犬细小病毒VP2基因
犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化
１ ０ ｍ ｌｍＬ Ｉ Ｔ 诱 导 ６ ｈ时 条件 下 蛋 白 表 达 量 最 高 。Ｓ Ｓ Ｐ ＧＥ电 泳 检 测 的 纯 化 目的 蛋 白约 为 ９ Ｄ ， 预 ． ｍｏ／ Ｇ Ｐ Ｄ －Ａ ０ｋ ａ与 计 大小 一致 。ＶＰ ２基 因融 合 蛋 白 的优 化 表 达 和 纯 化 为 研 究 犬 细 小 病 毒 亚 单 位 疫 苗 奠 定 了基 础 。 关 键 词 ： 犬 细 小 病 毒 ； ２基 因 ； 合蛋 白 ； 化 与 纯 化 ＶＰ 融 优
犬 细 小病 毒 ＶＰ ２基 因 原核 表 达 条 件优 化 与 蛋 白纯化
陈 胜 男 ， 素 贞 ，翟 少 伦 ， 子 健 马 简
（ 疆 农 业 大 学 动 物 医学 学 院 ， 鲁 木 齐 新 乌 ８０ ５ ） ３ ０ ２
摘
要 ： 为 了 提 高 犬 细 小 病 毒 ＶＰ ２基 因 在 大 肠 杆 菌 Ｅ．ｃ ｌ ＢＬ １（ ｏｉ ２ ＤＥ３ 中 的表 达 量 ， 过 改 变 诱 导温 度 、 导 时 ） 通 诱
ｐａ ｍｉ ｃ ｅ ｉｈ ａｃ ｌ ， Ｌ２ ＤＥ３ ｌｓ ｄＥｓｈ ｒｃ ｉ ｏ ｉ Ｂ １（ ）ｗａ ｈ ｐ ｉ ａ ｅ ． ｍｍｏ ／ ＰＴＧ ｒ ｎ ｕ ｅ ｏ ｔ ｓｔ ｅｏ ｔ １ｗｈ ｎ １ ０ ｍ ｌｍＬ Ｉ ｗｅｅ ｉｄ ｃ ｄ ｆ ｒ６ ｈ ａ
３ ℃． ５ Ｆｕｓｏ ｏ ｅｎ ｐｕ ｉｉｄ ｂｙ Ｇｌ ｔ ｔ ｏ ｐ ｒ ｓ Ｂ ｆｉ ｉｙ ｃ ｌ ｍ ｎ ｗａ ｂｏｕ Ｄａ ｗｈ ｃ ｒ ｉ ｎ ｐｒ ｔ ｉ ｒｆｅ ｕ ａ ｈｉ ｎｅ Ｓｅ ｈａ ｏ ｅ ４ ａ ｆｎ ｔ ｏ ｕ ｓａ ｔ９０ ｋ ｉ ｈ ｗｅ ｅ
ｓｏ ｏ ｅｎ ｓ ｔｔ ｅ ｂ ｓ ｏ ｔ ｙ ｎｇ ｓ — ｎｉ ａ ｃ ｎ ｆＣＰＶ ． ｉ ｎ ｐｒ ｔ ｉ ｅ ｈ ｙ ｗｏｒ ｓ Ｃａｎ ｎ ｄ： ｉ ｅｐａｒ ｖｉ ｕｓ；Ｖ Ｐ２；ｆ ｉ ｎ ｐｒ ｔ ｉ ｏ ｔｍ ｉａ ｉ ｎ ｒｆｃ ｔｏ ｖｏ ｒ ｕｓｏ ｏ ｅｎ； ｐ ｉ ｚ ｔｏｎ ａ ｄ ｐｕ ｉｉａ ｉ ｎ
犬细小病毒DD株的分离鉴定和VP2基因序列分析
Ａ ｓ ａｔ Ａ ｓ ａｎ ｏ ａ ｉｅ ｐ ｒｏｉ ｓ Ｃ Ｖ） ａ ｓｌ ｅ ｒｍ ｂｏｄ ｅｅ ｆａ ｌ ｐ ｐ ｙ ｓｓｅｔ ｆ ｂ ｔ ｃ ： ｔ ｉ ｆｃｎｎ ａｖｖｒ （ Ｐ ｗ ｓｉ ａ ｄ ｆ ｌ ｙ ｆｃｓｏ ｎ ｉ ｕ ｐ ｕｐｃｅ ｏ ｒ ｒ ｕ ｏｔ ｏ ｏ ｌ ｄ ｐｒｏｉ ｓｉ ｅｔ ｎ ｅ ｉｇ ｈ ｔ ｉ，ｄｓ ｎｔｄａ Ｐ ａｖｖ ｕ ｆｃ ｏ ｓｉ Ｂ ｉｎ ．Ｔ ｅｓ ａ ｒ ｎ ｉ ｎ ｊ ｒ ｎ ｅｉ ａ ｓＣ Ｖ—Ｄ ｗ ｓｉ ｌ ｅ ｙｉｏｕａｉｇＣ Ｆ ｅ ｓ ｎ ｇ ｅ Ｄ， ａ ｏ ｔｄｂ ｃｌｔ Ｒ Ｋ ｃｌ ｓａ ｎ ｎ ｌｉ
ｓ ｎ ｈ ｏ ｉｍ ｎ ａ ｄ ｎ ｉ ｅ ｓ ｓ ｒ ｔｐ Ｐ 一２ ｙ Ｐ Ｒ ，ｔ ｅ ＨＡ ，Ｉ Ａ ， ｌｃ ｒ ｎ ｍｉｒ ｓ ｏ ｙ ｏ ｓ ｒ ａｉ ｎ ａ ｄ ｙ ｃ ｒ ｎ ｓ ａ ｄ ｗ ｓｉ ｅ ｔ ｄ ａ ｅｏ ｙ ｅ Ｃ Ｖ ｉ ｆ ａｂ Ｃ ｈ Ｆ ｅｅ ｔ ｃｏ ｃ ｐ ｂ ｅｖ ｔ ｎ ｏ ｏ
［ 关键词 ］ 犬细小病毒 ；Ｐ ； Ｖ ２ 分离； 鉴定
Ｉ ｏａ ｉｎ ｎ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔｏ ｆ Ｃａ ｉ ｒ ｏ ｉｕｓＤＤ ｔ ａｎ ｎｄ ｓ ｌ ｔｏ ａ ｄ Ｉ ｅ ｔｆ ａ ｉ ｎ ｏ ｎ ｎｅ Ｐａ ｖ ｖｒ ｉ Ｓｒｉ ａ
Ｓ ｑ ｅ ｃ ａｙ ｉ ｆｔ ｅ ＶＰ ｎ ｅ ｕ ｎ ｅ Ａｎ ｌ ｓｓｏ ２ Ｇｅ ｅ ｈ
ｓｑ ｅ ｃｎ ｆ ２ｇ ｎ ．Ａ ｕ ｉｕ ｌ ｅ ｕ ｎ ｉｇｏ ＶＰ ｅ ｅ ｎｑ ｅＩ ｅ一３ ４ ｉ ２ ｏ ２ ｎＶＰ ｆＤＤ ｓ ａｎｗａ ｕ ｄ，ｃ ｎｒｓ ｎ ｒ ｔ ｉ ｓｆ ｎ ｒ ｏ ｏ ｔ ｔ ｇｔ ａＴ ｙ一３ ４ ｉ ｅＶＰ ａｉ ｏ ２ ｎｔ ２ ｈ
犬细小病毒VP2基因序列分析及BJ-1株的分离鉴定
本研究在对 ＶＰ２基因进 行 分 析 的 基 础 上，对 鉴 定为 Ｎｅｗ ＣＰＶ２ａ的北京毒株进行分离和病毒相 关 特性鉴定，有 助 于 了 解 和 掌 握 目 前 ＣＰＶ 的 流 行 情 况，为更好地防控 ＣＰＶ 提供参考。
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 临床 样 本 临 床 样 品 来 自 北 京 和 山 东 两 地 的宠物医院，病 犬 临 床 症 状 为 呕 吐、腹 泻 等，临 床 疑
似为 ＣＰＶ 感染，同时采集病犬的粪便样品备用。 １．１．２ 细 胞 与 主 要 试 剂 Ｆ８１ 细 胞，本 实 验 室 保 存；ＣＰＶ 单 克 隆 抗 体，ＩＮＧＥＮＡＳＡ 公 司 产 品；Ｇｏａｔ ａｎｔｉＭｏｕｓｅＩｇＧ （Ｈ ＋Ｌ）Ｈｉｇｈｌｙ ＣｒｏｓｓＡｄｓｏｒｂｅｄ ＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎｔｉｂｏｄｙ，ＦＩＴＣ（货 号 Ａ１６０７９），英 潍 捷 基（上 海 ）贸 易 有 限 公 司 产 品；２×Ｅｓ犜犪狇 Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，康为世纪生物 制 品 有 限 公 司 产 品；粪 便 基 因 组 提取试剂盒、质 粒 提 取 试 剂 盒、ＤＮＡ 片 段 回 收 试 剂 盒、Ｔｏｐ１０ 感 受 态 细 胞 和 细 菌 基 因 组 ＤＮＡ 提 取 试 剂盒，天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 产 品；ＤＮＡ 标 准 ＤＬ２０００，ＴａＫａＲａ 有 限 公 司 产 品；ＤＭＥＭ、胎 牛 血
犬细小病毒VP2基因测序分析
与Ｐ Ｃ Ｒ检 测结果 符合 率达 ７ ６ ． ９ ； ３个试验 毒株之 间 ＶＰ ２基 因 同源性 达 ９ ６ ． ５ ～９ ７ ． ３ ， 与参 考毒株 同源
性为 ９ ５ ． ２ ～９ ６ ． ８ ； 由遗传进 化树 可见 ， 与 国 内分 离毒 株 的亲缘 性略 高于 国外分 离株 。结果表 明 ， Ｃ Ｐ Ｖ 抗 原 快速检 测试 剂盒 与 Ｐ Ｃ Ｒ 法符合 率较 高 ， ３个试验 毒株 与 国 内外流 行毒株 之 间差异性 不 大。 关键 词 ： 犬细 小病毒病 ； ＶＰ ２基 因； 聚合 酶链 反应 ； 序 列 分析
（ １ ． 贵 州 大 学 动 物科 学 学 院 ， 贵州贵阳 ５ ５ ０ ０ ２ ５ ； ２ ． 贵州省动物疫病研究室 ， 贵州贵 阳 ５ ５ ０ ０ ２ ５ ；
３ ． 贵阳市黔灵动物医院， 贵州贵阳 ５ ５ ０ ０ ０ ４ ）
摘 要 ： 为 了解 贵 阳市犬细 小病 毒 （ Ｃ Ｐ Ｖ） ＶＰ ２基 因的遗 传 变异 情 况 ， 从 贵 阳 市黔 灵动 物 医院采 集 经 试
Ｅ Ｉ Ｉ Ｓ Ａ 检测 方法 ， 具 有 良好 的 特 异 性 ， 与 常 见 的 犬
病 毒性传 染病 阳性 血清无 交叉 反应 ， 重 复性 良好 ， 与
为了解贵 阳市 Ｃ Ｐ Ｖ ＶＰ ２基因 变异情 况 ， 本研 究 选择 Ｃ Ｐ Ｖ 的 ＶＰ ２ 基 因作 为研 究 对 象 ， 采用 Ｐ Ｃ Ｒ方
我国， Ｃ Ｐ Ｖ 一 ２曾 在 ２ ０世 纪 ８ Ｏ年 代 早 期 流 行 ， 但
ｌ ９ ８ ６年后全 国 范 围 内 主要 以 Ｃ Ｐ Ｖ 一 ２ ａ占优 势 地 位 。 ２ ０ ０ ９年杜强 等Ｌ ４ 用猫 肾（ Ｆ ８ １ ） 细胞 分 离鉴 定 出一 株 细小 病毒 为 Ｃ Ｐ Ｖ一 ２ ａ亚 型 。近 年 来 ， 该 病 的 诊 断 方 法层 出不穷 ， 姜 骞 等＿ ＿ ５ ］ 利 用 重 组 蛋 白建 立 了 间 接
犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析研究的开题报告
犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析研究的开题报告一、研究背景与意义犬科和猫科动物是人类近距离生活的宠物动物，对人类健康具有危害，比如犬瘟热、狂犬病等等。
而细小病毒是引起宠物疾病的重要病原体，犬和猫感染细小病毒后会引起消化道和呼吸道病症，严重时可导致犬、猫死亡。
因此，了解犬科和猫科动物细小病毒的遗传进化，对于防治犬、猫感染疾病具有重要意义。
二、研究目的本研究的目的是通过犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析，探讨其基因型特征以及可能的起源及传播途径。
三、研究方法通过文献调研和实验室测序，收集、比对和分析犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因序列数据，并使用生物信息学工具进行DNA序列的物系和进化树分析，得出遗传演化规律和基因型特征。
四、研究内容1. 犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的收集和比对；2. DNA序列的物系和进化树分析；3. 遗传演化规律分析；4. 基因型特征分析。
五、研究预期结果1. 收集到多个犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因序列数据；2. 通过比对和分析数据，得到细小病毒的物系演化树；3. 发现和分析犬科和猫科动物细小病毒的遗传演化规律和基因型特征。
