病毒中和抗体检测0001

病毒中和抗体检测1.病毒TCID50检测TCID50是指组织培养物（细胞）半数致死剂量。

它有几个性质我们必须明白：1）它表示的是计量，不是浓度；2）它是一个单位；3）它的值等于1,实际上问它的值等于多少是一个没有意义的问题，就像问km的值等于多少一样，如果非要说岀的的值等于多少，那我们只能说它的值在任何情况下都等于1。

理解这三个性质对于理解TCID50非常重要，但是这三个性质经常被误解，所以导致对TCID50的理解岀现偏差。

首先我们来看一下这个表示法的意思：病毒滴度为108.2TCID50/ml 。

它表示的是每ml病毒溶液里含有108.2个TCID50的病毒，这和氯化钠的浓度为 4.5mol/L表示每L溶液中含有4.5个mol的氯化钠是一样的道理。

经常可以听到人说我的病毒的TCID50是10xx。

这个说法是不科学的，应该说我这个溶液里含有10x.x个TCID50的病毒或者说我这个溶液的病毒滴度是10xx TCID50/ml。

也可以说病毒的TCID50效价是10-x.x。

TCID50=10A5.64/0.1ml。

即：将病毒悬液作10A5.64稀释后，接种细胞0.1ml，可以使50%的细胞产生CPE。

（将病毒悬液作10A5.64稀释后，0.1ml中含1个TCID50，作其他一些实验时（如中和试验），一般常用100TCID50/0.1ml 或者100TCID50/0.05ml ）本方法的优缺点：①.优点：岀现阳性结果时间较短，且较明显；②.缺点：有时候，在用枪头吸岀细胞生长液时，容易岀现污染；使用本方法时的注意事项：①.稀释病毒时，每做一个病毒稀释度都需要换枪头，减少浓度误差②.96孔板，每孔接种的细胞量：一般在此种测定病毒滴度的方法下，要将细胞密度适当调低，至少要比正常传代时低一些，否则细胞生长速度过快，未到7天则细胞岀现死亡対观察CPE不利.一般情况下，小塑料瓶（8-9ml液体为正常用量）,培养长慢单层后，消化细胞，加入6ml培养液，吹匀，吸岀其中的2ml,到另外的瓶子，在该瓶中加入14-16ml即可,如果不放心，可以用显微镜看一下，细胞数过多则补加培养液，少则补加剩余4ml的细胞悬液；维持液，即病毒培养液，配方为：①.MEM+2%小牛血清+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHC03;②.MEM+3%谷氨酰胺+1%双抗+NaHCO3;两种维持液的不同在于是否有FBS（小牛血清）.我个人曾经做过实验，在状态很好的细胞上接种病毒，分别使用两种不同的维持液，最终结果是一样的，没有什么不同，所以可以根据个人需要进行选择.另外，曾经请教过专门做中和实验的老师，他认为适当的FBS对细胞有保护作用，而且他说这是国外文献上的报道.1 ）细胞准备1.1检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶-EDTA轻微冲洗1.2加入4—5ml胰酶—EDTA以覆盖单层细胞1.3放平培养瓶，37 C 5% CO2培养箱中孵育10 —20min，直到细胞脱落1.4加入5—10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中1.5 以PBS洗细胞两次（12000rpm, 5min ）1.6以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数1.7以D-MEM将将细胞浓度调整到1 X10A5/ml --1.5 10A5/ml1.8在微量培养板的各孔中加入100卩细胞,相当于？X10A4细胞/孔1.9在37 T 5 % CO2培养箱中过夜培养（18 —22h ），用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定2）病毒制备3）病毒稀释3.1取冻存的病毒，以病毒生长培养液（VGM）稀释10倍，即100微升病毒液+900微升稀释液，共1毫升。

（于1.5ML EP管中进行，将混合液充分吹打振荡，很重要！）3.2做10倍稀释3.3在另一新1.5ML EP管中加入100卩第一管稀释病毒液（1/10 ），按10的比例进行倍比稀释，再加入900卩稀释液，将混合液充分吹打振荡。

以此类推共稀释至10X3倍。

此过程中需要使用加样器和tip头。

使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min，确保无菌。

使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）4）病毒接种：4.1取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液或无血清DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。

4.2于各孔中加100ul各不同的病毒稀释液，每个稀释度做一列孔，即每个病毒稀释度做8个平行复孔，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度到原液加样。

（病毒稀释度的选择10A3 —10X2或者10A4 —10A13,因为目的基因不同，重组腺病毒滴度差距很大，应该尽量将稀释度加大，看到有人用的稀释度是10A6 —10A13）4.3第11列和12列为阴性对照，阴性对照孔中加入100ul含5%胎牛血清的DMEM，监测细胞存活情况；切记：设置正常的细胞对照。

