病毒中和抗体检测0001

病毒中和抗体检测

1.病毒TCID50检测

TCID50是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。它有几个性质我们必须明白：1）它表示

的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于1,实际上问它的值等于多少是一个

没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说岀的的值等于多少，那我们只能说

它的值在任何情况下都等于1。理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经

常被误解，所以导致对TCID50的理解岀现偏差。

首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml 。它表示的是每ml病

毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为 4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5

个mol的氯化钠是一样的道理。经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10xx。这个说法是不

科学的，应该说我这个溶液里含有10x.x个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是

10xx TCID50/ml。也可以说病毒的TCID50效价是10-x.x。

TCID50=10A5.64/0.1ml。即：将病毒悬液作10A5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50%

的细胞产生CPE。（将病毒悬液作10A5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时

（如中和试验），一般常用100TCID50/0.1ml 或者100TCID50/0.05ml ）

本方法的优缺点：①.优点：岀现阳性结果时间较短，且较明显；②.缺点：有时候，在用枪头吸岀细胞生长液时，容易岀现污染；

使用本方法时的注意事项：①.稀释病毒时，每做一个病毒稀释度都需要换枪头，减少浓度误差②.96孔板，每孔接种的细胞量：一般在此种测定病毒滴度的方法下，要将细胞密度适当调低，至少要比正常传代时低一些，否则细胞生长速度过快，未到7天则细胞岀现死亡対观察CPE不利.一般情况下，小塑料瓶（8-9ml液体为正常用量）,培养长慢单层后，消化细胞，加入6ml培养液，吹匀，吸岀其中的2ml,到另外的瓶子，在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心，可以用显微镜看一下，细胞数过多则补加培养液，少则补加剩余4ml的细胞悬液；

维持液，即病毒培养液，配方为：①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHC03;

②.MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS（小牛血清）.我个人曾经做过实验，在状态很好的细胞上接种病毒，分别使用两种不同的维持液，最终结果是一样的，没有什么不同，所以可以根据个人需要进行选择.另外，曾经请教过专门做中和实验的老师，他认为适当的FBS对细胞有保护作用，而且他说这是国外文献上的报道.

1 ）细胞准备

1.1检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶-EDTA轻微冲洗

1.2加入4—5ml胰酶—EDTA以覆盖单层细胞

1.3放平培养瓶，37 C 5% CO2培养箱中孵育10 —20min，直到细胞脱落

1.4加入5—10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中

1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min ）

1.6以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数

1.7以D-MEM将将细胞浓度调整到1 X10A5/ml --1.5 10A5/ml

1.8在微量培养板的各孔中加入100卩细胞,相当于？X10A4细胞/孔

1.9在37 T 5 % CO2培养箱中过夜培养（18 —22h ），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定

2）病毒制备

3）病毒稀释

3.1取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM）稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。（于1.5ML EP管中进行，将混合液充分吹打振荡，很重要！）

3.2做10倍稀释

3.3在另一新1.5ML EP管中加入100卩第一管稀释病毒液（1/10 ），按10的比例进行倍比稀释，再加入900卩稀释液，将混合液充分吹打振荡。以此类推共稀释至

10X3倍。

此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）

4）病毒接种：

4.1取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取

孵育液或无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。

4.2于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。（病毒稀释度的选择10A3 —10X2或者10A4 —10A13,因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有人用的稀释度是10A6 —10A13）

4.3第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中加入100ul含5%胎牛血清的DMEM，监测细胞存活情况；切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次, 计算标准差。

4.4 37C CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200山继续于37C, 5% CO2培养5--10天；

4.5逐日观察，5--10天后倒置显微镜下观察，计算每一列中出现CP（cytopathic effects，CPES的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较；

4.6如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本试验即为有效；

4.7计算每一列中出现阳性的孔数；

4.8 用Reed-MuencK计算病毒TCID50/ml。