSF的取样方案基本一致，所不同的是严重指标所取的15、30、60个样可以分别混合，混合的样品量最大不超过375g。也就是说所取的样品每个为100g，从中取出25g，然后将15个25g混合成一个375g样品，混匀后再取25g作为试样检验，剩余样品妥善保存备用。
第二章
第一节微生物检验的基本程序
1检验前的准备2样品的采集3样品的送检4样品的处理方法
5致病菌检验参考菌群的选择6样品的检验7检验结果的报告
检验前的准备
1.准备好所需的各种仪器：如冰箱、恒温培养箱、显微镜等
2.按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。
3.准备好实验所需的各种试剂、药品，制备好普通营养琼脂或其他选择性培养基。根据需要分装试管或灭菌后倾注平板或保存在46℃的水浴中或保存在4℃的冰箱中备用。
3.固体食品：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位割取,割取时应兼顾表面与深部,注意样品的代表性;小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品,放入无菌容器。若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。
4.冷冻食品：大包装小块冷冻食品按小块个体采取;大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冻块上举取样品,也可以用无菌钻头钻取碎屑状样品,放入容器。固体食品和冷冻食品的取样还应注意检验目的,若需检验食品污染情况,可取表层样品;若需检验其品质情况,应取深部样品。
3）微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒、人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。
6微生物检验的范围与对象：
•微生物检验<>范围
1.生产环境的检验：车间用水、空气、地面、墙壁等。
2.各种产品的原、辅料检验：包括食用动物、谷物、添加剂等一切原辅材料。
1.菌落总数：菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后所得1g或1mL检样中所含细菌菌落的总数。
2.大肠菌群：大肠菌群是寄居于人及温血动物肠道内的肠居菌，它随着的大便排出体外。食品中如果大肠菌群数越多，说明食品受粪便污染的程度越大。
3.致病菌：致病菌既能够引起人们发病的细菌。对不同的食品和不同的场
(1)车间用水。自来水样从车间各水龙头上采取冷却水;汤料等从车间容器不同部位用100mL无菌注射器抽取。
(2)车间台面、用具及加工人员手的卫生监测。用5cm2孔无菌采样板及5支无菌棉签擦拭25cm2面积。若所采表面干燥,则用无菌稀释液润湿棉签后擦拭;若表面有水,则用干棉签擦拭,擦拭后立即将棉签头用无菌剪刀剪入盛样容器。
5胃蠕动均质法：这是国外使用的一种新型的均质样品的方法。
将一定量的样品和稀释液放入无菌均质袋中,开机均质。均质器有一个长方形金属盒,其旁安有金属叶板,可打击均质袋,金属叶板由一恒速马达带动,作前后移动而撞碎样品
（三）冷冻样品
冷冻样品，先将中样在0~4℃下解冻，时间不能超过18h，或在45℃下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。
4、微生物对产品的污染：对产品造成污染的微生物来源：土壤、空气、水、人和动植物、生产原料、生产器械及包装材料等
5微生物检验的意义：
1）是衡量动植物性产品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检产品能否食用的科学依据之一。
2）通过微生物检验，可以判断产品加工环境及产品卫生环境，能够对产品被微生物污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。
样品的预处理方法
(一)液体样品的处理
1瓶装液体样品的处理
用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用无菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。
2盒装或软塑料包装样品的处理
将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用无菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。
1微生物：是一群形体细小、结构简单、人肉眼看不见，必须借助于光学显微镜、电子显微镜放大几百倍、几千倍甚至几万倍才能看到的生物。
2微生物的种类：原核细胞型：细菌、放线菌、螺旋体、立克次氏体、支原体、衣原体；
•真核细胞型：酵母菌、霉菌、微藻类等；
•非细胞型：病毒、亚病毒（类病毒、拟病毒、朊病毒）。
3病源微生物：感染人、动植物，导致疾病发生的有害微生物，称之为病原微生物。
3研磨法：将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。
4整粒振摇法：完整自然保护膜的颗粒状样品(如蒜瓣、青豆等)
直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和适量直径5mm左右玻璃珠的无菌稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。
（二）固体样品的处理
1.捣碎均质法：将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。是对大部分食品样品都适用的办法。
2剪碎振摇法：将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和适量直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。
致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等。致病微生物在食品中是绝对不允许存在的，所以快速检测食品中是否存在有致病微生物，是食品安全检验的重中之重。
食品微生物检验<>指标
我国卫生部颁布的食品微生物<>指标有菌落总数,大肠菌群和致病菌三项。
检验样品：
食品生产环境如水、空气、土壤样品;生产各工序样品如设备、管道;
各类食品发生食物中毒时的样品
微生物检验的取样方案
1ICMSF取样方案；2美国FDA的取样方案；
3世界粮农组织（FAO）取样方案；4我国的食品取样方案。
①ICMSF取样方案
国际食品微生物规范委员会(简称ICMSF)的取样方案是依据事先给食品进行的危害程度划分来确定的。将所有食品分成3种危害度:
微生物检验常规技术包括显微技术染色技术灭菌和消毒技术培养基制备技术接种分离纯化和培养技术无菌取样技术微生物的计数技术菌种保藏技术微生物常规鉴定技术等平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后其中的微生物充分分散成单个细胞取一定量的稀释样液涂在平板上经过培养由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞
疏水网膜法(HGMF)：采用疏水网膜过滤样品，将捕获了被检微生物的疏水网膜上倾入适当的琼脂，经一定时间培养后即可计数
直接荧光过滤膜技术(DEFT)：将样品经特殊滤膜过滤后，经吖啶橙染色，利用紫外线显微镜来快速测定活菌数。
葡萄糖苷酶荧光法：通过在培养基中加入指示剂、色素、荧光物质，成为快速检验大肠菌群的常用方法。
菌落总数：
因微生物的生活特性各异，不可能在一种培养条件下全部生长，故检出的菌落数小于细菌总数，但仍可评定食品的污染程度，是常用方法。
菌落总数的食品卫生学意义：
作为食品被污染程度的指标，反映食品的新鲜程度；
预测食品的存放期限程度：食品生产过程中变质与否、食品生产过程中食品的一般卫生状况。
大肠菌群
食品中大肠菌群的数量测定：
3.小样，又称检样，做分析用的，一般为25g
采样的步骤：
采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样→样品封存→开具采样证明