DNA的酶切鉴定
酶切鉴定-BamHI and EcoRI
注意事项
1. 直接在抽提的质粒 直接在抽提的质粒DNA管中加入酶切体系。 管中加入酶切体系。 管中加入酶切体系 2. 为使微量操作更精确，可以4个人（8 tubes）一起做 为使微量操作更精确，可以 个人 个人（ ）一起做9 体系混合液，然后再分装10ul于各质粒管中。 于各质粒管中。 份酶切 体系混合液，然后再分装 于各质粒管中 3. 上样时要小心操作，防止样品溢出。 上样时要小心操作，防止样品溢出。 4. 接触凝胶时，因其中含有EB或荧光染料，要戴手套， 接触凝胶时，因其中含有 或荧光染料 要戴手套， 或荧光染料， 废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ 废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！ 5. EB是极强致癌物！小心！ 是极强致癌物！小心！ 是极强致癌物
限制性内切 酶切割DNA 酶切割
A: Strategy of construction
f1 ori Ampr pGEX Vector (4900 bp)
BamH I EcoR I
B: The product of PCR
1 2 3
4900 bp
X-gene cDNA
Primer1
740 bp
Primer2
体积（ ） 体积（µl） 10 2 1 1 1 5 20
酶切一小时后，每管加入 酶切一小时后，每管加入5 ul的6xloading 的 buffer，中止反应，混匀。 ，中止反应，混匀。 20~25 ul上样，在一个泳道中加入 ul DNA 上样， 上样 在一个泳道中加入10 Marker。 。
核酸电泳 根据核酸的解离性质， 根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动， 酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是 电泳。 电泳。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。 常用的凝胶电泳有琼脂糖 琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯 凝胶电泳和 常用的凝胶电泳有琼脂糖 凝胶电泳 酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直 凝胶电泳。 酰胺 凝胶电泳 的电泳槽中进行。 的电泳槽中进行。凝胶电泳兼分子筛和电泳双重效 果，所以分离效率很高。 所以分离效率很高。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA 按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
质粒DNA提取、定量、酶切与PCR鉴定
限制性内切酶
影响酶切反应的因素
➢ 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等 均能抑制酶反应; ➢ 反应系统：主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 合适 离子强度可以激发酶切反应; ➢ 反应体积：一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于5%; ➢ 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误;
DNA样品较纯,符合实验要求 RNA污染 有蛋白质或其它杂质的污染
实验仪器
核酸蛋白检测仪(Eppendorf BioPhotometer plus)
比色杯
数据处理
测量次数 1 2 3
平均值
质粒DNA浓度
(μg/ml)
Ratio值
(A260/A280)
定量检测
第三部分 酶切鉴定
DNA Restriction Enzyme Digestion
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用下，以dNTP 为原料，引物 为复制起点， 模板DNA的一 条单链在解链 和退火之后延 伸为一条双链
延伸
72˚C
实验原理
变性
95˚C
加热使模板DNA 在高温下90℃-95 变性，双链解链
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的5℃ 左右），与 模板DNA互补 退火形成部 分双链
✓ 注意:我们接下来要用的eppendorf公司生产的紫外分光光 度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒DNA的最终浓度 和Ratio值.