六、研究难点与解决方案1. 分离株VP2基因序列数据的获取和数据比对的准确性问题；解决方案：对数据源的准确性进行评估，对异常数据进行清理，使用比对软件进行多次比对提高数据的准确性。
2. 如何选择合适的生物信息学工具进行数据分析和处理；解决方案：参考已有研究文献，选择相应工具进行分析和处理，并结合实际情况锤炼。
3. 对犬科和猫科动物细小病毒的遗传进化机制理解不够深入；解决方案：广泛查阅相关研究文献和专家意见，研究原理机制，并创新性地提出自己的见解。
七、研究时间表1. 数据收集和比对（2个月）；2. 生物信息学分析和处理（3个月）；3. 遗传演化规律分析（1个月）；4. 基因型特征分析（1个月）；5. 论文撰写和提交（2个月）。
大理地区犬细小病毒VP2基因变异研究及进化分析
用 同步 法接种到 Ｆ ８ １ 细胞 中分 离、鉴定 、培养 。收毒后提取基 因组 ＤＮ Ａ，并以此为 Ｐ Ｃ Ｒ模板 ；根据 Ｇｅ ｎ ｅ Ｂ ａ ｎ ｋ
己发表 的犬细小病毒 ＶＰ ２ 基 因序 列设 计合 成一对 引物，进行 Ｐ Ｃ Ｒ扩增获得 Ｖ Ｐ ２全序 列基 因 ｌ ７ ５ ５ ｂ ｐ片段 ，并进 行序列 测定。利 用 ＤＮ ＡＳ ｔ ａ ｒ 软件 对 ４ 株 病毒的 Ｖ Ｐ ２ 基 因序 列以及氨 基酸序列进行分析 ，与 Ｇ ｅ ｎ ｅ Ｂ ａ ｎ ｋ上 已发表
ห้องสมุดไป่ตู้
的１ ６ 株 犬细小病毒 比 较， 发现病毒的核苷酸 同源性在 ９ ７ ． ９ ％ ～ ９ ９ ． ９ ％之 间，氨基酸 同源性在 ９ ６ ． ４ ％ ～ ９ ９ ． ９ ％之 间，
总体 同源性在 ９ ８ ％ 以上 ，进化树分析显 示没有 形成明显 的 Ｃ Ｐ Ｖ 中国进化分 枝，表 明 ＶＰ ２基 因变异相对较 少。 同时分 离到的 ４株 Ｃ Ｐ Ｖ病毒又遵循 ２ ａ 亚型 的进化 特征 ，因此确定 目前云南大理地 区犬细小病毒的流行情 况仍
＇ １ ｒ 锄 物幸 蠡 ｌ 设
大理地 区犬细小病毒 Ｖ Ｐ ２基 因 变异研 究及进化分析
李志敏 ，丁福先 ，何 秉宁 ，袁鸿 胜 ，施 瑞华 （ 云 南省 大理 州动物疫 病预 防控 制 中心 ，云 南大理 ６ ７ １ ０ ０ ０ ）
摘
要 ：从 云南大理地 区发病 的松狮 犬、德 国牧羊犬和博美 犬的粪便 内和 国产疫苗 中分 离到 ４株 犬细小病毒 ，
以 ＣＰＶ ＿ ２ ａ为 主 。
关键词 ：犬细小病毒 ；ＶＰ ２基 因；变异研 究；进化分析
中 图 分 类号 ：￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９ ． ２ 文献 标 识 码 ：Ａ 文 章编 号 ： １ ０ ０ ５ ． ９ ４ ４ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ ０ — ０ ０ ７ ０ — ０ ４ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ａ ｎｄ Ｅｖ ｏ ｌ ｕｔ ｉ ｏ ｎ Ａ ｎａ ｌ ｙｓ ｉ ｓ ｏ ｆ
犬细小病毒河南方城株分离及VP2_基因序列分析
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：为了解犬细小病毒的临床流行及变异情况，本研究于河南省方城县采集了8份疑似CPV 感染犬粪便样品，经过PCR 检测、CRFK 细胞增殖培养、透射电镜观察和病毒滴度测定后，对其VP2基因进行序列分析。
结果表明5株分离株为犬细小病毒，病毒滴度分别为10-4.22/0.1 mL （China-HN-01株）、10-3.56/0.1 mL （China-HN-02株）、10-3.78/0.1 mL （China-HN-05株）、10-4.47/0.1 mL （China-HN-06株）、10-4.4/0.1 mL （China-HN-07株）。
VP2基因序列比对和遗传进化树分析结果显示，4株分离株基因型为New CPV-2a ，1株分离株基因型为CPV-2c ，5株分离株与疫苗株的同源性为97.8%~98.7%，与国内外参考毒株的同源性为94.0%~99.0%，4株New CPV-2a 基因型毒株与四川的Canine/China/24/2017株亲缘关系最近，CPV-2c 基因型毒株与蒙古国5-MGL 分离株位于同一分支，与我国河南地区的3株CPV-2c 毒株亲缘关系较远。
对河南方城地区CPV 毒株的分析，为研究CPV 变异株在河南地区的传播和宠物疫病防控提供了理论依据。
关键词：犬细小病毒；分离；VP2基因；进化分析中图分类号：S852.65文献标志码： A文章编号：1674-6422（2023）03-0054-08Isolation and Sequence Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus from Fangcheng, HenanLIN Yuting 1,2, ZHAI Qi 2, ZHAI Shaolun 2, LYU Dianhong 2, ZHOU Xiurong 2, JIA Chunling 2, HUO Wei 2,WEN Xiaohui 2, Wei Wenkang 1,2,3(1. College of Animal Science & Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2. Institute of Animal Health, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong Province, Scientific Observation and Experiment Station of Veterinary Drugs and Diagnostic Techniques of Guangdong Province, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510640, China; 3. Agro-biological Gene Research Center, Guangdong Academy of AgriculturalSciences, Guangzhou 510640, China)收稿日期：2021-01-11基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0501000）；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设专项资金（2019KJ119）；广东省农业科学院学科团队建设（201634TD）；广东省农业科学院院长基金（202024）作者简介：林瑜婷，女，硕士研究生，预防兽医学专业；翟颀，男，助理研究员，主要从事动物疫病诊断技术研究 通信作者：温肖会，E-mail：*******************；魏文康，E-mail：**************犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析林瑜婷1,2，翟 颀2，翟少伦2，吕殿红2，周秀蓉2，贾春玲2，霍 玮2，温肖会2，魏文康1,2,3（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州510225；2.广东省农业科学院动物卫生研究所 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室 农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州510640；3.广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广州510640）2023,31(3):54-61Abstract: In order to investigate the prevalence and variation of Canine parvovirus, 8 fecal samples were collected from dogs suspected of CPV infection from Fangcheng county, Henan province. Five CPV isolates were obtained based on PCR amplifi cation, growth on CRFK cells, transmission electron microscopy and virus titration. The TCID 50 titers of these isolates were 10-4.22/0.1 mL (China-HN-01 strain), 10-3.56/0.1 mL (China-HN-02 strain), 10-3.78/0.1 mL (China-HN-05 strain), 10-4.47/0.1 mL (China-HN-06 strain) and 10-4.4/0.1 mL· 55 ·林瑜婷等：犬细小病毒河南方城株分离及VP2基因序列分析第31卷第3期犬细小病毒病是由细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus ）的犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）感染犬只引起的致命性传染病[1]，该病常以出血性肠炎、白细胞含量显著减少、腥臭血便和严重脱水等为主要临床特征，部分表现为突然死亡的急性心肌炎型[2]。
