方法学验证中各项指标的深度剖析-谢沐风
学习谢沐风-溶出度
药剂学分类系统与溶出度试验的关系
申请豁免生物等效性试验，还应考虑： 该制剂中的辅料量与主药量相比，不能过大； 且辅料中不能加入表面活性剂； 活性成分应为宽治疗指数药物； 同一制剂不同规格的速释制剂； 对于第二至第四类药物，在研究了溶出度试验基础 之上，一般均应考虑在质量标准中拟定溶出度检查 项。
溶出介质的选用与配制
建议采用多条溶出曲线对产品的内在品质进行评价。选取原则如下： 【普通制剂】 (1)酸性药物制剂 pH值分别为1.0或1.2、5.5～6.5、6.8～7.5和水； (2)中性或碱性药物/包衣制剂 pH值分别为1.0或1.2、3.0～5.0、6.8和 水； (3)难溶性药物制剂 pH值分别为1.0或1.2、4.0～4.5、6.8和水； (4)肠溶制剂 pH值分别为1.0或1.2、6.0、6.8和水； ； 【调释制剂】 pH值分别为1.0或1.2、3.0～5.0、6.8～7.5和水。 无论何种制剂都不建议采用pH8.0以上的介质进行表达。如确有必要，应 提供充足的理由。 选择依据：参比制剂在规定的时间内平均溶出率均可达85％以上时，则 选取溶出速率最慢的介质。参比制剂在规定的时间内平均溶出率均达不 到85％，则选择溶出速率最快的介质
高溶解性药物：最高剂量规格的制剂能在pH值1.0～ 8.0的250ml或更少体积的水溶液中溶解的药物。 高渗透性药物：是指绝对生物利用度超过85%的药物。 当根据质量平衡测定方法或者与静脉对照剂量相比 ，药物的人体吸收程度为85%或更高时，这样的活性 药物成分被认为具有高渗透性。BCS指南最初建议将 吸收值≥90%作为高渗透性药物分类的判定条件。然 而，后来的科学研究和论文建议将高渗透性活性药 物成分的吸收值判断标准放宽到85%。
溶出介质的选用与配制
难溶性药物制剂如何确定表面活性剂的用量： 例如：吐温-80的浓度应从0.01％、0.1%、0.5%和 1.0%(w/v)依次递增。增加时在任何一个介质中，参 比制剂在规定的时间内平均溶出率达85％以上，则 设定该介质中的吐温-80浓度作为溶出度试验研究用 最低浓度。而如果递增至最高浓度时，参比制剂在 规定时间内平均溶出率均仍达不到85％，则设定溶 出速率最快介质中的吐温-80浓度作为溶出度试验研 究用浓度。
方法学验证中各项指标的深度剖析2015讲解
质量标准中制订有关物质的原则
● 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定， 如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。
● 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧 氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟 定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照 射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与 主峰的分离度应符合规定。
四、检测限
● 信噪比的三倍 —— 纯属“纸上谈兵”， 实际测定中根本用不上。 ● 是相对值，不是绝对值。是相对于供试品 溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在 5000倍以上。
有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系
浓 度 进样量 绝对值 相对于样品测定浓度的
最大进样量 50mg/ml 以上 20μl
入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品 中有可能存在的状态。
介绍配制方法 —— 先配制杂质贮 备液，再用供试品溶液（或浓的对照 品溶液）来稀释，简便、易行！
存在问题 —— 配制相同浓度，测定 样品时，主成分峰骤然加大，将杂质 峰覆盖。
强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环境 条件下产生的杂质，在所建立的色谱 条件下是否能够分离、测定。
方法学认证中溶液稳定性的全面判定 不能单从主成分入手！ 还要注意所有组分的百分比变化，
绝对值变化！
流速、柱温与溶剂的选择
● 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些， 且使主成分峰不拖尾即可。
● 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚 显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。
● 溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性 来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保 证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
强力破坏试验
● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 ● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 在90℃放置24小时。 ● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高 温下破坏至外观性状改变 ● 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。
方法学验证的7个技术指标详解
方法学验证的7个技术指标详解我们平时做了理化分析，出来数据后如何对这场实验进行评估？评估的结果有哪几个维度？这就包括准确度、精密度、线性、检测限和定量限、特异性、耐变性、不确定度。
今天小编就和大家一起复习一下，深度理解了这几个技术指标，不仅对实验有了整体把握，写学术论文也不再是难题。
一、准确度准确度是反映方法系统误差和随机误差的综合指标。
检验准确度可参考以下3个维度：1、使用标准参考物质进行分析测定，比较测定值与保证值，其绝对误差或相对误差应符合方法规定的要求。
通常应完成1~2个浓度水平的有证标准物质的测定，每个浓度水平要求采用至少6份同样的标准物质进行测定，计算测定结果的平均值、标准偏差与相对标准偏差。
准确度（％）=平均检测浓度／标示浓度×100%2、在没有有证标准物质情况下，应在样品基质中添加分析物测定回收率。
应至少选择3个添加浓度，并且包含一定的浓度范围，定量限或靠近定量限的浓度为必选浓度，如果样品具有容许限，该容许限也是必选浓度。
每个浓度水平至少平行测定6次，计算测量结果的平均值、标准偏差与相对标准偏差。
对于元素分析，回收率指标应在90％～110％之间。
回收率（％）=（加标试样测定值一试样测定值）／添加浓度×100%3、对同一样品用不同原理的分析方法测试比对。
不同待测物浓度范围内回收率要求不同。
二、精密度精密度是指在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。
精密度包括方法重复性和方法重现性两个分指标。
重复性：是在重复性条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。
重复性条件是指在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间内对同一被测对象取得相互独立测试结果的条件。
重复性表征了该方法实验室内的精密度。
制定的标准方法必须进行方法的精密度试验，以考察其是否精确可靠。
重复性试验过程中，选择3个不同浓度水平样品，每个浓度水平至少6次平行测定，计算出平均值、标准偏差和相对标准偏差，其相对标准偏差应符合表2要求。
方法学验证中各项指标的深度剖析-
一、线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ， 50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～ 120%间选取5个点即可。
杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限 度为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
130
120
91708 5.923 0.86
110
100
90
80
70
60
0
2
4
6
10432888 8.410 98.16
160
150
140
130
120
110
59185 14.626 0.56
100
90
80
70
60
8
10
12
14
16
18
20
22
24
m in
时间(h) 0 0.5 1 1.5 2 3
RSD
● 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须 在同一斜率、峰宽下进行积分计算。
● 供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结 果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂 移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质 峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大， 又将反映不出杂质情况。
方法学认证中的耐受性试验 是指更换试验因素，如不同人员、 不同仪器，不同色谱柱型号、厂家， 不同试剂等因素。这一点才是真正至 关重要的！认证时不可能做到这一点， 出现问题时往往要考虑到。
四、检测限
● 信噪比的三倍 —— 纯属“纸上谈兵”， 实际测定中根本用不上。 ● 是相对值，不是绝对值。是相对于供试品 溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在 5000倍以上。
仿制药想说爱你不容易-上海市药品检验所谢沐风
疗 效 的 优 劣 制 剂 的 优 劣
关键、核心
体内生物利用度的差异
体外溶出曲线的不同
通过讲述厨房、碗筷和馒头的关系来阐述 ——
(1) “GMP”很大程度上讲，是对硬件的要求，与“溶出度试 验关系不大！ (2) “溶出”是专业知识、专业技术的比拼，是属于纯“软件” 范畴的。“GMP”是属于纯“硬件”范畴的！ (3) “后GMP时代”我们做些什么？ (4) “认证” —— 就是发达国家套在非发达国家身上的枷 锁！！！