实验方法
2.根据在260nm以及在280nm的读数比值估计核酸的 纯度（Ratio=A260/A280）
• Ratio= 1.8 • Ratio＞1.9 • Ratio＜1.6
实验3质粒DNA的酶切鉴定
实验三质粒DNA的酶切鉴定南京大学生命科学院一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、学习酶解的操作方法，初步理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具3、进一步熟练掌握琼脂糖凝胶电泳的方法二、实验原理限制性核酸内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是能够识别双链DNA分子特异性核酸序列，并能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。
限制性核酸内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。
限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。
寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。
各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。
这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。
这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。
这类酶如EcoB、EcoK等。
第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。
因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。
II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要：以质粒pUC19作为载体、λDNA作为外源片段来源，限制性核酸内切酶Hin dⅢ分别对其进行单酶切，产生相同的黏性末端后用T4 DNA连接酶连接从而构建重组质粒，用CaCl2制备E.coli感受态细胞，并用热激法进行重组质粒的转化，培养并用α-互补筛选法进行筛选，最后用试剂盒提取质粒DNA进行检测。
根据在实验过程中所遇到的问题及对结果的分析，探讨关键步骤及影响转化/重组效率的相关因子，并说明实验过程中应当注意的问题。
关键词：DNA酶切连接感受态细胞转化重组子的筛选与鉴定引言：实验目的为掌握限制性核酸内切酶的分类、特性与作用原理以及对DNA进行酶切的实验技术，掌握DNA连接酶的作用原理以及利用T4 DNA连接酶构建重组DNA分子的实验技术，掌握利用CaCl2制备E.coli感受态细胞的原理和方法，掌握α-互补筛选法的原理，学习用试剂盒提取质粒DNA的方法，复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒。
限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。
主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。
限制性核酸内切酶分为三类，Ⅰ型与Ⅲ型：识别位点与切割位点不一致，故同一种酶切产生的片段长度不同；Ⅱ型：固定的识别序列处切割，故每次都产生完全相同的片段。
影响限制性内切酶活性的因素有：DNA纯度，DNA甲基化程度，反应温度，DNA 的分子结构，缓冲液。
DNA连接酶在体内合成DNA某条链上丢失的磷酸二酯键，体外连接反应中，DNA连接酶则需要合成两个磷酸二酯键。
T4-DNA连接酶不需要PEG等就能进行平端的连接，所以实验中绝大多数情况下使用T4-DNA连接酶。
影响DNA连接的因素有：温度、时间、酶量、缓冲体系、DNA末端的性质及浓度、DNA片段的大小等。
高中生物质粒DNA的酶切鉴定(28页)公开课ppt课件
实验目的
1、学习限制性内切酶的特性 2、掌握酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法
高中教材分析
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子特
异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的
重要工具，常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶
等一起称为工具酶。 限制性核酸内切酶还可以用于基因组酶切图谱的鉴 定。
2)限制性核酸内切酶的类型及特性
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺 序，并在识别点附近 1000 bp 的一些核苷酸上切割 DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专 一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技 术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结外观察 分析仪 上观察酶切的结果。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能 形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取 决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的 缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。
BamH I
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’
Sau 3A
BglⅡ
19
5) 影响内切酶切割效率的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) DNA的分子结构； (5) 溶液中离子浓度及种类； (6) 缓冲液的 pH值。
