第二章 生物制药工艺技术基础3

（二）动物细胞培养条件 营养、pH及温度是细胞生长所要求的重要条件， 培养细胞的最适温度为37℃±0.5℃，偏离此温度， 细胞的正常生长及代谢将会受到影响。细胞培养的最 适pH 7.2～7.4间。 细胞生长代谢离不开气体，培养瓶中的O2与CO2 ， 是以保证细胞体内代谢活动的进行，但作为代谢产物 CO2 在培养环境中还有调节pH的作用， CO2培养箱 可以维持一定比例的CO2 ，使培养环境中的氢离子浓 度保持恒定。
⑥具有良好的光学透明性，适用在倒置显微镜下观 察细胞在载体上的生长情况；
⑦基质的性质最好是软性的，避免在搅拌中由于载 体互相磨擦而损伤细胞； ⑧可耐120℃高温，便于采用高压蒸汽灭菌；
⑨经简单的适当处理后，可反复多次地使用；
⑩原料充分，制作简便，价廉。
（五）动物细胞的种质保存
动物细胞种质保存的形式有组织块、细胞悬浮物及 细胞单层培养物等。保存方式有常温、低温及超低温 冰冻法3种。 目前超低温冰冻法是保存种质细胞最有效和最重要 的方法。 常温法是将特定种质形式保存于20～30℃的方法， 如人肾及猴肾细胞单层于25～30℃可保存1个月以上， 人二倍体细胞单层可保存两周，中间换液可保存30d以 上，若生长液中小牛血清减至0.5％～l％，于37℃培养 并有规律地更换培养基，则可长期保存。
④无致癌性。二倍体细胞通常由胚胎组织中获取。
3、转化细胞系
这类细胞常常因染色体的断裂而变成异倍体，从 而失去了正常细胞的特点，而获得无限繁殖的能力。 这种转化进程可以是自发的，也可以通过人为的方法 进行的转化。
另外，从动物肿瘤组织中建立的细胞系也是转化 细胞，转化细胞具有无限生命力，倍增时间较短，培 养条件要求较低，适于大规模生产培养 。
在保证细胞渗透压的情况下，培养液里的成分要 满足细胞进行代谢所需要的各种组成，如各种必需氨 基酸和非必需氨基酸、维生素、碳水化合物及无机 盐类等，只有满足了这些基本条件，细胞才能在体外 正常存活、生长。
另外，在单克隆抗体实验培养中加入一些饲养细 胞，或在换液时留一些原培养液，也有利于细胞生长。 各种合成培养基给细胞培养提供了方便，但单纯采 用合成培养基，细胞还不能很好地增殖，甚至细胞不 贴壁生长，因此使用时常要添加5％～10％小牛血清， 对杂交瘤细胞的培养添加胎牛血清要达l0％～20％，
（六）单克隆抗体技术
l、单克隆抗体的制备原理 B细胞群受抗原刺激后能产生针对抗原决定簇的特 异性抗体，一个机体可产生多达100万种特异性不同 的抗体。 但一个B细胞却只能分泌一种特异性抗体。每个杂 交瘤细胞只分泌一种特异性抗体，培养单个杂交瘤细 胞，使之无性繁殖形成细胞集落（称之为克隆）。同 一个克隆的杂交瘤细胞基因相同，合成并分泌的特异 性抗体质地均一。这种抗体称之为单克隆抗体。
（三）动物细胞大规模培养方法
动物细胞培养的方法，一般可根据培养细胞的种 类分为原代细胞培养和传代细胞培养；又可根据培养 基的不同分为液体培养和固体培养；还可根据培养容 器和方式的不同分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、 微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养等。
但从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可 分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁－悬浮培养。
用牛淋巴液体外循环法生产单克隆抗体的步骤：
①在无菌条件下，自牛颈部引出牛胸导管、淋巴 管至无菌室；
②使淋巴细胞与淋巴液分开；
③将滤出的细胞与部分淋巴液送回牛静脉管内， 无细胞淋巴液经超滤后进入培养罐进行循环，并按比 例加入培养液（培养液应通过一层微孔半透膜过滤后 再进入培养罐）。
杂交瘤细胞培养产生的单克隆抗体培养液的20％ 通过另一端的半透膜流出培养罐，每日收获单克隆抗 体，其他80％再循环。
单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等 工艺过程。
（1）杂交瘤细胞的大规模培养
单克隆抗体问世后，已研究了多种适宜于大规模 培养杂交瘤细胞的生物反应器（细胞培养罐）及其培 养基。目前比较成熟的发酵罐有气升式或深层发酵罐， 中空纤维培养罐，微囊或滴珠发酵罐。
牛 淋 巴 液 大 规 模 培 养 技 术 （ mass culturing technique，MCT）也是较成熟的适合于杂交瘤细胞大 规模培养的方法。
③ 能够保持较好分散性的离体细胞或较小细胞团 的液体培养，称为“悬浮培养” ；
