第二章 酶工程-酶的发酵生产
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1.氨基酸活化生成氨酰-tRNA
氨酰-tRAN合成酶
aa+tRNA+ATP
aa-tRNA+AMP+PPi
大肠杆菌,肽链合成的第一个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸:
Met+tRNAF+ATP → Met-tRNAF+AMP+PPi
甲酰转移酶
fMet-tRNA
2.肽链的合成起始
IF-3 mRNA GTP-IF-2-fMet-tRNA fMRA 50s亚基
真核生物RNA聚合酶:三种
聚合酶种类 RNA聚合酶I RNA聚合酶II RNA聚合酶III
别名 存在位置
rRNA RNA 不均一RNA 小分子RNA 聚合酶 聚合酶 聚合酶 核仁 核仁 核之
相对分子质 量/103
催化反应产物
550
rRNA
600
mRNA
600
tRNA 5SrRNA
(四)转录的起始
tRNA3’-末端加上CCA-OH尾巴 在mRNA的5’-末端加上“帽子”结构5’-m7GpppNmpNp 在mRNA 的3’-末端连接polyA尾巴 tRNA5’-末端加上甲基鸟苷酸 核苷修饰反应
二、蛋白质的生物合成——翻译
以mRNA为模板,以各种氨基酸为底物,在核糖体 上通过各种tRNA、酶和辅助因子的作用,合成多肽链 的过程,称为翻译。 转录
RNA生物合成的起始位点在DNA的启动基因 (启动子)上 起始阶段的重要问题是RNA聚合酶与DNA 的启动基因的相互作用,起始阶段包括:
全酶的形成 酶与模板结合 酶与启动基因结合 模板DNA局部变性 转录开始
(五)转录的延伸
转录泡,17bp
解旋
重旋 5’ DNA 3’
3’
RNA 5’
RNA-DNA杂交体,8bp 酶的移动方向
fMet aa1
tRNA2 +EF-G +GDP+Pi
+EF-G +GTP
+EF-T +GDP+Pi
aa2 +EF-T
+GTP
4.肽链的终止
终止密码子:UAA, UAG, UGA 释放因子(Release Factor): RF-1:UAA, UAG RF-2:UAA, UGA
5.翻译后加工
去除甲酰基 去除N-末端的氨基酸 肽链折叠
mRNA
翻译
添加阻遏物时: … R P O S1 S2 … DNA
共阻遏物
磷酸单酯 碱性磷酸酶 磷酸+醇
(三)真核生物中酶生物合成的调节机制 1.细胞分化改变酶的生物合成 2.基因扩增加速酶的生物合成 3.增强子促进酶的生物合成 4.抗原诱导抗体酶的生物合成
1.细胞分化改变酶的生物合成
(1)结合 DNA 3’ 5’ (2)延伸 DNA 3’ 5’ (3)移位 DNA 3’ 5’ 5’
三、酶生物合成的调节
酶的类型
组成酶:DNA酶,RNA酶, 糖酵解途径的酶 调节酶:适应酶,β-半乳糖苷酶(诱导 酶)
酶合成的调节控制
转录水平的调节 转录产物的加工调节 翻译水平的调节 翻译产物的加工调节 酶降解调节
(一)操纵子学说 1960年Jacob和Monod提出的操纵子学说 调节基因:产生阻遏蛋白 启动基因 1.RNA聚合酶结合位点
DNA
A T C G
aRNA
A U C G
翻译
蛋白质
43=64
遗传密码
氨基酸
遗传密码的简并性:61种密码——20种氨基酸
遗传密码的通用性 密码子与反密码子的相互作用:
mRNA
密码子 反密码子
5’-X Y Z-3’ 3’-X’ Y’ Z’-5’ tRNA
Crick根据立体化学原理,于1966年提出了摆动假说: 密码子与反密码子的配对中,前两对严格按照碱基配 对原则,而第三对碱基则可以有一定自由度地摆动,所 以,某些tRNA的反密码子可以识别一个以上的密码子。
五、酶的发酵生产方式
1.固体培养发酵
2. 液体深层发酵
3. 固定化细胞
4. 固定化原生质体发酵
第四节 发酵工艺的条件及控制
酶发酵生产的一般工艺流程
保藏细胞
细胞活化
原生质体
固定化原生质体 培养基
细胞扩大培养
固定化细胞 预培养
发酵
无菌空气 分离纯化 酶
Baidu Nhomakorabea
一、细胞活化与扩大培养
细胞活化:保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜 面培养基上,在一定条件下进行培养,以恢复细胞的 生命活力,这就叫细胞的活化。 种子培养基:用于细胞扩大培养的培养基。 氮源丰富 碳源少 温度、pH、溶解氧 接种量:1~10%