质粒
EcoR1
1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型和特征 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素
1)寄主控制的限制与修饰现象 restriction modification system
质粒DNA的提取、定量、酶切及PCR鉴定实验报告
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。
二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为：A.变性：加热反应系统至95℃，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链。
B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析（紫外分光光度法）：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A280<1.8 表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质A260/A280>1.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。
实验九 DNA的酶切
实验九 DNA的酶切一、原理1．三类限制酶限制酶特异地结合于其识别的特殊DNA序列之内或附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。
限制酶可分为3类。
I类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制性酶切活性。
Ⅲ类限制酶在识别序列上切割DNA，然后从底物上解离。
而I类限制酶结合在识别序列上，但却随机地切割回转到被结合酶处DNA。
在基因工程中I类和Ⅲ类限制酶都不常用。
常用的是I类限制酶。
2．Ⅱ类限制酶Ⅱ类限制酶又可分为二种酶，一种是限制性内切酶，它切割裂一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它使识别序列甲基化。
基因工程中常指的限制酶或限制性内切酶就是第一种I类限制酶。
3．限制性内切酶(1)识别序列一般为回文对称型，如EcoR I识别序列为：5’…GAATTC…3’3’…CTTAAG…5’对称轴两则等距离的碱基两条互补链识别序列完全一样。
(2)识别序列长度大多数为4～6个核苷酸。
(3)切割方式两种A．错位切割大多数限制性内切酶不在识别序列的对称轴上切割DNA链，而在偏离对称轴数个核甘酸处切割。
错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为粘性末端(Cohesive Ends)。
带有相同粘性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。
B.沿对称轴切割，一些酶在对称轴处切割，产生平齐末端(Blunt Ends)。
(4)同裂酶(同切口限制性内切酶)一般说来，不同的限制性内切酶识别不同的序列。
然而有一些从不同来源分离的酶能在相同靶序列切割。
这些酶称为同裂酶(Ischizomers)。
有—些识别四核苷酸序列的酶识别序列在另一种六核苷酸识别序列之内，如MboI和Sau3A I，识别序列在BamHl之内。
两种酶切割反应要求最严的成分是底物DNA，酶要产物直接受DNA底物纯度的影响。
提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反心，有些甚至改变识别序列两种酶切割后得到相同末端．所以这两种酶产生的片段可以连接。
分子酶切实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握限制性核酸内切酶的原理和应用。
2. 熟悉质粒DNA的提取和纯化方法。
3. 学习琼脂糖凝胶电泳技术，分析酶切结果。
4. 探讨影响酶切效率的因素。
二、实验原理限制性核酸内切酶（RE）是一种能够识别双链DNA上的特定序列，并在识别序列处切割DNA的酶。
根据酶切位点的不同，限制性核酸内切酶可分为两类：Ⅰ类酶和Ⅱ类酶。
本实验所使用的是Ⅱ类酶，如HindⅢ、EcoRⅠ等。
质粒DNA的提取和纯化是分子生物学实验中的基本操作，通过提取和纯化可以获得高纯度的质粒DNA，便于后续的酶切、连接、转化等操作。
琼脂糖凝胶电泳技术是一种常用的分子生物学分离技术，通过电泳分离不同分子量的DNA片段，从而对酶切结果进行鉴定。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶（如HindⅢ、EcoRⅠ）3. 琼脂糖4. DNA marker5. Tris-HCl缓冲液6. 10×Loading buffer7. 1×TAE电泳缓冲液8. 0.5×TAE电泳缓冲液9. 0.5%琼脂糖凝胶10. 紫外灯11. 显影液四、实验步骤1. 质粒DNA的提取和纯化（1）将质粒DNA加入Tris-HCl缓冲液中，加入等体积的酚/氯仿，剧烈振荡，静置5分钟。
（2）取上清液，加入等体积的氯仿，剧烈振荡，静置5分钟。
（3）取上清液，加入2/3体积的95%乙醇，混匀，室温放置10分钟。
（4）将沉淀物用70%乙醇洗涤，室温放置5分钟。
（5）将沉淀物溶于适量TE缓冲液中，即为纯化的质粒DNA。
2. 酶切反应（1）将纯化的质粒DNA加入酶切缓冲液中，加入限制性核酸内切酶，混匀。
（2）37℃水浴孵育2-3小时，或根据酶的说明书进行。
（3）加入适量DNA loading buffer，混匀。
3. 琼脂糖凝胶电泳（1）制备0.5%琼脂糖凝胶，加入1×TAE电泳缓冲液。
（2）将酶切反应产物加入凝胶孔中，同时加入DNA marker。
酶切鉴定
质粒DNA的酶切鉴定 质粒DNA的酶切鉴定 DNA
Ampr
f1 ori LacZ pGEMmA1-5R (3204 bp)
D: Identify positive clone
3204 bp 3015 bp 189 bp
T7
189 bp
Spe I EcoR I Not I Pst I Sac I