本人工作感悟
● 工作中一定要注重思考，带着问题去学习、有的放矢地 去攻读，多观察、多领会，日积月累、潜移默化之中就会水 到渠成、瓜熟蒂落！ ● 思维要开放、活跃，不要固步自封、按部就班，因循守 旧。讲述研究生期间，聆听学校大师级老师谆谆教诲的感 悟！ ● 一定要不断思考，注意查询文献，收集各方面信息，培 养自身的专业素养与专业敏感度，不要怕遇到问题，越是遇 到问题、将其解决，就越能不断提高与进步。
溶出度检测技术在仿制药研发中的重要意义
？ 如何提高BE试验成功率？ (1) 体外（多条溶出曲线）一致、体内多数情况一致。 (2) 体外不一致、体内多数情况下不一致。 (3) BE试验成功、体内一致，并不意味着仿制制剂临 床疗效就一定与原研制剂相当。 (4) BE试验失败、体内不一致，肯定会在体外某个溶 出度试验条件下找到两者间显著性差异的情况。
仿制药研发思路与理念
4、设计多处方、优化处方，尽可能地使体外多条溶出曲线 与原研制剂产品一致，并注意生产规模。 5、随即抽取工艺放大后的样品与原研制剂产品一并进行生 物等效性试验。 6、如失败，寻找体外溶出度差异，是肯定可以找到（如找 不到，讲述美国药典之所以罗列七个方法的原因所在与河南 天方药业的实例）。 7、在该具有差异的体外溶出度条件下，再次予以深入研 发，直至该差异消除，同时验证其他条件下溶出曲线的一致 性，皆为良好时、再次进行BE试验。
谢沐风老师关于溶出问答精选
谢沐风老师关于溶出问答精选问题一：1. 在15min内完全溶出的药物需要做溶出曲线吗？2. 如果参比制剂在0.1mol/l盐酸中很容易分解，还需要对酸性介质进行研究嘛？3做溶出介质的目的主要是选择最佳的溶出介质还是模拟体内，考察样品的溶解情况？4. 溶出度研究，做6粒行不行？谢老师：1 需要。
但仅做5、10、15和30分钟即可，因15分钟和30分钟已至平台区。
2 在测定原料药在各溶出介质中的溶解度和稳定性时，如发现在某一介质中不稳定，可依据不稳定性程度（即降解速率），酌情考虑测定办法，如：立即进样；使主成分全部转变成该“物质”后测定含量，再推导出主成分溶出量（需知两者的转换系数）；通过HPLC法将两者分离，分别测定。
将“转变物”换算成主成分，最后仍以主成分计算出溶出量。
3 测定溶出曲线有很多作用和目的，不仅是为了建立体内外相关性，更为重要的是采用这样一种手段来“剖析”和“肢解”固体制剂内在品质！4 众多法规上均要求做12粒，是从统计学角度出发，当生产规模达几十万片、甚至几百万片时的考虑。
而就目前国内实际生产情况，无论是在研发阶段和质量评估阶段皆可采用6片，其测定数据已基本被认为具有代表性了。
问题二：复方制剂，其中一个API为酸性（pKa 4.5-6.0），另一个API的pKa 6.5-8.5，是分别制粒后压制成片剂，请问它们应该做哪些溶出介质呢？谢老师：你好！很高兴看到你的提问。
建议如下：(1) 首先分别进行两物质在不同溶出介质的溶解度测定，观测pH值-溶解度曲线图在纵坐标4.5~8.0间的情况（是否较为“陡峭”）。
(2) 如平坦、采用通常的四种介质进行研究皆可；如陡峭，建议增加“在4.5~8.0间，每隔0.5间隔”的多溶出介质研究，然后根据实际测定情况，拟定质量标准中的溶出介质。
问题三：有个问题请教，看到你写的“溶出曲线的测定与比较”中关于计算时间点的确定，说调释制剂溶出率80%以上的时间点应不多于一个，调释制剂选择溶出率相近的4-6个时间点计算。
谢沐风No.5 药学研究主要信息汇总表(深度剖析)
注：本信息汇总表与国食药监注[2010]387号文中附件中的CTD格式申报主要研究信息汇总表略有不同。
本汇总表适用于已经按照《药品注册管理办法》附件2提交申报资料的品种。
为了提高审评效率，请注册申请人按本汇总表的要求重新整理研究信息并电子提交。
【个人体会】(1) CDE愈发强调研发过程与方法制订根据。
(2) 要明确质量标准为什么这么订？而非制订后的单纯检测。
仿制药药学研究主要信息汇总表原料药2.3.S.1 基本信息2.3.S.1.1药品名称原料药的中英文通用名、化学名2.3.S.1.2 结构原料药的结构式、分子式、分子量2.3.S.1.3 理化性质原料药的主要物理和化学性质：性状(如外观，颜色，物理状态)；熔点或沸点；比旋度，溶解性，溶液pH, 分配系数，解离常数，将用于制剂生产的物理形态（如多晶型、溶剂化物、或水合物），生物学活性等。
2.3.S.2 生产信息2.3.S.2.1生产商生产商的名称（一定要写全称，与公章名称一致）、地址以及生产场所的地址。
2.3.S.2.2 生产工艺和过程控制（1）工艺流程图/反应方程式：此处可仅提供反应方程式，标明各步反应的工艺参数、收率、所用溶剂和反应试剂。
注明信息来源的申报资料编号和页码。
（2）工艺描述：按反应路线简述各步反应的反应类型（氧化、还原、取代、缩合、烃化、酰化等），各步反应的原料、试剂、溶剂和产物的名称，终产物的精制方法和粒度控制等；特殊的反应条件（如高温、高压、深冷等）应说明。
按工艺流程来描述工艺操作，以注册批为代表，列明各反应物料的投料量及各步收率范围。
注明信息来源的申报资料编号和页码。
（3）生产设备：提供主要和特殊设备的型号及技术参数。
注明信息来源的申报资料编号和页码。
（4）大生产的拟定批量：kg（g）/批。
2.3.S.2.3 物料控制提供生产用起始物料和重要物料的质量控制信息（包括来源/生产商信息、质量标准等）。
注明信息来源的申报资料编号和页码。
方法学验证中各项指标的深度剖析-谢沐风讲解
