第二章 酶工程-酶的发酵生产
【图文】酶工程 2 酶的发酵生产-课件(PPT-精)52页PPT
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
【图文】酶工程 2 酶的发酵生产-课件 （PPT-精）
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。——塔西佗
5、虽然权力是一头固执的熊，可是金 子可以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
ห้องสมุดไป่ตู้ 谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
《酶工程》 课后习题答案
① 酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或者服务于其它目的地一门应用技术。
② 比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或者 RNA 所拥有的酶活力单位数。
③ 酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④ 酶活国际单位 : 1961 年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件 )下，每分钟内能转化1 μmol 底物或者催化1 μmol 产物形成所需要的酶量为 1 个酶活力单位，即为国际单位(IU)。
⑤ 酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
酶的研究简史如下：(1)不清晰的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生： 1777 年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验； 1822 年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化； 19 世纪 30 年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684 年，比利时医生Helment 提出 ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素(酵素)；1833 年，法国化学家 Payen 和Person 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶； 1878 年，德国科学家 K hne 提出 enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”(希腊文)。
(3)酶学的迅速发展(理论研究)： 1926 年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930 年，美国的生物化学家 Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
I.酶工程发展如下：①1894 年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908 年，德国的Rohm 用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911 年， Wallerstein 从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949 年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出的控制子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971 年各国科学家开始使用“酶工程”这一位词。
酶工程第二章微生物发酵产酶
细胞 浓度 mg/ml
酶 浓度 U/ml
细胞 浓度 mg/ml
酶 浓度 U/ml
以半乳糖醛酸为诱导物
以含有葡萄糖的果胶为诱导物
2、延续合成型
特点： 延续合成型的酶其生物合成可以受诱导物的诱
导，一般不受分解代谢物阻遏。 mRNA相当稳定。
3、滞后合成型
此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成 并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。
合成速率影响不大。如：DNA聚合酶、RNA聚 合酶、糖酵解途径的各种酶等。 适应型酶(adaptive enzyme)（调节型酶 regulated enzyme）： 在细胞中的含量变化很大，合成速率明显受到 环境因素的影响。如大肠杆菌分解乳糖的酶。 调节对象：适应型酶（调节型酶）
二、酶生物合成的调节
多种微生物混合发酵，保证有益微生物正常生长 繁殖和发酵代谢；
固态甑桶蒸馏提取成品酒。大曲酒酿造分为清渣 法和续渣法两种。
液体深层发酵
培养基：液体，在生物反应器中 优点： 适用范围广 机械化程度较高，技术管理较严格，酶的产率
较高，质量较稳定，产品回收率较高。 是目前发酵生产的主要方式。
制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等
(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）
理想的酶合成模式
对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等 先进技术,选育得到优良的菌株, 并通过工艺条件的优化 控制, 使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。
对于同步合成型的酶，要尽量提高其对应的mRNA的稳定性，
为此适当降低发酵温度是可取的措施；
对于滞后合成型的酶，要设法降低培养基中阻遏物的浓度，
第二章 微生物发酵产酶
细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有所 不同，而且往往低于最适生长温度，这是由于在较 低的温度条件下，可提高酶的稳定性，延长细胞产 酶时间。
在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新 陈代谢作用，不断放出热量，会使培养基的温度升 高，同时，热量不断扩散和散失，又会使培养基温 度降低，两者综合，决定了培养基的温度． 温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温， 故此在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换 装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。