pGEM-xy1
Construction of pGEM-xy1
B: Primer of PCR:
PAP 5' GACCACGCGTATCGATGTCGAC mA5 5' GGCCAGGAGATTGAACTCAAG
Mouse cells X-gene cDNA PAP
189 bp mA5
C: The product of PCR
189 bp Ligation
Apa I Sph I Nco I Not I EcoRI
实验原理 限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基 操作过程中所使用的基 限制性内切酶是 本工具。其特异性地结合于一段特殊 本工具。其特异性地结合于一段特殊DNA序列之 序列之 内或其附近的特异位点上，并在此切割双链 内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。 。 分子克隆中常用的为II类限制酶， 分子克隆中常用的为 类限制酶，其识别位点长 类限制酶 度为4、 或 个核苷酸的反向重复序列 个核苷酸的反向重复序列。 度为 、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶 的切割点因酶而异，有些产生带平端的 片段， 的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段， 片段 而另一些产生带有粘性末端的DNA。 。 而另一些产生带有粘性末端的
酶切分析实验报告
一、实验目的1. 理解限制性核酸内切酶的原理及其在基因工程中的应用。
2. 掌握质粒DNA的提取方法。
3. 学习使用限制性核酸内切酶进行DNA片段的切割。
4. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果，鉴定目的DNA片段。
二、实验原理限制性核酸内切酶（Restriction Endonucleases）是一类能够识别特定DNA序列并在该序列的特定位置切割双链DNA的酶。
在基因工程中，限制性核酸内切酶用于切割DNA分子，以便进行进一步的克隆、测序或分子标记等操作。
本实验中，我们使用限制性核酸内切酶切割质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
根据酶切位点的不同，质粒DNA会被切割成不同长度的片段。
通过比较酶切前后的DNA片段，可以鉴定目的DNA片段。
三、实验材料1. 质粒DNA2. 限制性核酸内切酶3. 琼脂糖4. 电泳缓冲液5. 标准DNA分子量标记6. 琼脂糖凝胶电泳仪7. 凝胶成像系统四、实验步骤1. 质粒DNA提取：根据试剂盒说明书提取质粒DNA。
2. 酶切反应：将提取的质粒DNA与限制性核酸内切酶混合，加入缓冲液，进行酶切反应。
3. 琼脂糖凝胶电泳：- 准备琼脂糖凝胶，加入电泳缓冲液。
- 在凝胶孔中加入标准DNA分子量标记和酶切后的质粒DNA。
- 连接电源，进行电泳。
- 电泳完成后，关闭电源，取出凝胶。
4. 凝胶成像与分析：- 使用凝胶成像系统观察电泳结果。
- 根据标准DNA分子量标记，分析酶切产物的长度。
- 比较酶切前后的质粒DNA片段，鉴定目的DNA片段。
五、实验结果与分析1. 质粒DNA提取：成功提取出质粒DNA，通过紫外分光光度计检测，A260/A280比值在1.8-2.0之间。
2. 酶切反应：限制性核酸内切酶成功切割质粒DNA，产生不同长度的片段。
3. 琼脂糖凝胶电泳：- 电泳结果显示，酶切后的质粒DNA片段在凝胶上呈现清晰的条带。
- 通过比较标准DNA分子量标记和酶切产物，可以确定酶切位点的位置。
基因工程实验2：质粒DNA的酶切及电泳鉴定
• 星号活力*
二、实验原理——琼脂糖凝胶电泳
• 1、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖加热溶解后冷却，形成孔径结构，成为良好的电泳 介质。其孔径大小由琼脂糖的浓度决定。
• 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强； • 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 kb~50 kb之间，常 用0.3%~2%浓度的琼脂糖凝胶，可分辨300 bp~5000 bp 的DNA片段。 • 低熔点（LMP）琼脂糖，熔点为62℃~65℃的琼脂衍生物， 一旦熔解，可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久， 在25℃下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖 可用来回收DNA分子，用于DNA片段的制备电泳。
四、实验步骤
• 1、质粒DNA的酶解（单酶切）
EcoR I 酶切位点：G’ AATTC
2、琼脂糖凝胶电泳
1、 0.8%琼脂糖凝胶的制备：称取0.16 g琼脂糖，置于锥形 瓶中，加入20 mL 0.5*TBE稀释液。（一个制胶板的量） 加热直至琼脂糖溶解。摇匀，冷却至60℃（不烫手），加 入溴化乙锭1μL （终浓度0.5 μg/mL）充分摇匀。 2、胶板的制备： 取有机玻璃内槽，洗净（注意保护电极丝）、晾干。 将有机玻璃内槽置于一水平位置，插好梳子。 将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒在有机玻璃 内槽上，注意排气泡，使整个有机玻璃板表面形成均匀的胶 层。室温下静置，待凝固完全后，轻轻垂直拔出梳子。 用滴管将样品槽内注满TBE稀释液以防止干裂。制备好胶 板后将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中使用。 3、加样(见下表)
•（5）电泳缓冲液 •目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和 TPE •（6）EB
三、实验材料
• 1、仪器和材料 • 电泳仪，电泳槽，制胶板，锥形瓶(100 mL或 50 mL)，紫外检测仪/凝胶成像系统，一次性 手套，Ep管，取液器及无菌吸头，水浴锅 • 2、试剂 • (1) 质粒pMD18-T DNA • (2) DL2000 Plus • (3) EcoRI酶 (EcoRI酶解反应缓冲液10×) • (4) 琼脂糖 • (5) 溴乙锭(10 mg/mL贮藏液) • (6) TBE缓冲液(0.5×) • (7) 酶反应终止液(10×)
