海带抗菌活性的研究

的提取溶剂为 95% 甲醇。最佳提取条 件为: 温度为 30 , 时间为 8 h, pH 7。 关键词: 海带 ; 抗菌活性 ; 枯草芽孢杆菌
中图分类号: S986
文献标识码: A
文章编号: 1003 1111( 2009) 11 0659 04
随着人们对海洋认识的逐步深入, 海藻活性物 质的研究越来越成为人们关注的焦点。迄今为止, 人类已经 从海藻中 可以筛选、提取 到多种 有抗肿 瘤、抗氧化、抗细菌、抗真菌、抗病毒的天然化学产 物[ 1 5] , 尤其是对海藻抗菌方面的研究颇 多。国内 许多学者对海藻抗菌活性做了筛选研究, 陈灼华[ 6] 对 10 种红藻和褐藻的抗细菌抗真菌进行了研究, Zheng 等[ 7] 采用纸碟法研究了福建沿 海的海藻提 取物对镰刀菌( Fusar ium ox y sp or um ) 和链格孢菌 ( A lt er nar i abrassicae) 的抗 菌活性, 但是目 前对影 响海藻抗菌活性 物质提取 的因素研 究不是 很多。 研究发现, 海带( L ami nari a j ap oni ca ) 提取物对枯 草芽孢杆菌 ( B aci l lus subt il i s ) 具有很好的抗菌作 用, 笔者对提取过程中提取溶剂和海带样品的提取 条件对海带抗枯草芽孢杆菌活性的影响因素进行 了研究, 为今后抗菌活性物质的 分离纯化、开发利 用奠定了基础。
660
水产科学
第 28 卷
( 直径 6 mm) , 在超菌台向每份滤纸片滴加 20 l 的 结果取平均值。
乙酸乙酯萃取液, 待乙酸乙酯充分挥发后贴于培养 基平板上, 同时同一溶剂的空白 对照, 置恒温培养 箱中培养( 细菌 32~ 37 , 18~ 24 h; 真菌 28~ 30
, 48~ 72 h) 后分别观察结果, 测量抑菌圈。以上 步骤均在无菌条件下操作, 每份样品 3 个平行样,
20 20 20 30 30 30 40 40 40 20 20. 6 19. 1 6. 67 6. 87 6. 37 0. 5
表 6 海带抗菌物提取条件优化正交设计
B
C
D
pH
时间/ h
误差
6
4
1
7
6
2
8
8
3
6
6
3Biblioteka Baidu
7
8
1
8
4
2
6
8
2
7
4
3
8
6
1
20
19. 5
20
20. 1
19. 9
19. 5
19. 6
在提取过程中, 用 95% 甲醇对海带进行提取, 考察在不同 pH 提取条件下海带提取物抗枯草芽 孢杆菌效果, 结果见表 3。
表 3 不同提取 pH 条件下抑制枯草芽孢杆菌效果
pH
4 5 6 7 8 9 对照
抑菌圈直径/ mm
1
2
3
平均值
6. 3
6. 5
6. 4
6. 4
6. 4
6. 5
6. 4
6. 4
在提取抗菌活性物质过程中, 对提取时间进行 研究, 结果见表 5。
第 11 期
穆凯峰等: 海带抗菌活性的研究
661
表 5 不同提取时间条件下抑制枯草芽孢杆菌效果
时间
h
2 4 6 8 10 12 24 对照
抑菌圈直径/ mm
1
2
3
平均值
6. 6
6. 7
6. 7
6. 7
7. 1
6. 9
7. 0
7. 0
95% 丙酮
6. 7
6. 8
6. 7
6. 7
对照
无
无
无
无
由表 2 可见, 分别用 95% 的有机溶剂: 甲醇、乙 醇、丙酮对海带抗菌活性物质进 行提取时, 有机溶 剂海带提 取物都具 有抗枯草 芽孢杆菌 作用, 但乙 醇、丙酮的提取效果不是很好, 而甲醇提取效果最 好, 抑菌圈直径达 7. 8 mm 。 2. 3 不同提取 pH 条件下的抑菌效果
圆形纸片法[ 7] : 分别刮取供试菌菌苔一环于 5 m l 无菌水中, 振荡摇匀后得到菌悬液, 倒入溶化并 冷却至 40~ 45 的相应培养基中, 摇匀后, 迅速分 装于培养皿中, 待凝固后, 取已消毒过的圆形滤纸
收稿日期: 2008 09 19; 修回日期: 2008 12 12.
基金项目: 福建省重点科技项目( 2008N 0038) ; 福建省科技厅高校专项项目( 2007F5076) ; 集美大学中青年创新团 队专项基金资 助 项目( 2006A002) .
