DNA的酶切鉴定
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1.
限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。 但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加 2-3倍，甚至更多， 反应时间也要适当延长。
酶切时所加的 DNA溶液体积不能太大，否则 DNA溶液中其他成分 会干扰酶反应。 许多实验制备的 DNA 不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应 液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质 可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应 缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在 50%的甘油中，实 验中，应将反应液中甘油浓度控制在 1/10之下，否则酶活性将受影 响。
Yes
No
Ⅲ类
Yes
Ⅱ类限制性内切酶
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切 割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG3’ )；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出 末端的 DNA 片段称粘性末端，如 EcoR Ⅰ切割识别序列 后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
实验材料和试剂
实验材料： 玉米基因组DNA 实验试剂： • BamH I 酶及其酶切缓冲液：购买成品。 • SalI酶及其酶切缓冲液：购买成品。 • 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂 糖均可。
实验仪器
恒温水浴锅
实验步骤
EP管编号
反应体系 20μL酶液 DNA 15μL BamHⅠ 1μL SalⅠ 1μL 10×BufferT 3μL
实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切
实验原理
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制 性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特 异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶可分为三类
限制性内切 酶 Ⅰ类
酶分子
识别位点
切割位点
限制作用是 否需用 ATP
Ⅱ类
三 亚 基 双 二分非对称 至少在识别 功能酶 位 点 外 1000bp 内切酶与甲 4-6bp, 大多 在识别位点 基化酶分子 数为回文对 中或靠近识 称结构 不在一起 别位点无特 异性 二亚基双功 5-7 bp 非对 在识别位点 能酶 称 下游 2426bp
2.
Fra Baidu bibliotek
3.
4.
思考题
如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被酶切或者酶切不完全 , 你认为可能是什么
原因？
用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底
混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h
电泳检测
对质粒DNA酶切反应
限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA加 1单位酶 , 消化 1-2h 。但要完全酶解
则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚 至更多，反应时间也要适当延长。
电泳检测示例
实验注意事项
限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。 但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加 2-3倍，甚至更多， 反应时间也要适当延长。
酶切时所加的 DNA溶液体积不能太大，否则 DNA溶液中其他成分 会干扰酶反应。 许多实验制备的 DNA 不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应 液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质 可能干扰随后的反应。 市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应 缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在 50%的甘油中，实 验中，应将反应液中甘油浓度控制在 1/10之下，否则酶活性将受影 响。
Yes
No
Ⅲ类
Yes
Ⅱ类限制性内切酶
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切 割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG3’ )；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出 末端的 DNA 片段称粘性末端，如 EcoR Ⅰ切割识别序列 后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
实验材料和试剂
实验材料： 玉米基因组DNA 实验试剂： • BamH I 酶及其酶切缓冲液：购买成品。 • SalI酶及其酶切缓冲液：购买成品。 • 琼脂糖(Agarose)：进口或国产的电泳用琼脂 糖均可。
实验仪器
恒温水浴锅
实验步骤
EP管编号
反应体系 20μL酶液 DNA 15μL BamHⅠ 1μL SalⅠ 1μL 10×BufferT 3μL
实验三 DNA限制性内切酶 消化酶切
实验原理
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制 性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特 异位点上，并切割双链DNA。
限制性内切酶可分为三类
限制性内切 酶 Ⅰ类
酶分子
识别位点
切割位点
限制作用是 否需用 ATP
Ⅱ类
三 亚 基 双 二分非对称 至少在识别 功能酶 位 点 外 1000bp 内切酶与甲 4-6bp, 大多 在识别位点 基化酶分子 数为回文对 中或靠近识 称结构 不在一起 别位点无特 异性 二亚基双功 5-7 bp 非对 在识别位点 能酶 称 下游 2426bp
2.
Fra Baidu bibliotek
3.
4.
思考题
如果一个 DNA 酶解液在电泳后发现 DNA 未被酶切或者酶切不完全 , 你认为可能是什么
原因？
用手指轻弹管壁使溶液混匀，使溶液集中在管底
混匀反应体系后，37℃水浴保温2-3h
电泳检测
对质粒DNA酶切反应
限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA加 1单位酶 , 消化 1-2h 。但要完全酶解
则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚 至更多，反应时间也要适当延长。
电泳检测示例
实验注意事项