酶切鉴定实验报告
酶切鉴定实验报告酶切鉴定实验报告引言：酶切鉴定是一种常用的分子生物学技术，通过酶切作用将DNA分子切割成特定的片段，从而确定DNA的序列和结构。
本实验旨在通过酶切鉴定技术，对DNA进行切割并进行分析，以进一步了解DNA的特性和应用。
材料与方法：实验所需材料包括DNA样品、限制性内切酶、缓冲液、电泳仪等。
首先，将DNA样品与限制性内切酶和缓冲液混合，反应一段时间后，将反应产物进行电泳分离。
接着，通过电泳仪观察DNA片段的迁移距离，并与已知的DNA标准进行对比，从而确定DNA的大小和序列。
结果与讨论：实验结果显示，经过酶切作用后，DNA样品被切割成多个片段。
通过电泳分离，我们观察到这些片段在凝胶上形成了明显的条带。
根据条带的迁移距离，我们可以初步确定DNA片段的大小。
进一步分析发现，不同的限制性内切酶对DNA的切割方式各不相同。
有些酶会将DNA切割成等长的片段，而有些酶则会产生不等长的片段。
这是由于限制性内切酶对DNA的特定序列具有识别和切割的能力。
通过比较不同酶切产生的片段大小，我们可以推断出DNA的序列和结构。
此外，我们还发现不同的DNA样品在酶切鉴定实验中表现出不同的特点。
有些DNA样品在特定的酶切条件下会产生多个片段，而有些则只会产生少数片段。
这可能是由于DNA样品中存在不同的限制性内切酶切割位点或序列变异导致的。
通过进一步的研究，我们可以深入了解这些DNA样品的特性和变异情况。
酶切鉴定技术在生物学研究和医学诊断中具有广泛的应用。
例如，在基因工程领域，科学家们可以利用酶切鉴定技术对重组DNA进行构建和验证。
通过切割和连接不同的DNA片段，他们可以构建出具有特定功能的重组DNA，并用于生物制药和基因治疗等领域。
此外，酶切鉴定技术还可以用于检测和鉴定病原微生物的DNA，从而帮助医生进行疾病的诊断和治疗。
结论：本实验通过酶切鉴定技术对DNA进行了切割和分析，初步确定了DNA的大小和序列。
通过观察不同酶切产生的DNA片段，并与已知的DNA标准进行对比，我们可以进一步了解DNA的特性和应用。
质粒dna酶切实验报告
质粒dna酶切实验报告实验报告：质粒DNA酶切实验一、实验目的1. 熟悉质粒DNA的抽提方法及质量检测方法。
2. 掌握酶切反应中各种试剂的使用方法和浓度。
3. 学习构建质粒的操作技术，合理选择酶切酶和酶切条件，成功制备目标DNA 片段。
二、实验原理质粒是宿主细胞负责复制、分离和基因表达的非必需DNA分子，通常还携带有特定的基因片段。
酶切反应是一种通过酶解水解代表性结构的方法，主要应用于DNA检测、分析和改造等方面。
在质粒DNA酶切实验中，需要先将质粒DNA利用DNA抽提试剂提取，之后与适当的酶切酶混合进行酶切反应，最终得到目标DNA片段。
三、实验步骤1. 取200µl E.coli DH5α预菌液，离心5min，弃去上清液，用PBS洗菌2次。
2. 加入200µl胰蛋白酶，37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
3. 加入200µl重组核酸缓冲液，同样37°C水浴混合反应5min，离心1min，上清液弃掉。
4. 加入50µl重组蛋白酶K，65°C水浴下混合反应50min，离心5min（13000r/min），上清液弃掉。
5. 加入50µl除菌水，65°C混匀5min后，离心5min，上清液收集起来，质粒DNA抽提完成。
6. 按照要求将质粒DNA加入载体质粒pUC19中，加入合适的限制酶进行酶切反应。
7. 通过琼脂糖凝胶电泳法将分子量合适的目标DNA片段筛选出来。
四、实验结果本次实验成功提取了质粒DNA，并利用限制酶EcoRI和BamHI进行了酶切反应。
最终，经琼脂糖凝胶电泳检测，成功得到目标DNA片段，质量均匀、纯度高。
五、实验总结本次实验通过对质粒DNA的抽提和酶切反应，加深了对质粒结构及酶切法原理的理解，并提高了实验操作的技术能力及分析数据的能力。
在今后的实验中，将继续加强实验操作，探究更多质粒DNA的构建与酶切方法，为基因检测及分析领域提供更多有效的技术支持。
3.质粒DNA的限制性酶切鉴定-2012
EcoRI
BamHI
37℃
内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜 立即放置于-20℃保存。
【四、实验步骤】
1、在一个洁净的0.5 ml离心管中混匀下列反应物： 反应物 灭菌水 体积（µl） 11
10×Buffer
质粒DNA
2
5 1 20
EcoR I,BamH1
总计
2、将反应物置于37℃水浴,2h。 3、琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果。
【三、实验仪器、材料与试剂】
（一）实验仪器 微量移液器 微型离心机 恒温水浴锅 （二）材料和试剂 重组质粒pGADT7X(7988+300bp),pGBKT7-X（7300+300bp） EcoRI,BamHI及其酶切缓冲液 H2O
思考题
如 果 一 个 DNA 酶 解 液 在 电 泳 后 发 现 DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能 是什么原因？
实验三 重组质粒DNA的限制性 酶切鉴定
【一、实验目的】
学习通过限制性酶切法鉴定阳性克隆的方 法原理与技定位点，并产生 特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利 于DNA片段再连接。 限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后 就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段 在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目； 从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差 别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移 率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知 DNA的相对分子质量。