每次实验要重复4次, 计算标准差。

4.4 37C CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入维持液200山继续于37C, 5% CO2培养5--10天；4.5逐日观察，5--10天后倒置显微镜下观察，计算每一列中出现CP（cytopathic effects，CPES的孔数。

只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较；4.6如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本试验即为有效；4.7计算每一列中出现阳性的孔数；4.8 用Reed-MuencK计算病毒TCID50/ml。

（1）计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）（2）计算阳性和阴性孔的累积数。

阳性孔累积数由下向上累计（3）;阴性孔累积数由上向下累计（4）⑶计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/〔（3）+（4）〕，（6）=（5）x 100⑷计算距离比例（PD =（大于50%勺阳性百分比一50）/ （大于50%勺阳性百分比一小于50%勺阳性百分比TCID50的对数=大于50%勺阳性百分比的最高稀释对数+距离比例X稀释系数的对数（稀释系数的对数1:10稀释为1,半对数稀释为0.5，倍比稀释为0.3 , 1:5稀释为0.7举例计算：TCID5。

的测定和计算（Reed-Muench法）出现细胞病变（CPE以及血凝素等的细胞管数分别列于表14-2的第二和第三列它们的累计数分别列于第四和第五列（根据箭头所示方向），第六列为细胞管总数,第七列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。

可见该病毒株的TCID50在10-3（91.6 %）和10-4（40%）之间，其确切稀释倍数可按下列公式计算：91.6 （高于50%的百分数）-5091.6 （高于50%的百分数）-40 （低于50%的百分数）=41.6/51.6 = 0.8将由上式获得0.8加在高于50溉亡的稀释度的对数（3）上,因此该病毒的TCID5。

-3.8应是0.1ml 10 稀释的病毒液。

查反对数得6310,即该病毒6310倍稀释液0.1ml 等于1 个TCID502.中和实验1) 细胞准备1.1检查培养瓶中的单层细胞，以5ml胰酶-EDTA轻微冲洗1.2加入4—5ml胰酶—EDTA以覆盖单层细胞1.3放平培养瓶，37 C 5% CO2培养箱中孵育10 —20min，直到细胞脱落1.4加入5—10ml培养液，洗下细胞后移到离心管中1.5 以PBS洗细胞两次(12000rpm, 5min )1.6以D-MEM重悬细胞，并用血球计数板计数1.7以D-MEM将将细胞浓度调整到1 X10A5/ml --1.5 10<^5/ml1.8在微量培养板的各孔中加入100卩细胞,相当于？X10A4细胞/孔1.9在37 C 5 % CO2培养箱中过夜培养(18 —22h )，用处于生长相刚达到完全融合的细胞进行病毒的滴定2) 待测血清准备2.1动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。

为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。

各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60 C；水牛、狗及地鼠血清为62 C；马兔血清为65 C；人和豚鼠血清为56C。

加热时间为20-30min，60 C以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。

2.2 取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，或者按1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280 稀释，每个稀释度做3-4个平行孔。

3) 加入病毒,感作3.1 以VGM 将病毒稀释到100 TCID50/50 卩l (200 TCID50/100 卩)3.2除细胞对照孔外每孔中加入与血清量相等的病毒液，在细胞对照孔中加入与血清量相等的VGM3.3轻混病毒—血清混和物，37 T 5 % CO2培养箱中孵育2h4) 接种细胞4.1准备用于接种的刚达到完全融合的细胞的培养板，吸掉培养液，加入350卩1无血清D-MEM培养液以洗掉剩下的FBS4.2病毒—血清混和物孵育2h结束后，各取100卩中和液到细胞培养板相应的孔中4.3 37 T 5 % CO2培养箱中孵育2h4.4吸掉中和液，力卩250卩l DMEM洗涤4.5加200卩l EMEM在37 C 5 % CO2培养箱中孵育3 —4d，检测培养液中血凝活性，以能保护50 %细胞培养管不被感染的最高血清稀释度的倒数作为中和终点。

在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100卩细胞悬液。

置5%CO2 37 C温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，14D终判。

由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。

5）对照组对照的设定：包括细胞对照（培养液中仅含细胞，不含病毒和血清），阴性对照（培养液中含有I00TCID50病毒、细胞及阴性血清）和空白对照（培养基中含有100TCID50病毒及细胞，不含血清），各设3个平行孔。

为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时，尤为重要。

阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。

病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆，先将病毒作0.1、1、10、100、1000 TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50卩。