④ 离体器官的培养，如茎尖、根尖、叶片、花器 官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟 果实的培养，称为“器官培养” ； ⑤ 未成熟或成熟的胚胎的离体培养，则为“胚胎 培养”。 2、悬浮培养
悬浮培养是指在液体培养基中，能够保持良好分 散性的细胞和小的细胞聚集体的培养。在此培养条件 下组织水平较低。
② 减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微 生物污染的危险；
③ 供应充足、稳定；
④ 细胞产品易于纯化；
⑤ 避免了血清中某些因素对某些细胞的毒性；
⑥ 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便 于实验结果的分析。
无血清培养基是以合成培养基为基础加入各种细 胞生长所需的添加因子，有利于细胞生长的因子和 微量元素等。
（2）单抗的分离纯化
无论用动物腹水，还是用发酵罐生产单克隆抗体， 产品的分离纯化均十分重要。目前常用的方法有超滤 法、盐析法，离子交换层析法、等电聚焦层析法、葡 萄球菌蛋白A层析法、HPLC、DEAF － C层析法、 葡聚糖或琼脂糖法等。
（3）单克隆抗体的制剂技术
即将纯化的单克隆抗体制备成诊断试剂或新药。 常用于制备单克隆抗体制剂的物质有高聚物、脂质体、 聚乙二醇、细胞膜等。导向高聚物是表面包裹着特 异单克隆抗体的高聚物小珠，可用于移植，癌症治疗 和体内定位诊断。
淋巴细胞杂交瘤技术是将在体外不能长期生存的 免疫淋巴细胞与在体外能迅速增殖的骨髓瘤细胞在聚 乙二醇（PEG）作用下融合而产生杂交瘤细胞。
所得的杂交瘤细胞承袭了两组亲代细胞的遗传性， 既保存了骨髓瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力，又 继承了免疫淋巴细胞合成与分泌抗体和淋巴因子的能 力。 T淋巴细胞主司细胞免疫，分泌淋巴因子。已知有 40多种淋巴因子。T细胞与骨髓瘤细胞融合可产生能 分泌淋巴因子的T细胞杂交瘤细胞。 B细胞主司体液免疫，能分泌特异性免疫球蛋白 （抗体），B细胞与骨髓瘤细胞融合则产生能分泌特 异性抗体的B细胞杂交瘤细胞。
理想的微载体需具备如下一些条件：
① 微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适用 细胞附着、伸展和增殖；
②微载体的材料无毒性。不仅要求对细胞的生长无 毒性，而且也不会产生影响产品和人体健康的有害因 子；
③微载体的材料是惰性的，不与培养基成分发生化 学变化，也不会吸收培养基中的营养成分； ④微载体的比重在1.030～1.045g／ml，使载体在低 速搅拌下就可悬浮，而在静止时又可很快沉降，便于 换液和收获； ⑤粒径在60～250μ m（溶胀后）之间为好，并要尽 可能地均一，差异不大于20 μ m 。这样有利于细胞均 匀分布在各微载体表面；
二、动物细胞工程制药技术基础
（一）动物细胞的获得 供生产生物技术药物的动物细胞有3类； 1、原代细胞 原代细胞是直接取自动物组织器官，经过分散、 消化制得的细胞悬液。 2、二倍体细胞系
原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而由多种细 胞成分的组织中挑选强化具有一定特性的细胞株。
其特点是：
①染色体组织仍然是2n的模型； ②具有明显贴壁依赖和接触抑制的特性： ③具有有限的增殖能力，一般可连续传代培养50 代；
2、贴壁培养
贴壁培养是必须让细胞附在某种基质上生长繁殖 的培养方法：它适用于一切贴附依赖性细胞（贴壁细 胞），也适用于兼性贴壁细胞。
该方法优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使 用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌流培 养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻 烦。
需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易 均一，传质和传氧较差，这些不足常常成为扩大培养 的“瓶颈”。 被普遍采用的贴壁培养方法是固定床式生物反应器， 但由于该反应器中传质和传氧常会出现梯度式不均一 现象，故放大常受到限制。
单克隆抗体有特异性强、免疫滴度高、质地均一、 反应灵敏、可标准化等特点，还可进行工业化大生产。
单克隆抗体可用于疾病诊断、体内显像定位检查、 体内治疗或靶向治疗、食品与环境监测以及天然蛋白 与基因工程产品的提纯等。世界各国已制备万种单克 隆抗体。现已有百余种诊断试剂和数种治疗剂投放市 场。