一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析
种优 势 ， 尽管不 如育肥性 能 明显 。商品 肉兔 半净膛 率和 全净膛率分别 为５ ． Ｉ ３４ ５６ ］ ． ％￣ ５ ％，后腿 比例 高达 ３ ． ９１ ％，显
示 出较 高 的产 肉 能 力 。 在 肉品 质 方 面 ，Ｉ 和 商 品 代 的 熟 Ｉ 系 肉率 高 于Ｉ ， 说 明 保 水 性好 ；剪 切力 值 较 小 ， 肉较 嫩 。 系
；＾：Ｊ：
ｍ
＾：Ｊ： ：Ｊ １
５７ 。Ｉ Ｉ 交 商 品 兔 在 产 肉性 能 上 也 有 一 定 程 度 的 杂 ． ％ ＸＩ杂
装 的加 工。而皮 板品质指标的变异系数均在 ｌ％以下 ，说 Ｏ 明不 同皮张质量 的一致性较高 。
表３ 商品 兔皮 板质 量评 定结 果 （ｍ、分 ） ｃ
６
２１ 年第 １ （ ０１ 期 总第 １８ ） ６期
毒 ，定名为Ｂ Ｙ２ ０ 。对其ＶＰ 基因进行 了扩增测序 ，初 Ｊ ０６ ２
步 确 定 为２ 亚 型 。 对 该 病 毒 的遗 传 特 性 与 演 化 进 行 了研 ａ
显 的细 胞病 变 ，病 变发 生 在接 种后 ５ｈ，表现 为细 胞 圆 ０
山
３ ２
一
株 犬细 小病毒 的分离及Ｖ ２ 因序 列分析 Ｐ基
杨龙峰① 李英 杰① 艾萍萍① 肖胜 南① 韩 柳② 焦万亮① 王建芬① 张延光① 刘月焕
（ 北京 市延 庆县 农业局 １２０ ② 北 京诚安 动物 医院 ① ０ １０
摘要
⑧ 北京 市农 林科 学 院畜牧 兽 医研 究所 ）
中图分类号 ：￥ ５ ． ８ ２ ５５ ６
１７ 年 ，犬 细小 病毒（ａ ｉｅ ｐｒｏ ｉ ｓ Ｐ 同 时从 ９８ ｃｎｎ ａｖ ｖｒ ， ｖ） ｕｃ 加拿大（ ｈｍｓｎ 、澳 大利亚（ ｌ ） Ｔ ｏ ｏ 等） Ｋｅｙ 患肠炎 的病犬 中分 ｌ 离获得【。Ｃ Ｖ可 引起 犬的出血性肠 胃炎和心肌 炎，并使 ‘ Ｐ 】 白细胞 大量减 少 ，在 幼犬 中的发病 率和死 亡率 都很高 ， 症 状 与猫 泛 白细 胞 减少 症 相似 。本 病 虽 出现 的时 间不
犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析
犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【摘要】试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础.从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体.序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80％,CPV-2b型占20％.本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低.Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性.该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)004【总页数】9页(P870-878)【关键词】犬细小病毒;VP2;基因型;原核表达【作者】卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;廊坊市动物疾病预防控制中心,廊坊065000;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046【正文语种】中文【中图分类】Q785犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一种急性烈性传染病[1]，临床上以急性出血性肠炎、呕吐为主要特征[2]。
犬细小病毒的分离鉴定、序列分析及VP2基因的融合表达的开题报告
犬细小病毒的分离鉴定、序列分析及VP2基因的融合表达
的开题报告
犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）是一种致命性疾病的病毒，它感染犬只
的肠道，导致呕吐、腹泻、脱水等症状，最终可能导致死亡。
为了控制该病毒的传播，需要深入研究其分子生物学特征。
本研究将从分离鉴定、序列分析、VP2基因的融合表达三个方面对犬细小病毒进行研究。
具体内容如下：
1. 分离鉴定
从犬只腹泻、呕吐等症状明显的个体中获取病毒样本，并通过PCR扩增VP2基因，用于后续的序列分析和VP2基因的融合表达。
2. 序列分析
对VP2基因进行序列测定和比较分析，包括构建进化树、计算进化距离等，探究不同地区、不同时间点、不同毒力类型的犬细小病毒之间的基因组变异性、遗传漂变
等特征。
3. VP2基因的融合表达
通过重组DNA技术，将不同地区的VP2基因序列融合，并构建质粒表达载体。
将该载体转染CHO细胞，并利用蛋白印迹等技术对重组VP2蛋白进行鉴定和定量分析，探究其免疫原性和保护性等特征。
本研究将深入探究犬细小病毒的分子生物学特征，为该病毒的防控提供理论基础和技术支持。
云南省犬细小病毒 VP2基因检测分析
云南省犬细小病毒 VP2基因检测分析郑龙龙;朱玲云;宋春莲;高利波;毕峻龙;徐英【摘要】为了解云南省犬细小病毒V P2基因分子流行变异情况，对来源于云南省7个地级市13个犬细小病毒样品进行了V P2基因的扩增和序列分析，并与相关参考序列进行了遗传进化比对分析。
结果表明，13个样品中9个基因型为CPV‐2a ，3个基因型为CPV‐2b ，1个基因型为CPV‐2。
氨基酸序列变异主要集中在297位～518位氨基酸处，其中324位和440位氨基酸变异在犬细小病毒进化过程中扮演着重要角色。
遗传进化分析显示10个样品序列形成了一个相对于国内外参考序列独立的遗传进化分支，提示云南省犬细小病毒以CPV‐2a基因型流行为主。
%In order to investigate the prevalence and variation of VP 2 gene of CPV in Yunnan province ,the gene amplification and sequence analysis were performed for thirteen strains of canine parvovirus ,compri‐sing of 9 strains of CPV‐2a ,3 strains of CPV‐2b and 1 strain of CPV‐2 .It was shown that most of the a‐mino acid variations occurred within the region of position 297‐518 .A high level of substitution at 324 and 440 sites was associated with the evolution of antigenic variants in circulating parvovirus types .Based on the phylogenetic analysis on the amino acid level of the VP2 proteins ,the thirteen strains of CPVs were grouped into 3clusters .Nine of them belonged to CPV‐2a ,three belonged to CPV‐2b ,and one belonged to CPV‐2 .The result showed that CPV‐2a was the main prevalent strain in Yunnan province and formed the independent branch .【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P66-70)【关键词】犬细小病毒;VP2基因;基因型;遗传进化【作者】郑龙龙;朱玲云;宋春莲;高利波;毕峻龙;徐英【作者单位】云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201;云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201;楚雄州动物疫病预防控制中心，云南楚雄675000;云南农业职业技术学院，云南昆明650031【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2犬细小病毒病(Canine parvovirus disease，CPVD)是由犬细小病毒(Canine parvovirus disease，CPV)引起的一种急性、烈性传染病，是当前对犬类危害最大的传染病之一。
贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析
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"%'贵州大学动物科学学院!贵阳 22&&02(0'贵州省动物疫病研究室!贵阳 22&&02#