强力破坏试验
● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 ● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 在90℃放置24小时。 ● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高 温下破坏至外观性状改变 ● 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。
发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。
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质量标准中制订有关物质的原则 ● 采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨
基酚等。 ● 采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在
HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm） 照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规 定。 ● 不采用任何方式。
在100％浓度的主成分溶液中加 入1%浓度的杂质对照品，以模拟样 品中有可能存在的状态。
介绍配制方法 —— 先配制杂质 贮备液，再用供试品溶液（或浓的对 照品溶液）来稀释，简便、易行！
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专属性试验验证图谱
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存在问题 —— 配制相同浓度， 测定样品时，主成分峰骤然加大， 将杂质峰覆盖。
强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环 境条件下产生的杂质，在所建立的 色谱条件下是否能够分离、测定。
柺 愊 曐 帩 帪 娫 柺 愊 %
1 4 0
1 3 0
1 2 0
1 1 0
1 0 0
9 0
8 0
7 0
6 0 0
2
对溶出度试验的深度解读-引申至“仿制药质量一致性评价技术手段—谢沐风201604
那么，原研制剂什么样的溶出曲线才是 (1)有区分力、(2)有体内外相关性呢？ 如去验证，对于仿制药企业可能会劳民伤 财。为此，根据最具制剂难度的五大类药物，
本人给出直截了当的曲线形态，这些溶出曲
线均是针对大量已上市的此类原研制剂和本
人在日本学习体会的经验总结所得。
这些曲线就已包括以上2点！
BCS分类与体外溶出的关系
、“映射”与“载体”。
原研制剂所具有的多条特征溶出曲线 ★ 是该品种的 “指纹图谱” 。 ★ 是原研制剂的“一根筋”！将其提炼出 来、仿制制剂研发便可做到“知己知 彼、百战不殆”、并具有事半功倍效果。 通过体外溶出行为一致性的追求，可使 仿制制剂品质无限趋近原研制剂，从 而实现临床上的全面替代、而非山寨。
谢沐风 上海市食品药品检验所 xiemufeng@
(1) 请将手机调至“振动”档！(包括闹
钟、叫醒、工作安排、约会等)，谢谢 您的配合！
(2) 请勿交头接耳，请保持会场安静。 (3) 无需拍照，会后与您分享讲义。
《声 明》
★ 以下内容仅代表本人个人专业认
知与体会，与举办方——青岛市食
如由于FDA指导原则中已明确：渗透性无 关紧要，故仅需关注溶解性即可。 根据制剂难度，主要分为以下五大类： (1)难溶性药物（已包涵了BCS分类）
(2)肠溶制剂、(3)缓控释制剂、
(4) pH值依赖性制剂、(5)治疗窗狭窄制剂
2015年5月、FDA颁布BCS -III类 药物可豁免BE试验的指导原则
日本“尼群地平片”质量一致性评价实例 （100rpm + 0.15%吐温-80）
如荼开展，师从该项工程“总设计师”，全面
系统地学习了溶出度技术理念与应用。 该国彼时情况与我国现今极为相似，日本采 用“体外多条溶出曲线对已上市口服固体制剂 进行了与原研品一致性的再评价工作” 。
深度解读分析方法学验证各项关键指标要求
深度解读分析方法学验证各项关键指标要求首先，需验证的分析方法类型有以下四种；① 鉴别试验②杂质的定量试验③杂质控制的限度试验④原料药或制剂中活性成分以及制剂中选定组分的定量试验。
试验类型如下：①鉴别试验旨在确证样品中的一种被测物的特性。
通常将样品的性质（如光谱、色谱行为、化学反应性等）与参比对照品的性质进行比对。
②杂质检查是指样品中杂质的定量检测或限度检测，两种检测均是为了准确反映样品的纯度。
定量试验所需验证项目与限度试验相比是不同的。
③含量测定是指测定样品中被分析物的含量。
本文件中含量测定是指原料药中主要成分的定量测定。
类似的验证项目也适用于制剂中的活性组分或其他指定成分的定量测定，以及与其他分析方法（如溶出度）相关的定量分析。
做药物分析的小伙伴都应该清楚了解分析方法的目的，这将决定需要评价哪些验证项目。
应进行评价的典型的验证项目如下：专属性、检测限、定量限、线性与范围、精密度（进样精密度、重复性、中间精密度）、准确性。
需重新验证的情况① 原料药合成方法的改变②成品组分发生改变③分析方法的改变需要重新验证的程度，应根据改变的情况而定。
