抗氧化肽的研究进展

1.1抗氧化肽的研究进展生物体内具有许多蛋白质类抗氧化活性物质。

随着对蛋白酶解技术的深入研究，人们发现，介于蛋白质和氨基酸间的肽类，与其他生物分子如氨基酸、大分子蛋白质等相比较在食品方面安全性更高，且具有极强的活性和多样性，动植物蛋白水解所得的具有一定生理活性的功能性多肽及寡肽产品被广泛开发利用，如具有抑制血压升高的食品，及有特殊氨基酸组成的、可以作为患者营养补剂的寡肽等。

随着人们发现某些蛋白质具有清除生物体内过量的游离基，抑制脂质氧化的作用后，肽的抗氧化性的研究成为一大热点。

目前对以多种动植物蛋白为原料，制备高效、低毒的天然抗氧化肽的研究，已经取得的一定的成果。

1.1.1 抗氧化肽的种类人们对抗氧化肽研究的种类有很多，常见的有大豆肽、乳蛋白肽和肌肽，也有一些特殊的蛋白肽，如苜蓿叶蛋白肽等。

有些活性肽是直接提取的，也有通过蛋白水解方法获得的。

1.1大豆肽大豆肽是大豆蛋白水解得到的小肽Wendee Chiang 等采用酶膜反应器连续生产大豆多肽，由于及时分离了酶解生成的多肽，消除了产物反馈干扰，提高了酶解效率，并采用氧化稳定指数（OSI检测了大豆分离蛋白及其水解物的抗氧化活性，结果显示大豆分离蛋白酶解后抗氧化活性明显提高。

Hua- Mingchen 等采用 5 种蛋白酶对大豆 7S 球蛋白进行水解，采用硫酸氰铁法检测了不同水解产物的抗氧化活性，并采用G- 25 凝胶层析和反相高压液相色谱对水解产物进行分离、提纯，检测不同大豆多肽的抗氧化活性，得到了6 个抗氧化肽的氨基酸序列。

1.2乳蛋白肽乳蛋白肽是乳品深加工的理想产品，刘志东等研究乳清分离蛋白（WPI）酶解物对自由基的清除效果，并证明了木瓜蛋白酶酶解物和胰蛋白酶酶解物对 DPPH 自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除能力和还原能力强于胰凝乳蛋白酶酶解物和胃蛋白酶酶解物。

Sandrine G. Rival 等[1]研究了酪蛋白及酪蛋白水解肽的抗氧化活性，认为酪蛋白本身具有抗氧化活性，并不因脱磷酸作用和水解作用而失去这一活性，并使用酪蛋白及酪蛋白水解肽作为抗氧化剂进行研究。

1.3 肌肽1900 年俄国首次发现肌肽，它是一种水溶性天然二肽。

Eun- Kyung Kim 等[2]通过纯化鹿肉酶解物来获得抗氧化肽。

AI SAIGA 等利用 2 种酶分别水解猪肌原蛋白来获得抗氧化肽，并对木瓜蛋白酶水解后的产物进行分离纯化，获得5 个具有抗氧化活性的肽片段，表示为 Asp- Ser- Gly- Val- Thr、Ile- Glu- Ala- Glu- Gly- Glu、Asp- Ala- Gln- Glu- Lys- Leu- Glu、Glu- Glu- Leu- Asp- Asn- Ala- Leu- Asn、Val- Pro - Ser- Ile- Asp- Asp- Gln- Gly- Glu- Leu- Met，其中 Asp - Ala- Gln- Glu- Lys- Leu- Glu 抗氧化能力最强。

1.3其他肽谢正军等对苜蓿叶蛋白抗氧化肽水解用酶进行筛选研究，结果表明碱性蛋白酶Alcalase 是制备苜蓿叶蛋白抗氧化肽的最适水解酶。

Anne Pihlanto 等[3] 分离得到分子量为 10 kDa~3 kDa 的马铃薯蛋白水解物，并测定其抗氧化活性，从而肯定了马铃薯的生物价值。

Dong Wang 等[4]认为从豆豉中提取的肽有很高的抗氧化活性。

Hang Guo 等[5]酶解蜂王浆蛋白获得 12 个活性肽片段，这些片段均表现出清除羟自由基的能力。

1.1.2 抗氧化肽的机理抗氧化肽的抗氧化活性与多肽的相对分子质量大小、氨基酸序列、氨基酸侧链基团、金属盐络合有关。

抗氧化肽的肽链长短对活性影响较大，一般认为应在 20 个氨基酸残基以内，如果肽段过长，具有抗氧化性的 Val、Leu 未能呈现在肽段的 N-端和C - 端，则抗氧化性显示不出来。