摘!要为研究贵阳地区犬细小病毒",4-$-;94:D#D$:YM!J?P#的 流 行 基 因 型 及 其 遗 传 进 化 情 况!本 试 验 对 从 贵 阳 市分离的%&株 J?P 的160 基 因 进 行 ?JK 扩 增 和 克 隆 并 进 行 序 列 分 析&结 果 显 示!分 离 的 病 毒 能 使 <R% 猫 肾 细 胞产生明显的细胞病变"J?I#!分离的%&株病毒中!/株为 J?P!04亚型!*株为 J?P!0,亚 型!命 名 为 OC!%"OC! %&&%&株 J?P 分离株与疫苗株160基因的同源性 1R')` "11')`!与 其 他 国 内 外 参 考 株 的 同 源 性 为 1/'/` " 11'1`&本试验首次报道贵阳市 J?P 的流行基因型为 J?P!04亚型并伴随 J?P!0,亚型存在!对监测 J?P 遗传变 异趋势及疫苗的研制具有重要意义& 关 键 词 犬 细 小 病 毒 (基 因 型 (160 基 因 (遗 传 进 化 中图分类号NR20S(2T2!!!!文献标识码= !!!!文章编号%(/%!/0*("0&%/#&)!%&(%!&R
犬细小病毒VP2基因真核表达质粒的构建与瞬时表达
ＪＡＮ Ｚ —ｊａ ， ｕ—ｚ ｅ ， ＨＥ ｈ ｎ Ｉ ｌ ｉｎ ＭＡ Ｓ ｈ ｎ Ｃ Ｎ Ｓ ｅｇ—ｎ ｎ Ｚ ａ ， ＨＡＩ ｈ ｏ—ｈ ａ Ｚ ａ Ｓ ｕ ， ＨＡＯ Ｓ ｎ ｅ
（ ｏｅｅ ｆＡ ｉａ Ｍｅｉｎ Ｘｎａ ｇＡ ｒ ｕ ｕａ Ｕ ｉ ｒｔ ， ｒｍ ｉ ３０ ２ Ｃ ｉ ） Ｃ ｌｇ ｎ ｌ ｄｃ ｅ， ｉ ｎ ｇｉ ｌ ｒ ｎｖ ｓｙ Ｕｕ ｑ ８ ０５ ， ｈ ａ ｌ ｏ ｍ ｉ ｉ ｆ ｃｔ ｌ ｅｉ ｎ
ｅｐｅｓ ｎｐａ ｉ ｏ ａｉ ａｖｖ ｕ ｗ ｓ ｏｓ ｃ ｄ ｉ ｔｉ ｐ ｐｒ 【 ｔｏ 】 ｈ ｐｃａ ｐ ｍ ｒ ａ ｅｉ ｅ ｘ ｒ ｉ ｌ ｍ ｄ ｆ ｎｎ ｐ ｒ ｉ ｓ ａ ｎｔ ｔ ｈｓ ａｅ ．Ｍｅｈ ｄ Ｔ ｅｓｅｉ ｒ ｅ ｗ ｓｄｓ ｎ ｄ ｓｏ ｓ ｃ ｅ ｏｒ ｃ ｒ ｅ ｎ ｕ ｌｉ ｇ
（ 疆农 业 大 学动 物 医学 学 院 ， 鲁 木 齐 新 乌 ８０５ ） ３０２
摘
要 ： 目的 】 建 犬 细 小 病 毒 （ Ｐ ） Ｐ 基 因 真 核 表 达 质 粒 ， 研 究 核 酸 疫 苗 奠 定 基 础 。 【 法 】 据 Ｃ Ｖ 【 构 ＣＶＶ２ 为 方 根 Ｐ
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郑州地区犬细小病毒VP2基因遗传进化分析
郑州地区犬细小病毒VP2基因遗传进化分析张爱国;温良海;陈廷毅;王艺格;胡梦真;马琰君;靳双星;黄啟雪;张瑶;宋超【期刊名称】《现代牧业》【年(卷),期】2024(8)1【摘要】为了解郑州地区犬细小病毒(CPV)的流行特征及遗传变异情况,采集81份2017—2022年郑州市疑似感染CPV犬的粪便或肛门拭子进行PCR检测。
随机挑选出21份经PCR检测的CPV阳性样本,扩增其VP2基因,连接至载体并测序,用MegAlign软件对流行株进行同源性和氨基酸变异分析,并通过MEGA6.0软件构建基因遗传进化树。
结果显示:2017—2018年郑州地区CPV流行基因型为New CPV-2a亚型,2019—2022年则以CPV-2c亚型为主导。
21株CPV流行株与疫苗株的核苷酸同源性为98.3%~99.0%,其中CPV-79流行株与疫苗株的核苷酸同源性最低,仅为98.3%,且该毒株在VP2蛋白GH环区出现多位点氨基酸突变;部分CPV-2c亚型流行株第5和370位氨基酸出现A到G和Q到R的变异。
研究结果表明:郑州地区当前流行基因型为CPV-2c亚型,虽出现多位点氨基酸突变,但未形成明显的国内进化分支。
值得注意的是,New CPV-2a亚型在进化过程中形成了不同分支且存在抗原突变的风险。
本研究丰富了郑州地区CPV的分子流行病学调查数据,也为我国CPV流行疫苗株的研制奠定了基础。
【总页数】7页(P1-7)【作者】张爱国;温良海;陈廷毅;王艺格;胡梦真;马琰君;靳双星;黄啟雪;张瑶;宋超【作者单位】河南牧业经济学院动物医药学院;华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.犬细小病毒CPV-BJ03/17株分离鉴定及VP2基因遗传进化分析2.贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析3.南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析4.犬细小病毒黑龙江流行株的分离鉴定及其VP2基因的遗传进化分析5.犬细小病毒吉林流行株的分离鉴定及VP2基因的遗传进化分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
犬细小病毒临床分离株vp2基因进化分析
犬细小病毒临床分离株VP 2基因进化分析温峰琴1,项海涛1,郝宝成2,邢小勇1,包世俊1,胡永浩1(1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃兰州730050)㊀㊀摘要:为了对犬细小病毒临床分离株的VP 2基因进行遗传变异分析,了解本地区犬细小病毒流行的优势型别及病毒变异情况㊂采集2例患犬细小病毒病的动物粪便,提取病毒基因组,设计特异性引物,PCR 扩增VP 2基因,对扩增产物测序,对序列结果与同属其他毒株VP 2基因序列用MEGA 7和MegAlign 进行同源性分析和遗传进化分析㊂同时比较其氨基酸变异情况㊂结果显示,PCR 扩增出VP 2基因,测序结果显示大小为1755bp,2株病毒VP 2基因NCBI 序列登录号分别为MH155192和MH155193,MH155192与MF467233.1和JQ743891.1的核苷酸同源性为99.9%,MH155193与KY937651.1㊁KP260509.1㊁KY937641.1核苷酸同源性为99.8%㊂MH155192主要位点氨基酸分别为为267Y,324I,370Q,426D,440A㊂MH155193主要位点氨基酸分别为267Y,324I,370R,426E,440T㊂且2株病毒297位均为A㊂表明分离到的2株病毒分别为新CPV-2b 和CPV-2c 型㊂关键词:犬细小病毒;VP 2基因;新CPV-2b ;CPV-2c ;序列分析中图分类号:S855.3㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:05296005(2019)12004105㊀㊀Evolutionary and Genetic Analysis of Canine Parvovirus VP 2Gene in LanzhouWEN Feng-qin 1,XIANG Hai-tao 1,HAO Bao-cheng 2,XING Xiao-yong 1,BAO Shi-jun 1,HU Yong-hao 1(1.Veterinary Medicine College ,Gansu Agricultural University ,Lanzhou 730070,China ;nzhou Institute of Animal and Veterinary Pharmaceutics Science ,Chinese Academy of Agriculture Science ,Lanzhou 730050,China)Abstract :To analyze the genetic variation of VP 2gene of canine parvovirus clinical isolates and to understand the predominanttypes and virus mutations of canine parvovirus epidemics in this region.The feces of 2dogs with canine parvovirus disease were col-lected and viral DNA were extracted.Then,specific primers were designed to amplify VP 2by PCR,and the amplified products were sequenced.MEGA 7and MegAline were performed for homology analysis and genetic evolution analysis with the VP 2gene sequencesof isolated strains and those of other strains belong to the same genus.At the same time,the amino acid variation was compared.The sequencing result showed that the VP 2gene was 1755bp.The NCBI sequence accession numbers of the two strains were MH155192and MH155193.The nucleotide homology of MH155192with MF467233.1and JQ743891.1was 99.9%.The nucleotide homology of MH155193with KY937651.1,KP260509.1,and KY937641.1was 99.8%.The main amino acids of MH155192were 267Y,324I,370R,426D,440A.The main amino acids of MH155193are 267Y,324I,370Q,426E and 440T,respectively.Both strainswere