8、 毛霉（Mucor）
毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，菌 丝体上直接生出孢子囊梗，分枝较小或单生，孢子 囊梗顶端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常带有针 状的草酸钙结晶。
毛霉用于生产蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂 肪酶、果胶酶、凝乳酶等。
9、 链霉菌（Streptomyces）
链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要菌株，还可以用于生 产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的16α羟化酶，可 用于甾体转化。
3．无机盐
无机盐的主要作用是提供细胞生命活动不可缺少 的无机元素，并对培养基的pH值、氧化还原电位 和渗透压起调节作用。 主要元素有：磷、硫、钾、钠、镁、钙等。 微量元素有：铜、锰、锌、钼、钴、碘等。 微量元素是细胞生命活动不可缺少的，但 需要量很少，过量反而会引起不良效果， 必须严加控制
4．生长因素（酵母膏、玉米浆、麦芽糖）
4、 提高酶产量的措施
–除了选育优良的产酶细胞，保证发酵工艺条 件并根据需要和变化情况及时加以调节控制 以外，还可以来取某些行之有效的措施，诸 如添加诱导物，控制阻遏物浓度，添加表面 活性剂或其他产酶促进剂等。
• 1）添加诱导物
– 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添 加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。
酶的发酵生产
酶工程•第一章绪论•第二章酶的发酵生产•第三章酶的分离纯化•第四章酶分子修饰•第五章酶与细胞固定化•第六章酶反应动力学•第七章酶的应用第一章绪论•第一节酶的概述•第二节酶工程概述•第三节酶的生产方法•第四节酶的应用前景第一节酶的概述一. 酶(enzyme)的概念二. 酶的研究历史三. 酶的分类与命名四. 酶的活力测定一. 酶(enzyme)的概念1.酶是催化剂（catalyst）所谓催化剂是一类能改变反应速度，但不改变反应性质、反应方向和反应平衡点，而且本身在反应前后也不发生变化的外在因素。
酶在化学反应中就是充当这样的角色。
2.酶是一种特殊的催化剂3.酶是生物催化剂酶在催化反应时，具有与一般非酶催化剂不同的特点。
其具有催化的高效性、高度专一性及化学本质是蛋白质的特点。
（1）酶具有催化的高效性酶能在温和条件下（常温、常压和近中性PH），极大地提高反应速度，与非酶催化剂相比，酶的催化效率可高出107~1012倍。
如：2H2O2 2H2O + O2该反应的催化剂可以有Fe+、血红素和过氧化氢酶，其催化反应的速度分别是：5.6×10-4mol/mol Fe+.S、6.0×10-1mol/mol血红素.S、3.5×106mol/mol过氧化氢酶.S（2）酶具有催化的高度专一性(specificity)酶作用的的专一性是指酶在催化反应时，通常只作用一种或一类反应物发生相应的反应的特性。
酶作用的专一性主要表现在以下几个方面：a. 绝对专一性：酶只能催化一种反应物发生反应的特性如：谷氨酸脱氢酶只能催化L-谷氨酸脱氢，对其他氨基酸没有作用，其具有绝对专一性。
b. 相对专一性：酶在催化反应时，允许底物分子有一些变化，即可以催化一类反应物发生反应。
如：酯酶催化酸与醇缩合成酯，但对反应物分子的侧链基团专一性不强。
淀粉酶、蛋白水解酶也具有这种专一性。
c. 异构专一性：酶对反应物分子的立体异构体和顺反异构体具有高度的选择能力。
酶工程02酶的生产
构基因(strucrtural gene)。
结构基因上的遗传信息可转录成mRNA上的遗传
密码，操纵基因可以特异的与调节成的时机与速度。
结构基因与操纵基因一起称为操纵子，启动基因决定 酶的合成能否开始，启动基因有两个组成位点，一是 RNA聚合酶结合位点，另一个是cAMP与环腺苷酸接 受蛋白（CRP)的复合物（ cAMP －CRP）结合位点，
培养基的pH和培养基的组成有关。如C/N高，则pH 偏酸，反之偏碱或中性，硫酸氨是生理酸性N源， 而硝酸钠是生理碱性N源，作为N源被消耗后，剩下 的离子显然会引起培养基pH的改变。
另外pH还和通气量有关，通气量足，糖、脂氧化完 全，对pH影响小；通气量不足，氧化不完全，中间 产物许多是有机酸，使pH下降。
一 酶合成的调节机制 操纵子（operon) Jacob和 Monod于1960年提出操纵子学说，1966年发现 了启动基因使这一调节控制理论不断完善。 根据这一理论，在DNA分子中与酶生物合成有密切关 系的基因有四种分别是调节基因（regulator gene)、启 动基因(promoter gene)、操纵基因(operator gene)和结
第三章
酶的生产
酶是由活细胞产生的有活性的蛋白质，酶来 自于生物体，早期酶的来源主要来自动植物细胞， 以后多用微生物细胞制取酶。随着动植物细胞大 规模培养技术的发展，从这些动植物细胞中制取 酶被人们重视起来。 但是不管用何种细胞，都应具备下述条件： （1）酶产量高 （2）易培养管理 （3）产酶性能稳定 （4）利于酶产品分离纯化
（二）pH对产酶的影响
pH对产酶影响很大。对绝大多数水解酶来说，产酶的 最适pH常与酶作用的最适pH相近，但是有些水解酶和 氧化酶产酶率最高的pH和酶作用的最适pH相距很远。 很多微生物能同时生产几种酶，控制培养基的pH ，常 可影响各种酶之间的比例，培养基的pH变化，常有利 于那些能形成中和介质的酶类生成。如大肠杆菌在高 pH下，合成的是氨基酸脱羧酶；在低的pH条件下，则 促进氨基酸脱氨酶的形成。
第二章 酶的生物合成与发酵生产
第二章酶的生物合成与发酵生产酶工程就是将酶所具有的生物催化功能，借助工程手段应用于社会生活的一门科学技术。
酶制剂是如何生产的呢？我们知道，酶是活细胞产生的具有催化作用的生物大分子，广泛存在于动植物和微生物体内。
酶的生产方法有三种：提取分离法、生物合成法、化学合成法。
生物合成法又包括：微生物细胞发酵产酶、植物细胞发酵产酶和动物细胞发酵产酶第一节酶生物合成及调节一、酶的生物合成先从遗传信息传递的中心法则谈起（1958年，Crick提出）遗传信息传递的中心法则：生物体通过DNA复制将遗传信息由亲代传递给子代，通过RNA 转录和翻译而使遗传信息在子代得以表达。