Hua- MingChen 等人利用大豆蛋白水解获得抗氧化肽 Leu-Leu- Pro- His- His，当去掉 C - 端 His 时，抗氧化活性降低，而去掉 N - 端 Leu 时，抗氧化活性没有影响。

他们认为 His 和 Pro 在抗氧化活性序列中有重要作用，因为 Pro- His- His 序列肽段的抗氧化活性最高，当在Pro 或His 的位置上导入Tyr 不会增强活性。

有争议的是，Hang Guo 等[5]人的实验却发现 C - 端是 Tyr 的 3 个二肽有较强的抗氧化活性。

徐力等[6]制备水解玉米蛋白制备抗氧化肽，其结构Leu- Asp- Tyr- Glu，其中Tyr 具有酚羟基结构，能提供质子猝灭自由基，与 Tyr 邻近的 Asp 和 Glu 的羧酸根具有吸电子作用，使 Tyr 酚羟基上氧电子云密度减弱，更有利于质子的释放，增强了Tyr 的质子供体效应。

此外，玉米抗氧化肽的N - 端为疏水性氨基酸Leu，使抗氧化肽与脂肪酸的相互作用增强，提高了其对脂质自由基的捕捉能力。

因此，抗氧化肽的抗氧化活性是由其分子供氢的能力和自身结构的稳定性决定的。

通过捕捉自由基反应链的过氧化自由基，阻止或减弱自由基链反应的进行，氢原子给予自由基后，本身成为自由基中间体，此中间体越稳定越易形成，其前体就越易清除自由基则抗氧化能力越强。

研究发现单纯的氨基酸也有某些抗氧化活性，但其活性远远低于由其所组成的抗氧化肽，这也是生物活性肽的一个显著的特点，即整个肽的活性远大于其组成氨基酸的活性。

因此，我们认为抗氧化肽的高生物活性在于肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用。

1.1.3抗氧化肽的制备方法1.提取法提取法是指从微生物、动植物中提取出一些天然存在的抗氧化肽, Decker等从骨骼肌中提取肌肽。

但因生物体内天然抗氧化肽含量极微,原料来源有限,其提取分离纯化成本高、提取难度大,难以大规模推广。

2化学水解法化学水解法是将蛋白与一定浓度的酸或碱溶液混合,加热至一定温度并保持一段时间,使蛋白质的肽链裂解。

该方法简单、成本低,但氨基酸受损严重,活性难以保持,水解程度难于控制,食品工业中通常不采用。

3酶法水解酶法水解是酶解蛋白得到所需要的肽,该法反应条件温和、反应时间短、效率高,在一定条件下可以定位水解,且反应过程易控制,产品纯度高,成本低廉,可较好地满足肽的生产需要,是获得食品级生物活性肽的常用方法。

4 发酵法利用微生物发酵生产多肽时,微生物可对肽的基团进行修饰、重组,制得的肽无异味,可广泛用于食品和医药行业。

5化学合成法化学合成法更适于合成中等长度肽链的肽,但该法成本高,且有副反应物及残留化合物。

6 基因重组法采用基因重组技术制取活性肽因宿主不同其表达的肽也不同,表达产物的分离纯化比较困难,该方法常用于合成肽链相对较长的肽。

抗氧化能力的评价2.1 抗氧化能力的测定指标2.1.1 清除自由基人体在正常生理代谢过程中会产生少量的自由基，如超氧阴离子、羟基自由基等，这些自由基通过与存在于体内的抗氧化酶及其他抗氧化剂的作用而被消除。