实验三 质粒DNA的酶切鉴定课件PPT
Asp718I 5’-G GTACC-3’ 3’-CCATG G-5’
Kpn I 5’-GGTAC C-3’ 3’-C CATGG-5’
2021/3/10
10
（2）同尾酶(Isocaudamers）
同尾酶 ( Isocaudamers ) :识别的序列不同，但能切出 相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等
Enzyme
Sequence Isoschizomers
Acc65I AhaIII
GGTACC CCATGG
c) 平末端 如, Sma I 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’
2021/3/10
8
同列裂酶和同尾酶
（1）同裂酶（Isoschizomers)
同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也 可以不同，来源不同的酶。
① 完全同裂酶：
识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ 和Hsu I。
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’ 3’-TTCGAA-5’
2021/3/10
9
② 不完全同裂酶：
识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。
Xma I 5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
3’-CCTAGG-5’
3’-CGCCGGCG-5’
2.呈回文结构(palindrome)；
3.旋转对称性；
EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。
Fok I 5’-GGATGNN -3’ 3’-CCTAC NN-5’ 外侧，产生3’-端突起
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实验材料和试剂
实验材料： 玉米基因组DNA 实验试剂： • BamH I 酶及其酶切缓冲液：购买成品。 • SalI酶及其酶切缓冲液：购买成品。 • 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂 糖均可。
实验仪器
恒温水浴锅
实验步骤
EP管编号
反应体系 20μL酶液 DNA 15μL BamHⅠ 1μL SalⅠ 1μL 10×BufferT 3μL
实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切
实验原理
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制 性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特 异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶可分为三类
限制性内切 酶 Ⅰ类
酶分子
识别位点
切割位点
限制作用是 否需用 ATP
Ⅱ类
三 亚 基 双 二分非对称 至少在识别 功能酶 位 点 外 1000bp 内切酶与甲 4-6bp, 大多 在识别位点 基化酶分子 数为回文对 中或靠近识 称结构 不在一起 别位点无特 异性 二亚基双功 5-7 bp 非对 在识别位点 能酶 称 下游 2426bp
2.
3.
4.
思考题
如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被酶切或者酶切不完全 , 你认为可能是什么
原因？
Yes
No
Ⅲ类
Yes
Ⅱ类限制性内切酶
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切 割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG3’ )；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出 末端的 DNA 片段称粘性末端，如 EcoR Ⅰ切割识别序列 后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
1.
限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。 但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加 2-3倍，甚至更多， 反应时间也要适当延长。
酶切时所加的 DNA溶液体积不能太大，否则 DNA溶液中其他成分 会干扰酶反应。 许多实验制备的 DNA 不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应 液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质 可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应 缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在 50%的甘油中，实 验中，应将反应液中甘油浓度控制在 1/10之下，否则酶活性将受影 响。
用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底
混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h
电泳检测
对质粒DNA酶切反应
限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA加 1单位酶 , 消化 1-2h 。但要完全酶解
则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚 至更多，反应时间也要适当延长。
电泳检测示例
实验注意事项