A at position 297.The two isolates were new CPV-2b and CPV-2c.Key words :Canine parvovirus ;VP 2gene;CPV-2b ;CPV-2c ;Sequence analysis Corresponding author :HU Yong-hao ,E-mail:yhh0817@收稿日期:20180410基金项目:盛彤笙科技创新基金(GSAU-STS-1521);甘肃农业大学动物医学院教研产学支持计划(JYCX-KX014)作者简介:温峰琴(1980),女,讲师,硕士,从事兽医相关工作,E-mail:46292083@通讯作者:胡永浩,E-mail:yhh0817@㊀㊀犬细小病毒感染是由犬细小病毒(Canine par-vovirus,CPV)引起的犬的一种急性传染病,特征为出血性肠炎或非化脓性心肌炎,多发生于幼犬,病死率10%~50%[1]㊂CPV 属于细小病毒科细小病毒亚科的Protopar-vovirus 属,与猫细小病毒(FPV),水貂肠炎病毒(MEV)和浣熊细小病毒(RaPV)均为食肉动物原细小病毒1的变种[2]㊂CPV 是一类结构简单的单链线状DNA 病毒,病毒颗粒直径约为25nm,无囊膜,呈二十面体[3]㊂病毒基因组全长为5323nt,含有2个ORF ,5ᶄ端主要编码早期转录的调节蛋白NS1和NS2,3ᶄ端编码晚期转录的结构蛋白,即病毒衣壳蛋白VP1和VP2,VP2是衣壳蛋白的主要成分,具有较强的免疫原性,可用于制备亚单位疫苗或DNA 疫苗[4]㊂由于犬细小病毒,尤其是VP 2基因容易发生变异,且在同一动物体有时能够检测到几种病毒变体,即共同感染[2],对VP2序列的扩增和分析有助于了解流行毒株的抗原和基因变异情况㊂由于VP2的突变和重组影响宿主范围和受体结合的亲和力,因此对毒株VP2基因的监测有助于了解流行株与疫苗株的关系及CPV的进化模式,本试验对兰州分离的2例犬细小病毒VP2进行遗传进化分析及氨基酸变异分析,为犬细小病毒病的分子流行病学调查及防控提供了数据㊂1㊀材料与方法1.1㊀病料㊀2例犬细小病毒病患病犬粪便均来自兰州某宠物医院,采集时间分别为2017年4月和2017年6月㊂1.2㊀试剂㊀2ˑTaq PCR Master Mix㊁病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒,购自TIANGEN公司;胶回收试剂盒,购自OMEGA公司;DL-2000 DNA Marker,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;pMD19-T Vector,购自TaKaRa公司; IPTG㊁X-gal㊁DH5α,购自北京全式金生物技术有限公司㊂1.3㊀方法1.3.1㊀引物设计㊀参照NCBI数据库犬细小病毒VP2基因保守区设计扩增全长的引物,引物序列包含酶切位点,由金唯智生物科技有限公司合成㊂引物序列如下:VP2-forward:5ᶄATA CATATG AGTGATGGAGCAGTTCAACC3ᶄVP2-reverse:5ᶄTAT GGATCC TTAATATAATTTTCTAGGTG3ᶄ1.3.2㊀病毒基因组DNA提取㊀2017年4月分离的病毒株命名为CPV/canine/LZ/1/2017,2017年7月分离的病毒命名为CPV/canine/LZ/2/2017,按照TIANGEN病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书进行㊂1.3.3㊀VP2基因的扩增㊀PCR反应体系:2ˑTaq PCR Master Mix25μL,ddH2O23μL,上游引物1μL,下游引物1μL,模板1μL,总体积50μL㊂PCR反应条件:95ħ预变性5min;95ħ1min, 53ħ40s,72ħ90s,30次循环;72ħ10min㊂扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳㊂电泳后切取目的条带,用胶回收试剂盒进行纯化回收㊂1.3.4㊀连接与转化㊀胶回收产物与pMD19-T载体连接㊂连接体系为10μL,其中SolutionI5μL; pMD19-T载体2μL;胶回收产物3μL;16ħ连接30min㊂连接产物转化100μL感受态大肠杆菌DH5α㊂冰浴30min,42ħ热激45s,冰浴2min㊂在上述感受态细胞中加入950μL不含抗生素的LB 液体培养基37ħ震荡培养1h㊂用移液器吸取100μL培养液涂布含有IPTG㊁X-gal和氨苄青霉素的LB平板培养基,37ħ培养12-16h㊂1.3.5㊀阳性重组质粒的鉴定㊀挑取平板中的白斑(阳性)于含氨苄青霉素的LB肉汤中37ħ摇床中培养8h至菌液浑浊;吸取少量菌液进行菌液PCR扩增,PCR产物经1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)电泳,观察是否出现目的条带㊂取出现目的条带的菌液1mL,离心,弃上清,送金唯智生物科技有限公司测序㊂1.3.6㊀序列测定与分析:将临床分离株VP2基因序列与NCBI中的24株犬细小病毒及3株猫细小病毒VP2基因序列用MEGA7.0进行比对分析,并绘制遗传进化树㊂用MegAlign软件分析核苷酸同源性,同时分析氨基酸变异情况㊂2㊀结果2.1㊀PCR扩增结果㊀PCR扩增产物大小约为1700bp,与预期一致,如图1所示㊂图1㊀犬细小病毒VP2基因PCR产物电泳1:CPV/canine/LZ/1/2017VP2基因;2:CPV/canine/LZ/2/2017VP2基因;M:DL-2000DNA Marker2.2㊀核苷酸遗传进化及同源性分析㊀测序结果显示,2株病毒VP 2基因大小为1755bp,CPV /canine /LZ /1/2017VP 2基因NCBI 登录号分别为MH155192,CPV /canine /LZ /2/2017VP 2基因MH155193㊂遗传进化分析显示,猫细小病毒和犬细小病毒明显位于不同的进化分支上,MH155192与MF467233.1㊁JQ743891.1和KY937659进化关系较近,位于同一进化分支㊂MH155193与KY937651.1㊁KP260509.1㊁KY937641.1进化关系较近,位于另一独立的进化分支上,如图2所示㊂核苷酸同源性分析显示,MH155192与MF467233.1和JQ743891.1的核苷酸同源性最高,均为99.9%,与MG264078.1同源性较低(99%)㊂MH155193与KY937651.1㊁KP260509.1㊁KY937641.1核苷酸同源性均为99.8%,与KF149967.1同源性较低(99.1%),MH155192和MH155193同源性为99.3%,如表1所示㊂图2㊀犬细小病毒临床分离株VP 2基因系统发育树2.3㊀氨基酸变异分析㊀MH155192在易发生变异的位点氨基酸分别为5A,80R,87L,93N,101T,103A,178D,212F,232I,267Y,297A,300G,305Y,322T,323N,324I,370R,373D,426D,440A,564S,568G㊂各毒株之间氨基酸差异明显的位点主要在267㊁324㊁370㊁426㊁440位,如表2所示㊂MH155192和MH155193共有13个核苷酸差异,其中的10个核苷酸的变化仅造成同义突变,而3个核苷酸突变导致氨基酸改变,分别位于370㊁426和440位残基㊂总体来看,在24株犬细小病毒中,中国分离株267位均为Y,324位均为I,与美国㊁厄瓜多尔分离株差异明显,370位中国分离株为Q 或R㊂CPV-2c 分离株440位均为T㊂表1㊀犬细小病毒临床分离株VP2基因同源性分析12345678910111213141516171819 1-99.599.899.599.499.999.799.49999999999.399.399.299.199.199.198.9 20.5-99.599.699.599.499.599.599.299.299.399.299.399.399.399.299.299.299.1 30.20.5-99.499.499.799.799.498.998.99998.999.299.299.199.299.299.198.9 40.50.40.6-99.599.499.599.799.199.199.299.199.599.599.499.499.499.499.2 50.60.50.60.5-99.399.599.49999999999.299.299.199.199.199.198.9 60.10.60.30.60.7-99.599.398.998.998.998.999.199.199.199.1999998.8 70.30.50.30.50.50.5-99.49999999999.399.399.299.399.399.198.9 80.60.50.60.30.60.70.6-99.399.399.399.399.899.899.899.799.799.799.3 910.8 1.10.91 1.110.7-99.999.999.899.399.399.399.299.299.299.8 1010.8 1.10.91 1.110.70.1-99.899.999.399.399.399.299.299.299.8 1110.710.81 1.110.70.10.2-99.799.499.499.399.399.399.399.8 1210.8 1.10.91 1.110.70.20.10.3-99.399.399.399.299.299.299.7 130.70.70.80.50.80.90.70.20.70.70.60.7-10099.999.999.999.999.4 