因此，在正常状态下，体内自由基维持在一定水平并处于动态平衡之中，并不表现出对组织、细胞功能的损伤。

然而，随着增龄或在某些病理状态下以及机体受到创伤时，过多的氧自由基不能被及时清除而堆积在细胞内，致使它们与机体内的一些生物大分子，如蛋白质、核酸、脂质等发生反应，生成大量氧化物或过氧化物，影响细胞物质和能量代谢的正常进行。

清除DPPH 和ABTS 所产生的自由基能力是体外评价抗氧化能力的常用指标。

另外还原三价铁离子的能力也常作为抗氧化能力的评价指标。

DPPH 和ABTS所产生的自由基是一种稳定的自由基，但这种自由基并不在生物体内存在。

为了使测定更接近体内的情况，氧自由基吸收能力这一指标越来越多的用于抗氧化能力的测定，此方法的原理是根据样品猝灭自由基所产生的荧光的能力大小来评价其抗氧化能力高低。

2.1.2 抑制脂质过氧化抑制脂质过氧化的测定方法主要有电子自旋共振法、共轭亚油酸体系测定法、硫代巴比妥酸法。

以上检测方法均可用于检测受试物是否可抑制脂质过氧化反应，从而了解其抗氧化性能。

电子自旋共振法一般用于氧化初始阶段的测定，主要测定活性物质诱捕自由基的能力。

共轭亚油酸体系测定法选用共轭亚油酸，一种自身很易于氧化的物质作为过氧化评价体系，添加活性物质测定其对共轭亚油酸过氧化的抑制作用，从而评价其抗氧化能力。

硫代巴比妥酸法以脂质过氧化产物丙二醛(MDA)为测定指标，抑制MDA 的生成已广泛作为评价抗氧化肽抑制脂质过氧化能力的重要指标。

目前有许多方法应用于抗氧化能力的测定，但由于原理各不相同，所以不同方法间的比较就显得十分困难，而且这些体外的化学评价方法最大的问题就是不符合体内的情况，使其测定结果对于体内研究没有预测意义。

近 20 年来，活性氧和自由基的研究成为现代生命科学的前沿和热点，评价和筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为生物学、医学和食品科学研究的新趋势。

因而各种抗氧化的测定方法也在不断的发展。

越来越多的研究者采用体外细胞培养的方法，测定抗氧化肽对由过多自由基所造成的DNA 损伤的保护作用。

抗氧化剂体外抗氧化的试验特点是快速、灵敏。

它们在实际应用中可检测到某种物质具有的抗氧化能力，可作为筛选活性试验，同时也能对受试物的抗氧化原理有初步的了解。

相对于体外研究，抗氧化作用的体内研究较少，体内抗氧化机理还需要进一步深入研究。

2.2 影响抗氧化能力的因素2.2.1 底物蛋白生物活性肽通常由两至十几个氨基酸残基组成，以非活性状态存在于蛋白质的长链之中，在蛋白质的水解非活性状态存在于蛋白质的长链之中，在蛋白质的水解过程中，具有活性作用的基团逐渐暴露出来，它们的活性就被释放出来。

蛋白结构中氨基酸的种类、数量以及氨基酸的排列顺序都与其水解产物中抗氧化肽的含量、组成、活性强弱有着密切的联系，同时也影响最终抗氧化肽的分离纯化难易程度。

有文献报道，许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如组氨酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸等。

因此在选择原料制备抗氧化肽时，必须注意底物的结构、性质。

2.2.2 蛋白酶肽是蛋白质经酶水解而得，不同蛋白酶的酶切位点各不相同，因此即使对于同一种蛋白，用不同蛋白酶水解所得的肽，其氨基酸组成和分子量大小也会有所不同，而这些正是影响肽抗氧化活性的主要因素，因此选用合适的蛋白酶就成为制备高活性抗氧化肽的重要因素之一。

2.2.3 水解度对某一底物蛋白的水解产物而言，其氨基酸组成和分子量大小与抗氧化活性有明显的相关性。

随着水解过程的进行，水解度逐渐增大，水解产物中蛋白质、肽、氨基酸的组成、含量会发生相应的变化，但不同的蛋白质其自身性质不同，因此其合适的水解度也不同，需通过具体实验才能确定。