米氏凯伦藻在三种无机氮源的生长情况

米氏凯伦藻在三种无机氮源的生长情况

吕颂辉1，黄凯旋2

1. 暨南大学赤潮与水环境研究中心，广东 广州 510632；

2. 暨南大学水生生物研究中心，广东 广州 510632

摘要：米氏凯伦藻引发的赤潮危害鱼类和无脊椎动物，给养殖业带来严重的经济损失，研究其营养生理生态，对掌握该藻形成赤潮的规律有着重要的意义。采用一次培养的实验方法研究了米氏凯伦藻（Karenia mikimotoi Hansen ）在三种无机氮源不同氮磷浓度比(c N /c P )下的生长情况。结果表明：在分别以氯化铵、硝酸钠和亚硝酸钠为氮源时，米氏凯伦藻生长的最适c N /c P 比分别为32、32和100。米氏凯伦藻对氯化铵的利用效率相对低于硝酸钠和亚硝酸钠，以氯化铵为氮源该藻生长缓慢，细胞密度低；而分别以硝酸钠和亚硝酸钠为氮源时该藻生长情况较好，可较长时间维持高的细胞密度。 关键词：米氏凯伦藻；氯化氨；硝酸钠；亚硝酸钠；氮磷浓度比

中图分类号：X17 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2007）05-1337-05

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hansen)属于裸甲藻目（Gymnodiniales ），凯伦藻属（Kerenia ），它能分泌溶血性毒素和鱼毒素，有溶解鱼类鳃组织细胞的作用。中毒鱼鳃出现鳃小叶上皮细胞增生、邻近鳃小叶粘连、上皮细胞脱落、鳃血管破裂、血细胞渗出等组织病理现象。鳃小叶作为鱼类呼吸系统的重要组成部位，一旦发生上述病变，必将影响到鳃的呼吸、分泌、排泄等功能，最终造成鱼类的死亡。米氏凯伦藻分布广泛，是近年来常见的赤潮生物，并且已经在澳大利亚、北欧各国、日本、新西兰、南美、北非、我国香港等地引发过赤潮灾害，造成了严重的渔业经济损失[1，2]。1998年3至4月份，大鹏湾、深圳湾、珠江口及内伶仃岛一带海域和香港海域发生的大规模米氏凯伦藻赤潮，导致深圳经济损失超过千万人民币，香港渔农损失超过3亿港元[3，4]。研究米氏凯伦藻的营养生理，掌握其形成赤潮的规律，对于减少水产养殖业损失，保护海洋生态环境，有着重要的实际意义。

有害赤潮的发生是物理、化学、生物和气候等多方面因素综合作用的结果，在众多要素中，营养盐是赤潮发生的首要物质基础，因此研究营养盐在赤潮发生和演替中的作用对探究赤潮的成因和防治具有重要的理论意义和实用价值[5]。本文选取的营养盐为无机氮源，以观察藻种种群的生长周期为主，研究不同无机氮源下米氏凯伦藻的生长特性。无机氮是海洋浮游植物生长繁殖必不可少的营养元素，溶解态无机氮主要包括NH 4-N 、NO 3-N 、NO 2-N 。藻类不能直接利用Ｎ2，只能以NH 4-N 、NO 3-N 、NO 2-N 为氮源，单细胞藻类对各种氮源的利用具有不同特点，许多学者认为藻类最优先利用铵盐，然后是硝酸盐、尿素和亚硝酸盐。海水中氮磷的增加与赤潮的发生存在一定的关系，同时氮磷

浓度含量的比率也是影响海洋浮游植物群落组成的重要因素之一，不同的氮磷浓度比影响藻类细胞的生长速率和细胞内物质的合成。海洋中的浮游植物按一定比例利用海水中的氮磷，这一恒定比例称为Redfield 系数（c N /c P =16）。海水中营养盐摩尔比值偏离Redfield 系数过高或过低，均可导致浮游植物的生长受到某一相对低含量元素的限制，并且不同的浮游植物有各自适合细胞生长繁殖的最佳氮磷浓度比。根据Redfield 系数，藻类在生长时按16：1的比例吸收海水中的氮磷，也有研究表明规范的Redfield 系数并不是适合于所有浮游植物，不同浮游植物利用氮磷的比例存在一定差别[6-9]。为了解米氏凯伦藻氮营养生理特征，本文在实验室条件下采用一次培养的方法，研究米氏凯伦藻在不同无机氮源（NH 4-N 、NO 3-N 、NO 2-N ）及不同氮磷比下的生长情况。

1 材料与方法

1.1 实验藻种

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi Hansen)分离自南海赤潮高发海域，经纯化后保存于暨南大学赤潮与水环境研究中心藻种室。实验前将处于对数生长期的实验藻种离心，用无氮无磷的f/2培养基培养2天后再接种。 1.2 培养条件