产生阻遏蛋白
原核生物中操纵子的类型
1.诱导型操纵子:乳糖操纵子
2.阻遏型操纵子:色氨酸操纵子
(二)原核生物中酶生物合成的调节机制 1.分解代谢物阻遏作用 2.酶生物合成的诱导作用 3.酶生物合成的反馈阻遏作用
1.分解代谢物阻遏作用
是指容易利用的碳源 阻遏某些酶(主要是 诱导酶)生物合成的 现象。
活性中心
(六)转录的终止
模板DNA分子上每个基因或每个操纵子都含有一个 终止信号——终止子。当RNA聚合酶转录到达这个 信号时,合成的RNA分子以及聚合酶与模板DNA分 离,RNA链的合成便被终止。 ATP→ADP+Pi 5’
ρ RNA聚合酶 终止子
(七)RNA前体的加工
1.剪切反应 2.剪接反应 3.末端连接反应:
诱导物 转录
举例: 乳糖诱导β-半 乳糖苷酶的合成
翻译 酶
mRNA
乳糖
别乳糖
3.酶生物合成的反馈阻遏作用(产物阻遏作用)
是指酶催化作用的 产物或代谢途径的 末端产物使该酶的 生物合成受阻的过 程。引起反馈阻遏 的物质,称为共阻 遏物。
举例:无机磷酸阻 遏碱性磷酸酶
无阻遏物时: … R P
O S1 S2 … DNA
过程中往往会发生变化。
四、温度的调节控制
1.细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有
所不同,而且往往低于最适生长温度。
2.有些酶的发酵生产,要在不同阶段控制不同
的温度条件。
五、溶解氧的调节控制
调节溶解氧的方法:
(1)调节通气量
(2)调节氧的分压
(3)调节气液接触时间
(4)调节气液接触面积
(5)改变培养基的性质
六、微生物产酶的方式及特点
1.固体培养发酵 优点:设备简单、操作方便、麸曲中酶浓度 较高、适合霉菌培养发酵 缺点:劳动强度大、原料利用率低、生产周 期长
2.液体深层发酵
3.固定化细胞
3. 链霉菌
特征: 最高等的放线菌。有发育良好 的分枝菌丝,菌丝无横隔,分化 为营养菌丝、气生菌丝、65孢子 丝。孢子丝再形成分生孢子。孢 子丝和孢子的形态、颜色因种而 异,是分种的主要识别性状之一。 产酶种类: α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚 糖酶、碱性磷酸酶等
4. 黑曲霉
特征: 属于半知菌亚门, 菌丝有隔, 细胞多核;部分气生菌丝细胞 形成特化的厚壁、膨大的足细 胞,由足细胞的中间稍呈垂直 地向上延长,形成分生孢子梗。 产酶种类: 糖化酶、α-淀粉酶、酸 性蛋白酶、果胶酶、葡萄 糖氧化酶等
2.cAMP及其受体蛋白复合物
操纵子
(cAMP-CRP)结合位点
操纵基因:与阻遏蛋白结合
结构基因:蛋白多肽链产物
操纵子
调节 基因 启动 操纵 基因 基因 结构 基因
…
R
P
O
S1
S2 … … DNA
mRNA 与阻遏蛋白结合
1.RNA聚合酶结合位点 2.cAMP及其受体蛋白复合物 (cAMP-CRP)结合位点
三、酶发酵生产常用的微生物
1. 大肠杆菌
特征: 细胞成杆状,0.5μm*(1~3) μm,无芽孢,G-,菌落从 白色到黄色,光滑闪光,扩 展。 产酶种类:一般生产胞内酶 谷氨酸脱羧酶,天冬氨酸酶, 苄青霉素酰化酶,基因工程 研究用酶等
2. 枯草芽孢杆菌
特征: 细胞成杆状,(0.7~0.8) μm*(2~3) μm,单个, 无荚膜,周生鞭毛,运动, G+,菌落粗糙,不透明。 污白色或微带黄色。 产酶种类: α-淀粉酶、蛋白酶、β葡聚糖酶、碱性磷酸酶等
fMet
30s亚基
mRNA
IF-1+IF-2+IF-3 GDP+Pi
3.肽链的延伸
EF-T GTP*
fMet
aa1
fMet aa1
EF-T GDP+Pi
fMet
aa1
+EF-G +GTP
mRNA aa1
aa2 fMet fMet
aa1 aa2
tRNA1 EF-G GDP+Pi
fMet aa1 aa2
第二章 酶的发酵生产
第一节 酶生物合成的基本理论
一、中心法则 1958年 Crick:
转录
DNA A T 3 4 =64 C G 遗传密码
RNA A U C G
翻译
蛋白质
氨基酸
折叠密码
二、RNA的生物合成——转录
(一)RNA的种类和主a要功能 dsRNA:某些病毒遗传信息载体 催化活性RNA:催化作用 RNA的种类 tRNA:氨基酸载体 rRNA:与蛋白质共同组成核糖体 mRNA:蛋白质合成模板
• 酶的生物合成法生产:经过预先设计,