某些其他的改变可能也要求验证。
注意：-表示该项目通常不需评价+表示该项目通常需评价(1) 假如已评价重现性（见术语表），可不需再评价中间精密度；(2) 缺乏专属性的分析方法，应由其他分析方法来做补充；(3) 有些情况下需要。
各项目的定义及其要求1. 专属性（Specificity）专属性是指可能存在某些组分(如杂质、降解物、基质等)时，对被分析物准确可靠测定的能力。
专属性有以下含义：①鉴别：确证被分析物符合其特性。
②纯度检查：确保采用的分析方法可检出被分析物中杂质的准确含量，如有关物质、重金属、溶剂残留量等。
③含量测定（含量或效价）：提供样品中被分析物的含量或效价的准确结果。
专属性注意事项：(1) 定位分离试验① 主峰峰纯度的确定在专属性验证的相关实验中，主成分峰都应该考察峰纯度，确认主成分峰为单一成分的峰。
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二、精密度试验
重复性试验：连续进样6次。 中间精密度试验和重现性试验通过“耐用 性试验中的溶液稳定性试验”来体现。 浓度极低时才会不理想，加大进样量。 色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。 加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被 测物质峰尽快出峰。
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三、准确度试验 用回收率来衡量
作法：在80%~120%间选择3点或5点， 原因是由外标一点法决定的。
在100％浓度的主成分溶液中加 入1%浓度的杂质对照品，以模拟样 品中有可能存在的状态。
介绍配制方法 —— 先配制杂质 贮备液，再用供试品溶液（或浓的对 照品溶液）来稀释，简便、易行！9Βιβλιοθήκη 专属性试验验证图谱10
存在问题 —— 配制相同浓度， 测定样品时，主成分峰骤然加大， 将杂质峰覆盖。
强破坏试验的目的： 验证药品在遭遇了极端的气候环 境条件下产生的杂质，在所建立的 色谱条件下是否能够分离、测定。
率、峰宽下进行积分计算。 ● 供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结果。设定
得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出 作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格； 如设定得过大，又将反映不出杂质情况。
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方法学认证中的耐受性试验 是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器， 不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这 一点才是真正至关重要的！认证时不可能做到 这一点，出现问题时往往要考虑到。
已知杂质、且有杂质对照品的，可采 用加入法，即加样回收率来评价。
一般情况下，只要空白辅料无干扰， 回收率均是良好的！
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四、专属性
有关物质为主，其他检测项目 （含量）基本上均参照有关物质。
有关物质的验证，采用中间体和 降解产物（确认结构后人工合成）来 验证与主成分的分离。
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系统适用性试验的配制方法：
2
测定结果： 1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。 2）误差在哪里，应用时的注意事项。 3）为什么没有不成线性的？通常C、H、 O、N结构，紫外监测器决定。
个别化学键所致。梯度洗脱时，有时 会出现不成线性。 4）都成线性、为何还要做？最小二乘法 的原理知晓。
3
唑来磷酸结构式
4
引申使用： 1）有关物质测定 归一化法和自身对照法 的相互妙用。 2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定 为中间浓度。举例说明。 3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦 及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度 的理解。 4）国内只注重相关系数，不注重截距。
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强力破坏试验
● 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 ● 氧化破坏 取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 强碱破坏 取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后， 在90℃放置24小时。 ● 强酸破坏 取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在 90℃放置24小时。 ● 高温破坏 取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高 温下破坏至外观性状改变 ● 强光破坏 取原料适量，置紫外灯下照射48小时。