氮营养实验所用的器皿均以5％的HCl 浸泡过夜，超声波洗涤机清洗后以去离子水反复冲洗，灭菌后备用。其余实验所用的器皿用自来水洗净后，以蒸馏水反复冲洗，灭菌后备用。培养基采用外海天然海水，按照不含硅酸盐的f/2配方配制，其中氮、磷浓度按实验要求另加。培养基经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min 后备用。培养温度为(25±1) ℃，光照强度约为100 µEm -2s -1，光暗比为12 h ∶12 h 。

1338 生态环境 第16卷第5期（2007年9月）

1.3 实验方法

以NaH 2PO 4﹒2H 2O 作为唯一磷源，NH 4-N 、NO 3-N 、NO 2

-N 分别作为氮源进行一次性培养实验。实验中设置初始磷浓度均为0.65 μmol·L -1(根据赤潮高发区水域磷的平均值设定)，初始氮浓度依次为：0（对照组）、0.65 μmol·L -1、2.60 μmol·L -1、10.40 μmol·L -1、20.80 μmol·L -1、65.00 μmol·L -1；使其氮磷浓度比分别为：0、1、4、16、32和100。每种氮源分为6个浓度梯度，每个浓度设两个平行样品。接种的初始密度约为500 ｍL -1，培养液的总体积为30 mL ，用100 mL 的锥形瓶在培养箱进行培养。

1.4 测定和计算方法 1.4.1 细胞计数

使用0.1 mL 浮游生物计数框，在Olympus CH30型双筒显微镜下进行细胞计数。自接种当天起，每2天在同一时间计数，得到单位培养液中的细胞密度值。

1.4.2 数据处理

根据公式μ = (Ln X t - Ln X o )/△t 求出比生长率，X o 表示初始细胞密度，X t 表示隔天后细胞密度。运用SPSS 13.0软件对所得细胞密度均值进行多重比较统计分析（LSD 法）。

2 结果

2.1 米氏凯伦藻在不同NH 4-N 浓度的生长情况

以NH 4-N 为氮源，米氏凯伦藻在c N /c P 为32和100时，细胞密度可以达到1×103 ｍL -1的水平（图1），持续的时间分别为6 d 和4 d 。米氏凯伦藻细胞长18～37 μm ，宽14～35 μm [10]，根据现有的赤潮评价标准[11]，此细胞大小的米氏凯伦藻其细胞密度达到1×103 mL -1以上时，即可以形成米氏凯伦藻赤潮。c N /c P 为100时细胞密度达到最高值的时间比c N /c P 为32的延迟了3至4 d ，这可能与高浓度的铵

盐有抑制藻类生长的作用有关。当c N /c P 为1、4和

16时，藻细胞密度增长不明显，生长平缓，较早进

入衰亡期。图2显示，

c N /c P 为32时其比生长率0.27

d -1为最大值。细胞密度均值统计分析表明：c N /c P

为32时与对照组细胞密度差异极显著（P < 0.01），且与c N /c P 为1时存在差异（P < 0.05）；c N /c P 为100时与对照组细胞密度差异显著（P < 0.05）。综合细胞密度和比生长率两个指标，以NH 4-N 为氮源，c N /c P 为32时最适于米氏凯伦藻生长。

2.2 米氏凯伦藻在不同NO 3-N 浓度的生长情况

以NO 3-N 为氮源，不同浓度下米氏凯伦藻细胞密度都能达到1×103 mL -1的水平，而且生长没有出现抑制现象，培养基加入NO 3-N 氮源后藻细胞在第

4天即进入对数生长期，各生长曲线见图3。c N /c P

为100时其比生长率0.41 d -1为最高值，见图4。

c N /c P 为4的比生长率略高于c N /c P 为16和32的，当其细胞密度达到最高值后，细胞密度一直下降，这可能与前4天米氏凯伦藻大量利用NO 3-N ，使得藻液中低浓度的N 不足以提供藻细胞的继续生长和繁殖有关。相反，在c N /c P 比为16至100的培养中，细胞密度达到最大值后细胞密度仍可以保持在1×103 mL -1的水平，持续的时间长达10

d 。细胞密度的均值分析显示： c N /c P 为16时与对照组细胞密度差异显著（P < 0.05）；c N /c P 为32和100时与对照组细胞密度差异极显著（P < 0.01）；1～100间的c N /c P 细胞密度无差异（P > 0.05）。以NO 3-N 为氮源，米氏凯伦藻在各浓度下都有较好的增长，细胞密度不存在差异。

2

4

6

8

10

12

培养时间/d

细胞密度/（×103 m L -1）

图1 不同NH 4-N 米氏凯伦藻的生长曲线 Fig. 1 Growth of K . mikimotoi at different NH 4-N levels

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

1

4

16

32

100

c N /c P

最大比生长率

图2 不同NH 4-N 米氏凯伦藻的最大比率

Fig. 2 Specific growth rate of K . mikimotoi at different NH 4-N levels