3 讨论
通过对海带提取物的抗菌研究发现, 海带提取 物对枯草芽孢杆菌具有一定的抗菌作用, 但对大肠
杆菌、黑曲霉、酵母菌则无抑制效果, 徐秀丽等[ 2] 在 中国经济海藻提取物生物活性中的研究结果表明, 海带提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌( S tap hy l ococus aur eus) 也均无抑制效果。
7. 3
6. 7
6. 7
6. 8
6. 7
6. 8
6. 6
6. 7
6. 7
6. 4
6. 5
6. 5
6. 5
无
无
无
无
由表 4 可见, 海藻抗菌活性物质与提取温度有 关, 海藻提 取物在 不同温度 段均有一 定的抑 菌作 用。在提取温度比较低时, 海带抗 菌效果较明显, 但提取温度超过 30 , 随着温度升高, 抑菌效果逐 渐变差, 提取温度在 30 时有很好抑菌效果, 抑菌 圈直径为 7. 3 m m。 2. 5 不同提取时间的抑菌活性效果
20. 3
20. 2
6. 67
6. 5
6. 67
6. 70
6. 64
6. 50
6. 53
6. 77
6. 73
0. 18
0. 27
抑菌圈直径/ mm
1
2
3
6. 5
6. 6
6. 6
6. 6
6. 6
6. 7.
6. 8
6. 8
6. 9
6. 9
7. 0
7. 0
7. 0
7. 1
7. 1
6. 5
6. 5
6. 4
6. 4
6. 4
6. 5
6. 6
6. 5
7. 8
8. 0
7. 8
7. 9
6. 6
7. 7
6. 7
6. 7
6. 3
6. 4
6. 3
6. 3
无
无
无
无
由表 3 可见, 用 95% 的机溶剂甲醇对海带进行 提取时, 酸性及碱性条件均不利于抗菌活性物质的 提取, 但在碱性条件下抗菌活性物质的提取效果要 好于酸性条件的提取效果, 随着酸性和碱性逐渐增 强, 抗菌活性变得越来越弱, 这均不利于抗菌活性 物质的提取; 在 pH = 7 时抗菌效果最为明显, 抑菌 圈直径 7. 9 mm, 可能是活性物质在酸碱条件下性 质发生了改变。 2. 4 不同提取温度下的抑菌活性效果
作者简介: 作者简介: 穆凯峰( 1983- ) , 男, 硕士, 研究方向: 水产品保 鲜与加工; E mail: m kfeng2008@ sina. com. 通迅作者: 吴永 沛 ( 1956- ) , 男, 教授, 硕士生导师, 研究方向: 水产品加工, E mail: w uypei@ jmu. edu. cn.
7. 5
7. 5
7. 6
7. 5
7. 3
7. 5
7. 4
7. 4
7. 2
7. 2
7. 1
7. 2
7. 1
7. 0
7. 0
7. 0
6. 9
6. 8
6. 8
6. 8
无
无
无
无
由表 5 可见, 海带提取物在不同的时间段对枯 草芽孢杆菌均有一定的抗菌效果, 但长时间的提取 反而不利于抗菌, 提取时间为 6 h, 有很好的抑菌效 果, 抑菌圈直径为 7. 5 mm。 2. 6 海带抗枯草芽孢杆菌提取最佳条件的研究
在提取工艺中, 分别采用 95% 甲醇、95% 乙醇、 95% 丙酮对海带抗菌活性物质进行提取, 以抑菌圈 直径为参考, 结果见表 2。
表 2 不同有机提取剂抑制枯草芽孢杆菌抑菌效果
溶剂
抑菌圈直径/ mm
1
2
3
平均值
95% 甲醇
7. 8
7. 8
7. 9
7. 8
95% 乙醇
6. 9
7. 0
6. 9
6. 9
第 28 卷第 11 期 2009 年 11 月
水 产科 学
F ISH ER IES SCIEN CE
V ol. 28 N o. 11 Nov. 2009
海带抗菌活性的研究
穆凯峰, 吴永沛, 杨 芳, 杨秋明
( 集美大学 生物工程学院, 福建 厦门 361021 )
摘 要: 研究了海带提取物对 4 种微生物: 枯草芽孢杆菌、大肠杆 菌、黑 曲霉、酵母菌的抗 菌作用, 并对 海带提取物的提取条件进行研究。试验结果表明 : 海 带提取 物仅对枯 草芽孢 杆菌具 有抗菌 作用; 较好
由于很多抗菌活性物质受温度的影响, 故提取 过程中对温度的影响进行了研究, 其结果见表 4。
表 4 不同提取温度条件下抑制枯草芽孢杆菌效果温度
温度/
10 20 30 40 50 60 对照
抑菌圈直径/ mm
1
2
3
平均值
6. 3
6. 4
6. 4
6. 4
7. 1
6. 9
7. 0
7. 0
7. 3
7. 3
7. 2
海藻提取物抗菌活性 物质可以采用多种有机
∀ 乙酸乙酯萃取 # 真空旋转蒸发得到黑褐色的液状
浸膏
∀ 乙酸乙酯相 水相
抗菌试验
注: 有机溶剂分别为 95% 甲醇、95% 乙醇、95% 丙酮.