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介绍该项检测的由来和历史背景
要看主峰里是否有杂质，如何判 断？但需注意DAD检测器的局限性， 介绍“土办法”！
结果：目前从来没有推翻现行色 谱条件的。意义在哪里。如何应用， 拿到只是“走形式”？
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最小峰面积的设定
● 其设定，不是绝对值，而是相对值。
● 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定 时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测 定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。 如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面 积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01% 的最小峰面积。 ● 原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应 予以重视。
谢沐风 上海市药品检验所 xiemufeng@
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一、线性试验
主成分含量测定 以测定浓度为100% ， 50%~120%之间选取5个点即可。
溶出（释放）度测定 以释放量的10%～ 120%间选取5个点即可。
杂质含量用杂质对照品准确测定 以杂质限 度为100% ，50%~120%之间选取5个点即可。
供试品溶液 5mg/ml 20μl 100μg 100%（5000 倍）
对照溶液 50μg/ml 20μl 1μg
1%
最低检出量 1μg/ml 20μl 20ng
0.02%
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积分参数的设定 ● 积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰宽
(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 ● 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜
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四、检测限
● 信噪比的三倍 —— 纯属“纸上谈 兵”，实际测定中根本用不上。 ● 是相对值，不是绝对值。是相对于 供试品溶液浓度的多少分之一而言， 一般至少要在5000倍以上。
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有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系
浓 度 进样量 绝对值 相对于样品测定浓度的
最大进样量 50mg/ml 以上 20μl
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方法学认证中溶液稳定性的全面判定 不能单从主成分入手！ 还要注意所有组分的百分比变化，绝
对值变化！
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mAU
91708 5.923 0.86 10432 8
8.410 98.16 59185 14.26 0.56 4502 2.729 0.42
mAU
1 6 0 1 5 0
2 : 2 1 0n m , 8n m 傾 乕 僥 僗 僱 乕 僩 昗 弨 梟 塼 傾 乕 僥 僗 僱 乕 僩 昗 弨 梟 塼 0 2 - R e p 4
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● 检测波长的确定
涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是 否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质 /A被测成分）
选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长 （f=1.0）。
选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长 （f>1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。
如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波 长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将 得到错误的判断。