DNA具有基因的具有基因的所有属性。
基因是DNA的一个片段，基因的功能最终由蛋白质来执行，RNA控制着蛋白质的合成。
核酸是遗传的物质基础，蛋白质是生命活动的体现者。
1970年Temin和Baitimore发现了逆转录酶，是对中心法则的补充。
即：细胞能否合成某种酶分子。
首先取决于细胞中的遗传信息载体－DNA分子中是否存在有该酶所对应的基因。
DNA分子可以通过复制生成新的DNA，再通过转录（transcription）生成所对应的RNA，然后再翻译（translation）成为多肽链，经加工而成为具有完整空间结构的酶分子。
（一）RNA的生物合成--转录(transcription)P102DNA分子中的遗传信息转移到RNA分子中的过程，称为转录。
转录：见课件附图，书P102定义：以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。
模板链（template strand）：又称反意义链（antisense strand），指导转录作用的一条DNARNA的转录过程：转录过程分为三步：起始、延长、.终止补充：原核生物的RNA聚合酶(DDRP)-见课件附图E.coli的RNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体（α2、β、β′、）全酶（holoenzyme）包括起始因子σ和核心酶（core enzyme）。
酶工程微生物发酵产酶
2、控制阻遏物浓度 微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，或采用分次添加碳源的方法使培养基中的碳源保持在不致于引起分解代谢物阻遏的浓度。
3、添加表面活性剂 在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶促进剂，但它的作用机理尚未搞清；可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破了胞内酶合成的反馈平衡，提高了酶的产量。此外，有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用，可以提高酶的活力，例如在霉菌的发酵生产中添加 1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。
第三节 发酵工艺条件及其控制
保藏细胞 ↓ 细胞活化 ↓ 原生质体←细胞扩大培养→固定化细胞 ↓ ↓ ↓ 固定化原生质体 →发酵 预培养 ↓ 培养基 分离纯化 无菌空气 ↓ 酶
六、提高酶产量的措施 1、添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。一般可分为三类： ①酶的作用底物，例如乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的生成，青霉素是青霉素酚化酶的诱导物。 ②酶的反应产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生。 ③酶的底物类似物，例如异丙基-ß-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对ß-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。其中使用最广泛的诱导物是不参与代谢的底物类似物。
5、高产菌株的选育 目前，优良菌种的获得一般有三条途径：一是从自然界分离筛选；二是用物理或化学方法处理、诱变；三是用基因重组或细胞融合技术。
5、常用的产酶微生物
（1）细菌 大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌”。大肠杆菌可生产多种酶，如，谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、β-半乳糖苷酶、限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等。 枯草杆菌：用途很广，可用于生产α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等。 （2）放线菌 链霉菌：； ②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性； ③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等； ④作为自养菌的能源。 当盐浓度太高时，对微生物生长有抑制作用，而在较低浓度时却能刺激生长。 在微生物的发酵生产中，应特别注意有些金属离子是酶的组成成分，如钙离子是淀粉酶的成分之一，也是芽孢形成所必需的。
现代酶工程2酶的发酵生产
ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免 疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、 医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微 生物学、分类学、食品科学等的研究。
该中心保藏有藻类111株，细菌和放线菌16865株， 细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株， 植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物 病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。
•诱变或基因工程 来培育优良品种
•代谢物（酶反应的 底物、产物或类似物） 控制和调节酶的合成
•工艺调控
现代酶工程2酶的发酵生产
生产工艺-工艺流程-胞外
现代酶工程2酶的发酵生产
生产工艺-工艺流程-胞内
现代酶工程2酶的发酵生产
生产工艺 —— 培养基
•碳源、氮源、无机盐
•生长因子 —— 酶生产时需要供给微生物生长所需的氨基酸、
•液体发酵 技术原理
•液体深层发酵
•酶制剂生产的 •主要培养方式
•浸没式发酵
•原料的利用 率和酶的产 量都较高， 培养条件容
易控制
现代酶工程2酶的发酵生产
常用的酶制剂-1
现代酶工程2酶的发酵生产
常用的酶制剂-2
现代酶工程2酶的发酵生产
酶的生物合成
•酶的生物合成受基因和代谢物的双重控制
•基因决定形成酶 分子的化学结构
四个阶段 1、氨基酸活化生成氨酰－tRNA 2、肽链合成的起始 3、肽链的延伸 4、肽链合成的终止 思考:密码子偏爱性与翻译速率?