通过人工操作控制,利用细胞(包括微生 物细胞、植物细胞和动物细胞)的生命活 动,产生人们所需要的酶的过程。
二、酶的生物合成法生产种类
•微生物发酵产酶 •植物细胞培养产酶 •动物细胞培养产酶
优良的产酶细胞应具备的条件
• 1.繁殖快,产酶量高,有利于缩短生产周期。 • 2. 能在便宜的底物上良好生长。 • 3. 产酶性能稳定,菌株不易退化,不易受 噬菌体侵袭。 • 4. 产生的酶容易分离纯化。 • 5. 不是致病菌及产生有毒物质或其他生理 活性物质的微生物,才能确保酶生产和应 用的安全。
例:葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生 物合成
葡萄糖过 量降解
ATP
ADP, AMP
cAMP ↓ + H2O
cAMP-CRP↓
磷酸二酯酶
AMP↓
启动基因上没有 cAMP-CRP结合
酶合成↓
2.酶生物合成的诱导作用
加进某种物质, 无诱导物时: … R P O S1 S2 … DNA 使酶的生物合 成开始或加速 进行的过程。 简称为诱导作 添加诱导物时: 用,起诱导作 … R P O S1 S2 … DNA 用的物质,称 为诱导剂。
sRNA:分子修饰、代谢调节作用
(二)转录
以DNA为模板,以核苷三磷酸为底物,在 依赖DNA的RNA 聚合酶作用下,生成RNA的 过程。 nATP nGTP nCTP nUTP
DNA模板,Mg2+/Mn2+
RNA聚合酶
RNA+4nPPi
(三)RNA聚合酶
大肠杆菌RNA聚合酶:MW=5x105 全酶:由β β’ α ω σ组成,识别转录起始 位点,与DNA上的启动基因结合,使转 录开始。 核心酶:由β β’ α ω组成,进行核苷酸链 的延伸。
1948年Pauling提出过渡态理论 1975年Kohler合Milstein发明单克隆抗体技术 1986年Lerner合Schultz分别独立获得具有 催化活性的抗体
第二节 酶的生物合成法生产
一、基本概念
• 酶的生物合成:所有的生物体在一定条件 下都能够产生多种多样的酶。酶在生物体 内的产生过程,称为酶的生物合成。
5. 青霉
特征: 属于半知菌亚门,分生孢子 梗基部无足细胞,孢子梗 顶端不膨大成囊,而是多 次分枝形成扫帚状,小梗 末端形成分生孢子。 产酶种类: 葡萄糖氧化酶、果胶酶、 纤维素酶等
四、产酶菌种的筛选方法
胞内酶:含菌样品的采集→菌种分离→产酶性能
测定→复筛
①固体培养法:把菌种接人固体培养基中,保温 数天,用水或缓冲液浸泡培养基,将酶抽提,测 胞外酶: 定酶活力,这种方法主要适用于霉菌. ②液体培养法:将菌种接人液体培养基后,静置 或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异), 再测定培养物中酶的活力,通过比较,筛选
二、培养基的配制
培养基:是指人工配制的用于细胞培养和 发酵的各种营养物质的混合物。
碳源 氮源 无机盐 生长因素
三、pH调节
1.细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH值往往
不同,通常接近于该酶反应的最适pH。
2.有些细胞可以同时产生多种酶,通过控制培
养基的pH,往往可以改变各种酶之间的产量
比例。
3.培养基的pH在细胞生长繁殖和代谢物产生的
TTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC
5’
3’
5’端粒酶RNA
TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC
3’
5’端粒酶RNA
5’
TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC
端粒酶催化端粒的延伸
3’
5’端粒酶RNA
2.基因扩增加速酶的生物合成
基因扩增:是通过增加基因的数量来调节基因表 达的一种方式。
例:CHO在含有氨甲蝶呤的培养基上培养 编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增,二氢叶 酸还原酶合成速度加快。
3.增强子促进酶的生物合成
增强子:又称调变子,是一段能够高效增强或
促进基因转录的DNA序列。增强子的重要特性是
能够促进同源或异源启动基因的转录活性,其增 强效果有时可达1000倍。
4.抗原诱导抗体酶的生物合成