140.70.70.80.50.80.90.70.20.70.70.60.70-99.999.999.999.999.4 150.80.70.90.60.90.90.80.20.70.70.70.70.10.1-99.899.899.899.3 160.90.80.80.60.90.90.70.30.80.80.70.80.10.10.2-99.999.899.3 170.90.80.80.60.910.70.30.80.80.70.80.10.10.20.1-99.899.3 180.90.80.90.60.910.90.30.80.80.70.80.10.10.20.20.2-99.3 19 1.10.9 1.10.8 1.1 1.2 1.10.70.20.20.20.30.60.60.70.70.70.7-注:1,KF149985.1;2,KF149967.1;3,KF149973.1;4,KJ813864.1;5,KJ813850.1;6,MG264078.1;7,MG264076.1;8,KX198141.1; 9,KY937651.1;10,KP260509.1;11,KY937641.1;12,KY937650.1;13,MF467233.1;14,JQ743891.1;15,KY937659.1;16,KU983491.1; 17,GQ379047.1;18,MH155192;19,MH155193表2㊀VP2蛋白氨基酸变异情况序号毒株位置267324370426440基因型宿主时间国家1GQ379047.1Y I Q N A2a犬2009泰国2KF149973.1F Y Q N S2a犬2012厄瓜多尔3KF149985.1F Y Q D S2b犬2012厄瓜多尔4KF149967.1F Y Q E T2c犬2012厄瓜多尔5MG264078.1F Y Q D S2b斗牛犬2017厄瓜多尔6KJ813882.1F Y Q D T2b浣熊2012美国7KJ813881.1F Y Q D T2b灰狼2012美国8KJ813884.1F Y Q E T2c郊狼2012美国9KJ813892.1F Y Q D T2b郊狼2013美国10KJ813835.1F Y Q N T2a渔貂2013美国11KJ813864.1F Y Q D T2b美洲狮2013美国12KJ813850.1F Y Q D T2b短尾猫2013美国13KX198141.1F I Q D A2b犬2016伊拉克14KX618915.1Y I Q N A2a椰子狸2016新加坡15JQ743891.1Y I Q D A2b斗牛犬2010中国16KP260509.1Y I R E T Novel2c犬2014中国17MF467233.1Y I Q D A New2b犬2015中国18KY937641.1Y I R E T2c犬2016中国19KU983491.1Y I Q N A2a犬2016中国20KY937650.1Y I Q E T2c犬2016中国21KY937651.1Y I R E T2c犬2017中国22KY937659.1Y I Q D A2b犬2017中国23MH155192Y I Q D A2b犬2017中国24MH155193Y I R E T2c犬2017中国3 讨论犬细小病毒,为将其与抗原无关的犬科动物微小病毒(MVC或CPV1)区分开来,也称为CPV2,1978年出现在美国,并迅速蔓延在世界各地的狗群中引起居高不下发病率[5]㊂在1979年和1984年,CPV-2a和2b两种新抗原类型分别取代了原来的CPV-2,获得了在猫中高效复制的能力㊂CPV-2a和CPV-2b至少在VP2衣壳蛋白上有5个或6个氨基酸与最初的CPV2不同㊂在CPV-2a和CPV-2b中VP2第297位(SerңAla)的额外氨基酸改变产生了 新CPV-2a 和 新CPV-2b ㊂此外,在2000年报道了另一种抗原变体,其特征在于氨基酸替代426-AspңGlu㊂这种CPV-2c随后在全球范围内被报道,并与严重的临床病程相关,死亡率较高[6]㊂CPV-2a(Met87Leu,Ile101Thr, Ala300Gly,Asp305Tyr,Asn375Asp,和Val555Ile氨基酸变体)和CPV-2b(Asn426Asp),CPV-2c (Asp426Glu)仅有1个氨基酸位置不同(VP2426残基)[7]㊂VP2的426和297位氨基酸在空间上分别接近衣壳表面上三倍体突起的残基97和300㊂结构研究表明,该区域与宿主细胞的转铁蛋白受体(TFR)相互作用以介导感染,限制宿主范围,并且具有很高的抗原性[6]㊂近年来中国分离株CPV-2a, CPV-2b,CPV-2c三种类型都有㊂在本文氨基酸分析的24株病毒中,除KJ813835.1第297位为Ser 外,其余菌株都为Ala,故认为CPV/canine/LZ/1/ 2017和CPV/canine/LZ/2/2017分别是新CPV-2b 和CPV-2c㊂尤其CPV-2c甚至能引起成年犬的严重疾病,应引起重视㊂一般氨基酸替换发生于K80R,K93N, V103A,D323N,N564S和A568G,在本文的氨基酸序列分析中发现,不同毒株之间的主要突变发生在F267Y,Y324I,Q370R,N426D或D426E, T440A㊂这些突变可能会导致病毒通过抗原漂移免疫逃避和随之而来的疫苗失败㊂在非同义突变中,氨基酸残基267未暴露于衣壳表面,因此在这个位置的替代可能不会影响病毒的抗原性㊂Y324I突变常见于亚洲国家特别是中国和南美㊂该突变可能对细小病毒宿主范围有影响,且由于Y324I突变发生在潜在的重要的抗原表位区域,这个替代可能对病毒生物学有直接影响㊂T440A突变对于CPV也很重要,因为残基440位于衣壳表面VP2的3倍体突起的顶部,主要的病毒抗原位点㊂因此导致其他抗原性变体出现[8]㊂台湾CPV-2c毒株VP2蛋白也存在Q370R的替代,突变Q370R在中国的大熊猫和中国的CPV-2c株中观察到㊂370残基位于残基359和375之间(它是衣壳蛋白的表面环),毗邻双Ca2+结合位点,这些对于病毒感染性是必不可少的,这些位点的改变与病毒凝集红细胞的能力相关[9]㊂因此,Q370R变异是否导致抗原变化仍有待调查㊂总的来说,进一步研究犬细小病毒流行毒株的基因变异情况,以及变异引起的生物学特性的变化对于该病的防控有重要意义㊂参考文献:[1]㊀蔡宝祥.家畜传染病学[M].4版.北京:中国农业出版社,2001:354[2]㊀Cotmore S F,Mavis A M,Chiorini J A,et al.The family Parvoviri-dae[J].Archives of Virology,2014,159(5):12391247. [3]㊀董江丽,李淑芬,张鹤龄.犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析[J].中国病毒学,2000,15(4): 379387.[4]㊀王微,李秀锦,仲飞,等.犬细小病毒VP2蛋白在真核细胞中的分泌表达及特性[J].微生物学报,2009,49(5): 648652.[5]㊀Giudici S D,Cubeddu T,Giagu A,et al.First molecular charac-terization of canine parvovirus strains in Sardinia,Italy[J].Ar-chives of Virology,2017,162(11):34813486. [6]㊀Vieira F V,Hoffmann D J,Fabri C U F,et al.Circulation of ca-nine parvovirus among dogs living in human-wildlife interface in the Atlantic forest biome,Brazil[J].Heliyon,2017,3(12): e00491.㊀[7]㊀Ahmed N,Riaz A,Zubair Z.et al.Molecular analysis of partialVP-2gene amplified from rectal swab samples of diarrheic dogs in Pakistan confirms the circulation of canine parvovirus genetic vari-ant CPV-2a and detects sequences of feline panleukopenia virus (FPV)[J].Virology Journal,2018,15(1):45.[8]㊀Li G R,Ji S L,Zhai X F,et al.Evolutionary and genetic analysisof the VP2gene of canine parvovirus[J].BMC Genomics,2017, 18(1):534.[9]㊀Lin Y C,Chiang S Y,Wu H Y,et al.Phylodynamic and GeneticDiversity of Canine Parvovirus Type2c in Taiwan[J].Internation-al Journal of Molecular Sciences,2017,18(12):2703.。
犬细小病毒VP2基因测序分析