现代酶工程2酶的发酵生产
第二节 酶发酵生产常用的微生物 （酶的生产菌种）
酶工程--酶的微生物发酵生产 ppt课件
酶发酵生产的一般工艺流程图
保藏菌种
试管斜面培养（活化）
摇瓶扩大培养
种子罐培养 培养基 发酵罐
分离纯化 酶
无菌空气
二、酶生产菌种 （一）产酶菌种的要求
（1）产酶量高； （2）繁殖快，发酵周期短；
（3）产酶稳定性好，不易退化，不易被感染；
（4）能够利用廉价原料，容易培养和管理； （5）安全性可靠，非致病菌。
液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件 下发酵。
2、固体培养发酵
培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌 株，在一定条件下发酵。
3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）
将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。
4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）
原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。
酶合成的基因调控类型：诱导和阻遏
1、酶合成的诱导作用
加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为 诱导作用。 诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。 例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成 淀粉诱导a-淀粉酶的合成
2、酶合成的阻遏 （1）终产物阻遏
指酶催化反应的产物或代谢途 径的末端产物使该酶的生物合成受 到阻遏的现象。
二、应用微生物来开发酶的优点 1、微生物种类多，酶种丰富； 2、微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶； 3、微生物培养基来源广泛，价格便宜； 4、可采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程； 5、可利用以基因工程为主的近代分子生物学技术选 育菌种，增加酶的产率和开发新酶种。
三、酶发酵生产的类型 1、液体深层发酵：
第二节 酶生物合成的基本理论
一、酶生物合成的过程
DNA
转录
RNA
酶工程 1~10章题目及答案
第一章绪论试题精选一、名词解释1、酶2、酶工程3、核酸类酶4、蛋白类酶5、酶的生产6、酶的改性7、酶的应用8、酶的专一性9、酶的转换数二、填空题1、根据分子中起催化作用的主要组分的不同，酶可以分为_蛋白类酶_和核酸类酶_两大类。
2、核酸类酶分子中起催化作用的主要组分是_核糖核酸，蛋白类酶分子中起催化作用的主要组分是_蛋白质_。
3、进行分子内催化作用的核酸类酶可以分为_自我剪切酶_，_自我剪接酶_。
4、酶活力是_酶量_的量度指标，酶的比活力是_酶纯度_的量度指标，酶的转换数的主要组分是_酶催化效率_的度量指标。
5、非竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm_减小_，米氏常数Km__不变_。
三、选择题1、酶工程是（C）的技术过程。
A、利用酶的催化作用将底物转化为产物B、通过发酵生产和分离纯化获得所需酶C、酶的生产与应用D、酶在工业上大规模应用2、核酸类酶是（D）。
A、催化RNA进行水解反应的一类酶B、催化RNA进行剪接反应的一类酶C、由RNA组成的一类酶D、分子中起催化作用的主要组分为RNA的一类酶3、RNA剪切酶是（B）。
A、催化其他RNA分子进行反应的酶B、催化其他RNA分子进行剪切反应的R酶C、催化本身RNA分子进行剪切反应的R酶D、催化本身RNA分子进行剪接反应的R酶4、酶的改性是指通过各种方法（A）的技术过程。
A、改进酶的催化特性B、改变酶的催化特性C、提高酶的催化效率D、提高酶的稳定性5、酶的转换数是指（C）。
A、酶催化底物转化成产物的数量B、每个酶分子催化底物转化为产物的分子数C、每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数D、每摩尔酶催化底物转化为产物的摩尔数四、判断题（V）1、相同的酶在不同的pH条件下进行测定时，酶活力不同。