在试验过程中, 分别用不同有机溶剂对海带进 行提取, 在过滤、真空浓缩之后, 得到液 状浸膏, 用 乙酸乙酯进行萃取, 得到低极性的乙酸乙酯相和高 极性的水相部分后, 分别做抗菌试验。 1. 2. 2 抗菌试验
6. 4
6. 5
6. 3
6. 4
6. 4
6. 3
6. 3
6. 4
T = 59. 7 C = 396. 01
平均值
6. 6 6. 5 6. 8
7 7. 1 6. 5 6. 4 6. 4 6. 3
来源
温度( A ) pH ( B ) 时间( C) 误差( D) 总变异
SS
0. 380000 0. 046667 0. 106667 0. 086667 0. 620000
1 材料与方法
1. 1. 1 原料 海带于 2007 年 6 月采自福建厦门沿海, 采后
除去杂质, 于通风处晾干, 粉碎机粉碎后置于阴凉 干燥处备用。 1. 1. 2 菌种
用于抗菌活性试验的菌种为枯草芽孢杆菌、大 肠杆菌( E scheri chia col i ) 、黑曲霉( A sp er gi ll us ni ger ) 、啤酒酵母( Cerevi si ae f erment ed ) 。
2 结果
2. 1 海带提取物对不同微生物的抑菌效果 海带提取物对不同微生物 的抗菌活性研究结
果见表 1。
表 1 海带提取物对不同微生物的抑菌效果
海藻种类
海带 对照
提取物
乙酸乙酯相 水相
细菌
枯草芽孢杆菌
大肠杆菌
+
-
-
-
-
-
黑曲霉
-
真菌
酵母菌
-
采用加过滤 纸片的培养皿培 养, 查看 抗菌效 果。结果表明, 海带提取物乙酸乙酯相对枯草芽孢 杆菌有抑菌作用, 但对大肠杆菌、黑曲霉、酵母菌无 抑菌作用; 海带提取物水相组分对枯草芽孢杆菌、 大肠杆菌、黑曲霉、酵母菌均无抑菌作用。 2. 2 采用不同有机提取剂抑制枯草芽孢杆菌效果
1. 1. 3 培养基 细菌培养基: 蛋白胨 10. 0 g , 牛肉提取物 3. 0
g , NaCl 5. 0 g, 琼脂 15. 0 g , 蒸馏水 1. 0 L, pH 7. 0 ~ 7. 2, 121 高压灭菌 25 min。
真菌培养基: 马铃薯 200 g, 蔗糖 20 g, 蒸馏水 1. 0 L , 琼 脂 20 g, pH 自然, 121 高 压 灭菌 25 m in。 1. 2 试验方法 1. 2. 1 海藻抗菌物质的制备 称取海带粉 10 g 有机溶剂* ! 100 ml 提取 过滤
表 7 方差分析
df
MS
F
Fa
显著性
2
0. 190000
4. 3846
F0.01( 2, 2) = 99
不显著
2
0. 023330
0. 5385
F0.05( 2, 2) = 19
不显著
2
0. 053333
1. 2306
F0.10( 2, 2) = 9
不显著
2
0. 043330
由表 6 可见, 提取温度、提取 pH 、提取时间对 海带抗菌活性物质的提取均有影响, 由极差分析结 果得知, 3 种因素对海带抗菌活性物质提取效果影 响有一定差异, 提取温度影响较大, 提取时间次之, pH 影响相对较小, 即 A> C> B。方差分析结果表 明( 表 7) : 三因素对海带抗菌活性物质提取效果影 响均不显著。确定的最佳优化组合为 A 2 B2 C3 , 即 抗枯草芽孢杆菌的甲醇海带提取物的最佳提取条 件为: 温度为 30 , 时间为 8 h, pH 7。
由试验结果可知, 温度、时间、pH 对海带抗菌 活性物质的 提取均有 影响, 在单因数 试验的 基础 上, 对影响海带抗菌活性物质的提取的因 素, 即提 取 pH 、提取温度、提取时间进行正交试验, 结果见 表 6。
试验号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 k1 k2 k3 极差
A 温度/