犬细小病毒VP2基因测序分析李世静;嵇辛勤;主性;阮涌;傅心亮;王修江【摘要】为了解贵阳市犬细小病毒(CPV) VP2基因的遗传变异情况,从贵阳市黔灵动物医院采集经试剂盒检测为阳性的患犬粪便13份,对粪样进行病毒DNA的提取,并以此DNA为模板,进行PCR扩增,随机选取3株PCR阳性产物对其VP2基因进行序列测定与遗传变异分析.结果显示,抗原快速检测试剂盒与PCR检测结果符合率达76.9％；3个试验毒株之间VP2基因同源性达96.5％～97.3％,与参考毒株同源性为95.2％～96.8％；由遗传进化树可见,与国内分离毒株的亲缘性略高于国外分离株.结果表明,CPV抗原快速检测试剂盒与PCR法符合率较高,3个试验毒株与国内外流行毒株之间差异性不大.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2013(034)006【总页数】5页(P96-100)【关键词】犬细小病毒病;VP2基因;聚合酶链反应;序列分析【作者】李世静;嵇辛勤;主性;阮涌;傅心亮;王修江【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵阳市黔灵动物医院,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】S852.659.2犬细小病毒病（Canine parvovirus disease）是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的犬的一种急性传染病，以出血性肠炎或非化脓性心肌炎为特征，多发生于幼犬，病死率10%～50%［1］。
犬细小病毒最早是在1977年由美国学者Eugster和Nain从患出血性肠炎的病犬粪便中首次观察到的［2］，我国于1982年由徐汉坤等首次报道本病的流行。
到目前为止，犬细小病毒有CPV－2、CPV－2a、CPV－2b、CPV－2c（a）和CPV－2c（b）5个亚型［3］。
犬细小病毒山东分离株VP2基因的克隆与遗传变异分析
了依 据 。
关键 词 ： 犬细 小病毒 ； Ｖ Ｐ ２： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ 文献 标志码 ： Ａ 文章 编号 ： ０ ５ ２ ９ — ６ ０ ０ ５ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ８ — ０ ０ １ Ｏ － ０ ４
Ｃｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｎｄ ｇ ｅ ｎｅ ｔ ｉ ｃ ｄ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ＶＰ２ ｇ ｅ ｎｅ ｏ ｆ ｃ ａ ｎｉ ｎｅ ｐａ ｒ ｖ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕｓ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｓｈ ａ ｎｄｏ ｎｇ
于永 乐 ， 张 传 美 ， 张 倩 。， 杨 海 燕 ， 杨 瑞 梅 ，张 洪 亮 ， 单 虎
（ １ ． 青岛农 业大 学动 物科技 学 院 ，山东 青 岛 ２ ６ ６ １ ０ ９； ２ ． 山东 省黄 岛 出入境 检验检 疫局 ，山东 青 岛 ２ ６ ６ ５ ５ ５ ）
摘要 ： 为 了解 山东 省 犬 细 小病 毒 （ Ｃ Ｐ Ｖ） 流 行 毒 株 的遗 传 变异 情 况 及 其 与犬 细 小 病毒 病 的分 子流 行 病 学关 系 ， 对 ２ ０ １ ３ 年 分离 到的 ｌ ２ 株 山东 Ｃ Ｐ Ｖ流行 毒株 进行 了 Ｖ Ｐ ２ 基 因 克隆测 序与 同源性 分析 ， 绘制 系统 进化 树 。结 果表 明 ， 获 得 的
(预防兽医学专业论文)犬科和猫科动物细小病毒分离株VP2基因的遗传进化分析研究
ｓａｍｐｌｅｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｉｒｔｙ ｃａｎｉｎｅ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ
ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｆｒｏｍ ２００７—２００８ ａｎｄ ｎｉｎｅ ＣＰＶ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ．Ｔｅｎ ＦＰＶ
关键词： 犬细小病毒；猫泛白细胞减少症病毒；克隆；遗传进化分析
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ｏｆ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｍａｎｙ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ ａｒｃ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ Ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．Ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ
根据Ｇｅｎｂａｎｋ登录的猫泛白细胞减少症病毒（ＦＰＬＶ）、犬细小病毒（ＣＰＶ）、水貂 肠炎病毒（ＭＥＶ）ＶＰ２序列进行比较，选择其保守序列，设计一对检测肉食兽细小病 毒的特异性通用引物，从２００７年．２００８年之间我国不同地方送检的疑似ＣＰＶ感染的３０ 份犬科动物样品中ＰＣＲ检测出１８份ＣＰＶ阳性样品；并从２０份疑似ＦＰＶ感染的猫科动 物病料样品中检测出１０份ＦＰＶ阳性样品。用Ｆ８１细胞从１８份ＣＰＶ阳性样品中分离鉴 定到９株ＣＰＶ，从１０份ＦＰＶ阳性样品中分离鉴定到７株ＦＰＶ，经形态学、理化学、生 物学和分子病毒学等进一步鉴定这１６株病毒。通过设计肉食兽细小病毒ＶＰ２全长特异 性通用引物，经ＰＣＲ扩增了ＶＰ２全长基因并进行克隆和序列分析。用分离的ＣＰＶ分离 株对健康犬进行人工感染实验，十天内所感染犬均出现典型的犬细小病毒感染临床症 状，其中ＣＰＶ－ＣＮ．５株感染犬以死亡告终。病毒检测结果显示不同时间我国不同地方送 检病料细小病毒阳性率比较高，初步推断ＣＰＶ和ＦＰＶ在我国犬科和猫科动物普遍存在。 ９株ＣＰＶ病毒和７株ＦＰＶ株病毒均能在Ｆ８１细胞上生长，产生典型的肉食兽细小病毒 细胞病变。通过人工感染实验，筛选出一株强毒株，为ＣＰＶ的预防提供了实验数据。
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分类号：单位代码：10019 密级：学号：S0*******硕士学位论文北京地区犬细小病毒VP2基因序列分析和流行病学调查Sequence analysis of VP2 gene and epidemiological survey ofcanine parvovirus in Beijing研究生：宋永奇指导教师：吕艳丽副教授合作指导教师：申请学位门类级别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：兽医微生物学与免疫学所在学院：动物医学院2008年 5 月独 创 性 声 明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月摘 要犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染是目前危害养犬业的最严重传染病之一。
为了了解CPV的变异情况，本研究在2006-2007年间不同时间采集CPV感染患犬粪便样本20份，经PCR方法从中扩增出了CPV VP2基因，并对该基因进行了序列测定与分析；为了了解本病的流行状况，本研究对临床上常用的CPV检测方法的可靠性进行了评估，并在此基础上对2005-2007年到中国农业大学动物医院诊治的所有有呕吐、腹泻和呕吐或腹泻症状的犬粪便样本的CPV检测结果进行了统计分析，获得如下结果：VP2基因全长1755bp，编码585个氨基酸。
经核苷酸及推导的氨基酸序分析显示，20个样本中，有19个属于CPV-2a，1个为CPV-2b；所有病毒样本VP2的297氨基酸残基位点均发生Ser→Ala的置换；基因型为CPV-2a样本的555氨基酸残基位点均发生IIe→Val的置换。
与经典的CPV-2a/2b参考毒株比较，80.0%（16/20）的样本在324位有Tyr→Ile的置换；样本CPV/BJ005/07和CPV/BJ008/07的139位氨基酸残基由Val置换为Ile；样本CPV/BJ004/07和CPV/BJ050/07分别在226与382位发生置换（Ser→Asn，和Arg→Lys)。
应用DNAStar软件对Ile-139、Asn-226、Ile-324和Lys-382置换进行的抗原表位变化分析表明，这4处氨基酸残基置换都不会改变病毒的抗原表位。
将犬细小病毒抗原检测试剂盒与HA-HI和PCR方法进行了比较：犬细小病毒抗原检测试剂盒与HA-HI法比较，其敏感性、特异性和总符合率分别为100.0%、84.5%、90.8%；与PCR法比较，其敏感性、特异性和总符合率分别为85.3%、96.2%、90.0%。
这表明该试剂盒可以用于CPV 的流行病学调查。
CPV检测数据统计分析显示，2005、2006和2007年度CPV年检出率分别为24.14%、35.73%和25.52%；该病一年均可发生，但以第一和第四季度发病率较高；各年龄犬均可感染，但1-3月龄幼犬易感性最高。