（V）2、竞争性抑制的特点是最大反应速度Vm不变，米氏常数Km 增大。
（X）3、催化两个化合物缩成一个化合物的酶称为合成酶。
（X ）4、RNA剪切酶是催化RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。
酶工程2酶的发酵生产
2020/3/25
生产工艺-中性蛋白酶工艺流程
2020/3/25
提高酶产量的方法
酶合成的调节机制：在正常情况下 ，酶产量受酶合成调节机制的控制，要 提高酶产量必须打破这种调节控制。酶 合成主要取决于转录水平的调节，原核 生物中普遍公认的调节机制是操纵子理 论。
2020/3/25
打破酶合成调节限制的方法：
• NBRC (NITE Biological Resource Center) 日本技术评价研究所生物资源中心
2020/3/25
ATCC
• ATCC (American Type Culture Collection）美 国典型菌种保藏中心
ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免 疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法 、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通 微生物学、分类学、食品科学等的研究。
第二章 酶的发酵生产
2020/3/25
酶的发酵生产
第一节 酶生物合成的基本理论 第二节 酶发酵生产常用的微生物 第三节 发酵工艺条件及控制 第四节 酶发酵动力学 第五节 动植物细胞培养生产酶
2020/3/25
第一节 酶生物合成的基本理论
一、RNA的生物合成——转录 二、蛋白质的生物合成——翻译 三、酶生物合成的调节
➢ 造粒对顾客及包含酶的最终产 品来说，都是一种非常有效和 安全的运输固态酶的方式。
生产工艺—生产废渣处理
将生产废渣用做肥料
即使是生产废渣也是 有用的；它们可以用 作肥料。
➢ 生产废渣实际上是有益于环境 的。可被用做当地农田的肥料。
➢ 确保所有的微生物均经灭活之 后才能从生产车间中运出。将 含硅藻土、培养基和微生物的 发酵液经加热及用碳酸钙进行 处理。处理后的发酵液废渣最 终为可持续性工业解决方案做 出了贡献。
酶工程2-1 微生物发酵产酶
30S起始复合物
fMet-tRNA正好位于mRNA的起始密码子上（AUG）。
3.大小亚基结合
原核生物
原核生物肽链合成的起始阶段是在GTP 和起始因子(initiation factor) 的参与下, 核糖体30S 亚基、f M et-tR N AF 、m R N A 和50S 亚基结合, 组成起始复合物的 过程,主要包括5 个步骤:
Met + tRNAF + ATP 氨酰-tRNA 合成酶 Met-tRNAF + AMP + PPi
Met-tRNAF
甲酰转移酶
f Met-tRNAF
2. 肽链合成的起始阶段
1.mRNA与小亚基结合：形成30S-mRNA-IF3复合物
2.AUG与蛋氨酰-tRNA结合：
30S-mRNA-IF3
fMet-tRNA-IF2-GTP
氨酰-tRNA合成酶
氨酰-tRNA+AMP+PPi
活化反应实际上分两步完成
第一步, 氨基酸活化生成氨酰腺苷酸酶复合物。 AA + ATP + E → E-AA-AMP + PPi 第二步, 氨酰基转移到tR N A 3′端的羟基上, 生成氨 酰tR N A , 同时使酶游离出来。 E-AA-AMP + tRNA → AA-tRNA + E + AMP 氨酰-tRNA合成酶还具有催化氨酰-tRNA水解脱酰基作用: 氨酰-tRNA合成酶 AA-tRNA AA + tRNA 校正功能： 保证蛋白质合成的真实性
固定化微生物细胞发酵(20 世纪70 年代后期)
固定化细胞: 指固定在水不溶性的载体上, 在一定的空 间范围内进行生命活动(生长、繁殖和新陈代谢等) 的细 胞。
酶的发酵工程
图2-1 温度调节装臵
第二章 酶的发酵工程
3. 溶解氧对产酶的影响与调节控制 临界氧浓度——不影响细胞正常代谢的最低氧浓度
溶氧浓度是由溶氧速率和耗氧速率来决定的。 调节控制 ① 调节氧分压 ② 增加通气量 ③ 延长气液接触时间，增加气液接触面积 ④ 改变培养液的性质 改变组分或浓度，添加消泡剂 改变进气压力或罐压，改变氧含量， 添加氧载体
第二章 酶的发酵工程
一、酶的生产菌种
（一）产酶微生物的种类 1. 细菌：大肠杆菌—青霉素酰化酶、L-天冬酰胺酶；