2、单克隆抗体的工业化生产
在 深 冻 过 程 中 ， 先 配 制 含 8 ％ ～ l0 ％ DMSO 、 15 ％～20％小牛血清及适量NaHCO3 的保护液，再将细 胞培养物消化与分散，离心收集细胞，按5×106个细 胞／ml浓度添加保护液，按lml／支分装于安瓿中， 0～4℃放置2～4 h，移至－70℃冰箱中或置于液氮中 保存。保冻细胞在继代培养前需复苏，复苏时将安瓿 取出，包裹4层纱布浸入40℃水中，除去纱布后再浸 入水中融化40s，混匀后立即接种l～2（100ml培养 瓶），并按1～2ml→4ml→8ml缓慢而依次加入生长 液，最终加至20ml。 若保护液含DMSO可直接用于接种，但其浓度应降 至l％以下。若保Fra Baidu bibliotek液含甘油，则应离心除去甘油， 以防影响细胞增殖，加生长液后可通过台酚蓝染色法 计算活细胞数，然后用于培养。
其使用有几方面：
① 提供细胞生长所需的条件生长因子和激素。 ②提供细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子； ③提供识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋 白；
④提供细胞生长所需的脂肪酸和微量元素。
为适应大规模细胞培养，发展高技术生物制品， 近代还大力研究无血清培养基。 无血清培养基具有以下优点： ①提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清 批之间差异的影响；
1、悬浮培养 顾名思义，所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培 养基内生长增殖。它适用于一切种类的非贴壁依赖性 细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。
该培养方法的优点是操作简便，培养条件比较均 一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设 各的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经 验。
目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅 拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。
低温法是将特定种质形式保存于4℃的方法，如原 代猴肾细胞悬浮于4℃生长液中，可保存3周。
超低温冰冻法系将种质细胞保存于－70℃以下冰 箱或液氮中的保存方法。在此条件下，种质可长期保 存。但是本法需用保护剂，常用的保护剂有二甲亚砜 （DMSO）及甘油等。
甘油使用浓度为5％～20％，DMSO使用浓度为5 ％～12.5％。DMSO因起作用更快，毒性及黏度更低， 膜透性更高，抗冻伤能力更强而应用最多，细胞在 DMSO中30s左右即达到内外平衡，但在甘油中2h才 能平衡。
三、植物细胞工程制药技术基础
（一）植物组织和细胞培养的基本概念 1、植物组织细胞无菌培养技术类型 植物组织和细胞是指在无菌和人工控制的营养 （培养基）及环境条件（光照、温度等）下，研究植 物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。 植物无菌培养技术有以下几类： ① 幼苗及较大植株的培养，即为“植物培养” （plant culture）； ② 从植物各种器官的外植体增殖而形成的愈伤组 织的培养叫做“愈伤组织培养” ；
3、细胞培养
细胞培养是指利用单个细胞进行液体或固体培养， 诱导其增殖及分化。其目的是为了得到单细胞无性繁 殖系。 4、分生组织培养 分生组织培养又称生长锥培养，是指在人工培养 基上培养茎端分生组织细胞。分生组织如茎尖分生组 织的部位仅限于顶端圆锥区，其长度不超过1mm。
研究表明，通过组织培养技术进行植物的快速繁 殖试验往往并没有利用这么小的外植体，而是利用较 大的茎尖组织，通常包括l～2个原基。
贴壁培养扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上 消化下来。它们的作用主要是使细胞间质和一些促进 细胞贴附的蛋白因子水解，使细胞从基质分离成单个 细胞。
3、微载体培养 微载体培养是使细胞贴附在微小颗粒载体上，它创 造了相当大的贴附面积，供细胞贴附生长、增殖。载 体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使细胞自 由悬浮于培养基内，充分发挥悬浮培养的优点。