关键词：犬细小病毒（CPV），VP2基因，序列分析，诊断方法，流行病学调查AbstractAt present, canine parvovirus (CPV) infection is one of most severe infectious diseases of domestic dogs. In order to understand the variation of CPV, we in this study amplified by PCR, sequenced and analyzed the VP2 gene of twenty faecal samples collected from dogs infected with CPV at different time from the year 2006 to 2007. In order to understand the epidemic situations of CPV infection, we on the base of evaluation of CPV Ag Test Kit, collected and analyzed the results of CPV detection of all dogs sent to China Agricultural University Animal Hospital from the year of 2005 to 2007, and whose clinical symptoms were vomiting and diarrhea, and vomiting or diarrhea. the results of these tests were as follow:The complete VP2 gene sequence was 1755bp encoding 585 amino acids. Sequence analysis of nucleotide and deduced amino acid residues revealed that nineteen samples were CPV-2a and one CPV-2b among the twenty canine parvovirus. All the samples had an amino acid substitution of residue 297 in VP2, Ser to Ala. nineteen CPV-2a samples studied in this study had substitution (IIe→Val) at residue 555 in VP2. Compared with classical CPV-2a/2b isolates, some samples had new amino acid substitutions: CPV/BJ005/07 and CPV/BJ008/07 at amino acid residue 139 in VP2 was Ile instead of Val; Ile-324 mutants accounted to 80% (16/20). Amino acid substitutions (Ser→Asn and Arg→Lys) of residue 226 and 382 were found in samples of CPV/BJ004/07 and CPV/BJ050/07, respectively. Four radical amino acid substitutions (Ile-139, Asn-226, Ile-324 and Lys-382 ) of VP2 did not change viral epitopes by DNAStar software analysis.The result of CPV detection of CPV Ag Test Kit was compared with those of HA-HI and PCR tests: It showed 100.0%, 84.5% and 90.8%, respectively in relative sensitivity, specificity and overall agreement between CPV Ag Test Kit and HA-HI, and 85.3%, 96.2% and 90.0 %, respectively as in comparison with PCR. The results indicated that CPV Ag Test Kit was a suitable test using in clinic and epidemiological survey.The results of CPV epidemiological survey displayed that the positive ratio of CPV infection was 24.14%, 35.73% and 25.52% in the year of 2005, 2006 and 2007 respectively. CPV infection of domestic dogs could take place through the year, but the highest infection rate was the first and fourth quarters. Domestic dogs of every years of age could be infected with CPV but puppies between 1-3 moths were more susceptivity than others.Key words:Canine parvovirus(CPV), VP2 gene, sequence analysis, diagnostic method, epidemiological survey目录第一章引言 (1)1.1 CPV感染研究进展 (1)1.1.1 病原学 (1)1.1.2 流行病学 (7)1.1.3 诊断方法 (7)1.1.4 预防 (14)1.2 研究意义与研究目标 (16)第二章北京地区犬细小病毒VP2基因序列分析 (17)2.1 材料 (17)2.2 方法 (17)2.3 结果 (19)2.4 讨论 (28)2.5 小结 (29)第三章犬细小病毒流行病学调查 (30)3.1 CPV抗原检测试剂盒临床应用评估 (30)3.1.1 材料 (30)3.1.2 方法 (31)3.1.3 结果 (33)3.1.4 讨论 (35)3.2 犬细小病毒流行病学调查 (37)3.2.1 材料 (37)3.2.2 方法 (37)3.2.3 结果 (37)3.2.4 讨论 (39)3.3 小结 (40)第四章结论 (41)参考文献 (42)致谢 (48)作者简介 (49)缩略词表缩写 英文名称 中文名称MVC Minute virus of canine 犬极细小病毒CDV Canine distemper virus 犬瘟热病毒DNA Deoxyribonucleicacid 脱氧核糖核酸pair 碱基对bp baseNS Non-structural-proteins 非结构蛋白protein 衣壳蛋白VP Capsidunit (基因)图距单位mu mapORFs open reading frames 开放阅读框g gram 克mRNA messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸acid 多聚腺苷酸Poly(A) PolyadenylicÅ Å长度计量单位（1m=1010 Å） kDa kilodalton 千道尔顿CPV-2 Canine parvovirus type 2 犬细小病毒2型CPV-2a Canine parvovirus type 2a 犬细小病毒2a亚型CPV-2b Canine parvovirus type 2b 犬细小病毒2b亚型CPV-2c Canine parvovirus type 2c 犬细小病毒2c亚型virus 猫泛白细胞减少症病毒 FPV Felinepanleukopeniamin minute 分钟ml milliliter 毫升h hour 小时μL microliter 微升M mole/liter 摩尔/升CA V-2 Canine adenovirus type 2 犬腺病毒2型CPIV-2 Canine parainfluenza type 2 犬副流感病毒2型saline 磷酸盐缓冲盐水PBS phosphate-buffereds second 秒kidney(cell line)马-达二氏犬肾(细胞系)canineMDCK Madin-Darbyng nanogram 纳克minutes 转/分钟perr/min revolutionsnm nanometer 纳米MEV Mink enteritis virus 水貂肠炎病毒parvovirus 牛细小病毒BPV BovinePFU plaque forming unit 蚀斑形成单位triphosphates 三磷酸脱氧核苷dNTPs deoxy-ribonucleosideMcAbs monoclonalantibodies 单克隆抗体liter 微摩尔/升μM micromole/liter 毫摩尔/升mM millimole/第一章 引言1.1 CPV感染研究进展1978年，澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等[1]同时从患肠炎的病犬粪便中分离获得的犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）。