枯草芽孢杆菌—中性蛋白酶、中温α-淀粉酶； 地衣芽孢杆菌—高温α-淀粉
2. 放线菌：葡萄糖异构酶、谷氨酰胺转氨酶 3. 酵母菌：凝血激酶、尿激酶、植酸酶 4. 霉菌：黑曲霉、米曲霉—α-淀粉酶、糖化酶、乳糖酶、
醚，泡敌（聚环氧丙烷环氧乙烷甘油）。勤加、少加较好
第二章 酶的发酵工程
5. 湿度对产酶的影响与控制
对固体发酵产酶而言，影响微生物的产酶量，也会影
响产酶达到高峰的时间。
特定菌种，发酵过程的不同时期，对湿度要求不同。 固态发酵产酶，前期湿度低，后期湿度高，有利于产酶。
调节控制
配制培养基时，控制物料的含水量；控制鼓风量大小， 或调节空气的湿度；喷洒水分
第一节
酶生物合成的调节机制
一、原核生物中酶生物合成的调节
原核生物酶的合成主要是在转录水平上进行调节，调 节方式主要有酶合成的诱导和酶合成的阻遏两种方式 原核生物中酶合成的诱导和阻遏作用机制：Jacob和 Monod提出的操纵子理论
第二章 酶的发酵工程
（一）乳糖操纵子学说
1. 基本概念
操纵子：在代谢途径中功能密切相关的一组蛋白质编码
酶工程 酶的发酵生产
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第二章 酶的发酵生产
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酶的发酵生产
第一节 酶生物合成的基本理论 第二节 酶发酵生产常用的微生物 第三节 发酵工艺条件及控制 第四节 酶发酵动力学 第五节 动植物细胞培养生产酶
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第一节 酶生物合成的基本理论
一、RNA的生物合成——转录 二、蛋白质的生物合成——翻译 三、酶生物合成的调节
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重组E. coli一般先37ْC培养，加诱导剂后28ْC产酶。
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生产工艺 —— 工艺控制
通气搅拌的影响 ——
酶生产所用的菌种一般都是需氧微生物，培养时都需要 通气搅拌。一般，通气量少对霉菌的孢子萌发和菌丝生长有利， 对酶生产不利。因此必须根据不同的需要控制不同时期的通气量。
生长期与产酶的关系 ——
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在酶的工业生产中，为了提高酶产 率和缩短发酵周期,最理想的酶合成模式 是延续合成型；对于其它类型的酶,要在 菌种选育和工艺条件上加以调节；对于 同步合成型，尽量提高mRNA的稳定性， 如降低发酵温度;对于滞后合成型,尽量 减少阻遏物；对于中期合成型，要从提 高mRNA稳定性和解除阻遏两方面进行。
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NBRC
NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术 评价研究所生物资源中心 NBRC是由日本经济部、商业部、工业部支持的 半政府性质菌种保藏中心。 原为IFO ( Institute for Fermentation, Osaka, 大阪发酵研究所)。主要从事 农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工 业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。 该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母 164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。
一、RNA的生物合成—转录
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3. 链霉菌
特征： 最高等的放线菌。有发育良好 的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化 为营养菌丝、气生菌丝、65孢子 丝。孢子丝再形成分生孢子。孢 子丝和孢子的形态、颜色因种而 异，是分种的主要识别性状之一。 产酶种类： α-淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚 糖酶、碱性磷酸酶等
4. 黑曲霉
特征： 属于半知菌亚门, 菌丝有隔, 细胞多核；部分气生菌丝细胞 形成特化的厚壁、膨大的足细 胞，由足细胞的中间稍呈垂直 地向上延长，形成分生孢子梗。 产酶种类： 糖化酶、α-淀粉酶、酸 性蛋白酶、果胶酶、葡萄 糖氧化酶等
六、微生物产酶的方式及特点
1.固体培养发酵 优点：设备简单、操作方便、麸曲中酶浓度 较高、适合霉菌培养发酵 缺点：劳动强度大、原料利用率低、生产周 期长
2.液体深层发酵
3.固定化细胞
例：葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生 物合成
葡萄糖过 量降解
ATP
ADP, AMP
cAMP ↓ + H2O
cAMP-CRP↓
磷酸二酯酶
AMP↓
启动基因上没有 cAMP-CRP结合
酶合成↓
2.酶生物合成的诱导作用
加进某种物质， 无诱导物时： … R P O S1 S2 … DNA 使酶的生物合 成开始或加速 进行的过程。 简称为诱导作 添加诱导物时： 用，起诱导作 … R P O S1 S2 … DNA 用的物质，称 为诱导剂。
mRNA
翻译
添加阻遏物时： … R P O S1 S2 … DNA
共阻遏物
磷酸单酯 碱性磷酸酶 磷酸+醇
（三）真核生物中酶生物合成的调节机制 1.细胞分化改变酶的生物合成 2.基因扩增加速酶的生物合成 3.增强子促进酶的生物合成 4.抗原诱导抗体酶的生物合成
1.细胞分化改变酶的生物合成
（1）结合 DNA 3’ 5’ （2）延伸 DNA 3’ 5’ （3）移位 DNA 3’ 5’ 5’
三、酶发酵生产常用的微生物
1. 大肠杆菌
特征： 细胞成杆状，0.5μm*（1~3） μm，无芽孢，G-，菌落从 白色到黄色，光滑闪光，扩 展。 产酶种类：一般生产胞内酶 谷氨酸脱羧酶，天冬氨酸酶， 苄青霉素酰化酶，基因工程 研究用酶等
2. 枯草芽孢杆菌
特征： 细胞成杆状，（0.7~0.8） μm*（2~3） μm，单个， 无荚膜，周生鞭毛，运动， G+，菌落粗糙，不透明。 污白色或微带黄色。 产酶种类： α-淀粉酶、蛋白酶、β葡聚糖酶、碱性磷酸酶等
三、酶生物合成的调节
酶的类型
组成酶：DNA酶，RNA酶， 糖酵解途径的酶 调节酶：适应酶，β-半乳糖苷酶（诱导 酶）
酶合成的调节控制
转录水平的调节 转录产物的加工调节 翻译水平的调节 翻译产物的加工调节 酶降解调节
（一）操纵子学说 1960年Jacob和Monod提出的操纵子学说 调节基因：产生阻遏蛋白 启动基因 1.RNA聚合酶结合位点
过程中往往会发生变化。
四、温度的调节控制
1.细胞发酵产酶的最适温度与最适生长温度有
所不同，而且往往低于最适生长温度。
2.有些酶的发酵生产，要在不同阶段控制不同
的温度条件。
五、溶解氧的调节控制
调节溶解氧的方法：
（1）调节通气量
（2）调节氧的分压
（3）调节气液接触时间
（4）调节气液接触面积
（5）改变培养基的性质
DNA
A T C G
aRNA
A U C G
翻译
蛋白质
43=64
遗传密码
氨基酸
遗传密码的简并性：61种密码——20种氨基酸
遗传密码的通用性 密码子与反密码子的相互作用：
mRNA
密码子 反密码子
5’-X Y Z-3’ 3’-X’ Y’ Z’-5’ tRNA
Crick根据立体化学原理，于1966年提出了摆动假说： 密码子与反密码子的配对中，前两对严格按照碱基配 对原则，而第三对碱基则可以有一定自由度地摆动，所 以，某些tRNA的反密码子可以识别一个以上的密码子。
产生阻遏蛋白
原核生物中操纵子的类型
1.诱导型操纵子：乳糖操纵子
2.阻遏型操纵子：色氨酸操纵子
（二）原核生物中酶生物合成的调节机制 1.分解代谢物阻遏作用 2.酶生物合成的诱导作用 3.酶生物合成的反馈阻遏作用
1.分解代谢物阻遏作用
是指容易利用的碳源 阻遏某些酶（主要是 诱导酶）生物合成的 现象。
五、酶的发酵生产方式
1.固体培养发酵
2. 液体深层发酵
3. 固定化细胞
4. 固定化原生质体发酵
第四节 发酵工艺的条件及控制
酶发酵生产的一般工艺流程
保藏细胞
细胞活化
原生质体
固定化原生质体 培养基
细胞扩大培养
固定化细胞 预培养
发酵
无菌空气 分离纯化 酶
一、细胞活化与扩大培养
细胞活化：保藏细胞在使用之前必须接种于新鲜的斜 面培养基上，在一定条件下进行培养，以恢复细胞的 生命活力，这就叫细胞的活化。 种子培养基：用于细胞扩大培养的培养基。 氮源丰富 碳源少 温度、pH、溶解氧 接种量：1~10%
5. 青霉
特征： 属于半知菌亚门,分生孢子 梗基部无足细胞，孢子梗 顶端不膨大成囊，而是多 次分枝形成扫帚状，小梗 末端形成分生孢子。 产酶种类： 葡萄糖氧化酶、果胶酶、 纤维素酶等
四、产酶菌种的筛选方法
胞内酶：含菌样品的采集→菌种分离→产酶性能
测定→复筛
①固体培养法：把菌种接人固体培养基中,保温 数天,用水或缓冲液浸泡培养基,将酶抽提,测 胞外酶： 定酶活力,这种方法主要适用于霉菌. ②液体培养法：将菌种接人液体培养基后,静置 或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异), 再测定培养物中酶的活力,通过比较,筛选
活性中心
（六）转录的终止
模板DNA分子上每个基因或每个操纵子都含有一个 终止信号——终止子。当RNA聚合酶转录到达这个 信号时，合成的RNA分子以及聚合酶与模板DNA分 离，RNA链的合成便被终止。 ATP→ADP+Pi 5’
ρ RNA聚合酶 终止子
（七）RNA前体的加工
1.剪切反应 2.剪接反应 3.末端连接反应：
TTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC
5’
3’
5’端粒酶RNA
TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC
3’
5’端粒酶RNA
5’
TTGGGGTTGGGGTTGGGG3’ CCAACCCC
端粒酶催化端粒的延伸
3’
5’端粒酶RNA
2.基因扩增加速酶的生物合成
基因扩增：是通过增加基因的数量来调节基因表 达的一种方式。
诱导物 转录
举例： 乳糖诱导β-半 乳糖苷酶的合成
翻译 酶
mRNA
乳糖
别乳糖
3.酶生物合成的反馈阻遏作用（产物阻遏作用）
是指酶催化作用的 产物或代谢途径的 末端产物使该酶的 生物合成受阻的过 程。引起反馈阻遏 的物质，称为共阻 遏物。
举例：无机磷酸阻 遏碱性磷酸酶
无阻遏物时： … R P
O S1 S2 … DNA
RNA生物合成的起始位点在DNA的启动基因 （启动子)上 起始阶段的重要问题是RNA聚合酶与DNA 的启动基因的相互作用，起始阶段包括：
全酶的形成 酶与模板结合 酶与启动基因结合 模板DNA局部变性 转录开始
（五）转录的延伸
转录泡，17bp
解旋
重旋 5’ DNA 3’
3’
RNA 5’
RNA-DNA杂交体，8bp 酶的移动方向
例：CHO在含有氨甲蝶呤的培养基上培养 编码二氢叶酸还原酶的基因大量扩增，二氢叶 酸还原酶合成速度加快。
3.增强子促进酶的生物合成
增强子：又称调变子，是一段能够高效增强或
促进基因转录的DNA序列。增强子的重要特性是
能够促进同源或异源启动基因的转录活性，其增 强效果有时可达1000倍。
4.抗原诱导抗体酶的生物合成
fMet aa1
tRNA2 +EF-G +GDP+Pi
+EF-G +GTP
+EF-T +GDP+Pi
aa2 +EF-T
+GTP
4.肽链的终止
终止密码子：UAA, UAG, UGA 释放因子（Release Factor）: RF-1：UAA, UAG RF-2：UAA, UGA
5.翻译后加工
去除甲酰基 去除N-末端的氨基酸 肽链折叠
sRNA：分子修饰、代谢调节作用
（二）转录
以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在 依赖DNA的RNA 聚合酶作用下，生成RNA的 过程。 nATP nGTP nCTP nUTP
DNA模板，Mg2+/Mn2+
RNA聚合酶
RNA+4nPPi
（三）RNA聚合酶
大肠杆菌RNA聚合酶：MW=5x105 全酶：由β β’ α ω σ组成，识别转录起始 位点，与DNA上的启动基因结合，使转 录开始。 核心酶：由β β’ α ω组成，进行核苷酸链 的延伸。
真核生物RNA聚合酶：三种
聚合酶种类 RNA聚合酶I RNA聚合酶II RNA聚合酶III
别名 存在位置
rRNA RNA 不均一RNA 小分子RNA 聚合酶 聚合酶 聚合酶 核仁 核仁 核之
相对分子质 量/103
催化反应产物
550
rRNA
600
mRNA
600
tRNA 5SrRNA
（四）转录的起始
二、培养基的配制
培养基：是指人工配制的用于细胞培养和 发酵的各种营养物质的混合物。
碳源 氮源 无机盐 生长因素
三、pH调节
1.细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH值往往