微生物原生质体融合育种技术及其应用

微生物原生质体融合育种技术及其应用
摘要：
工业微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位。

微生物原生质体融合(microbialprotoplast fusion)技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点,是微生物育种最常用的方法之一。

结合相关研究进展,分析了原生质体融合技术的组成,包括制备、再生、融合的影响因素以及融合子的筛选方法,重点评述了原生质体融合技术应用在微生物育种中的最新进展,以及微生物原生质体融合技术的发展前景。

关键词：微生物原生质体融合遗传育种基因组重组
引言：
微生物菌种是发酵工业中的一个关键因素,它决定了发酵过程的成败及某一发酵产品是否具有工业化价值。

自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。

原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。

与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。

1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum)营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。

接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。

本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。

1 资料和方法：
1.1 资料来源
由第一作者在CNKI进行检索。

网址：/。

英文资料的检索时间范围为2007/2012；中文资料的检索时间范围为2007/2012。

英文检索词为“protoplast fusion、research、progressions”；中文检索词为“原生质体融合、应用、研究进展”。

1.2 入选标准
纳入标准：①原生质体融合技术过程及其影响因素。

②原生质体在微生物工程中的应用③原生质体技术应用的工业实例。

排除标准：①与此文目的无关。

②较陈旧的文献。

③重复同类研究。

1.3 质量评估
原生质体融合技术的论文56篇，综述性29篇，研究应用型27篇（其中工业应用型20篇）。

2 结果：
2.1 纳入文献基本情况
初检得到56篇文献，中文50篇，英文6篇。

阅读标题和摘要进行初筛，排除因研究目的与此文无关36篇，内容重复性的研究10篇，共保存10篇文献做进一步分析。

选取最具代表性的6篇文章进行具体分析。

第1篇是对原生质体融合技术及其应用的综述性文章，第2篇研究了影响原生质体融合的因素。

第3—6篇是关于原生质体在微生物工程中具体应用的文章，其中第6篇是原生质体融合技术与分子克隆技术相结合的方法，体现了原生质体发展的新方向。

2.2 结果描述
2.2.1 原生质体融合技术
原生质体融合技术一般分成五大步骤:直接亲本及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备和再生,亲本原生质体诱导融合,融合重组体筛选,遗传特性分析和测定。

2.2.1.1 原生质体的制备和再生
原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法,现在使用较多的为酶法。

在放线菌和细菌中,主要采用溶菌酶,酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、消解酶或纤维素酶等。

2.2.1.2 原生质体的融合
由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非常低,因此在实际育种过程中要采用一定方法进行人为诱导融合。

在微生物原生质体融合中,诱导融合方法主要有化学法(一般采用PEG结合高Ca2+、pH诱导法)、物理法(包括电融合和激光诱导融合法等)。

2.2.1.3 融合子的筛选
利用营养缺陷型标记筛选融合子：融合双亲为不同的营养缺陷型,原生质体融合后于基本培养基进行培养。

由于双亲都丧失了合成某种物质的能力,在基本培养基上不能生长,而在融合子中,缺陷的遗传物质得到互补,所以可在基本培养基上长出菌落,利用这种方法即可检出融合子。

利用抗药性标记筛选融合子：微生物的抗药性是由遗传物质决定的,不同种微生物对同种药物的抗性存在差异,利用这种差异即可对融合子进行筛选。

利用灭活标记筛选融合子：通过灭活标记筛选融合子是指将单亲或双亲的原生质体经紫外线照射、加热或经过某些化学药剂处理,使其丧失在再生培养基上再生的能力,两亲株融合后,融合子损伤互补,因而可在再生培养基上存活。

利用荧光染色标记筛选融合子：在制备原生质体时,向酶解液中加入不同荧光色素,使双亲原生质体在特定波长下呈现不同颜色,原生质体融合后,直接选出带有两色荧光的融合子即可。

利用某些特殊的生理特征作为标记筛选融合子：利用亲本对营养物质利用及固氮能力方面的差异来筛选融合子。

利用生化测定指标选择融合子：通常测定的生化项目有DNA含量、氨基酸量、酸性磷酸酶、同工酶和电泳等。

DNA含量的测定有两种方法:一是提取DNA 后,以紫外分光光度计测定其含量;二是直接以显微分光光度计测定孢子或菌丝的
DNA含量,一般来说,融合子的DNA含量高于任何一个亲本的博莱霉素(IJK)含量,但却少于双亲DNA含量之和。

一般情况下,比较融合子与双亲氨基酸含量百分比,电泳测定亲本和融合子酸性磷酸酶同工酶和酯酶同工酶酶谱,两者的酶谱存在着一定的差异。

常被用作非人工标记鉴别融合子的辅助性方法。

2.2.2 影响原生质体融合技术的因素
2.2.2.1 影响原生质体制备的因素
培养基成分对原生质体制备的影响：用酶分解微生物细胞壁,首先要培养菌体或菌丝体。

菌体生长的培养基对原生质体化有明显影响,并且这种影响视微生物而异。

原生质体化前在培养基中加入某些物质阻止细胞壁的合成,可以提高酶解的效果。

培养方式对原生质体制备的影响：不同菌种或同一菌种用同一的培养方法原生质体化效果可能不一样,丝状真菌常用平板玻璃纸法,细菌和酵母菌多用液体震荡培养。

菌龄对原生质体制备的影响:微生物生理状态是原生质体化的重要影响因素之一。

菌龄过长,菌丝细胞壁老化增厚,不易于释放原生质体;过短则菌丝体容易破裂,释放原生质体数量较少。

一般年轻菌丝和顶端菌丝有利于原生质体的制备和再生。

菌体浓度对原生质体制备的影:酶解时一般先将菌液离心收集菌丝体,然后加入一定量的酶液。

适合的菌体密度可让细胞与酶充分接触反应,提高酶解效果。

菌丝体密度一般以3ml酶液中加入300 mg新鲜菌丝体为宜。

酶系和酶浓度对原生质体制备的影响:利用酶分解细胞壁,由于各菌种细胞壁的成分和结构存在差异,因此不同的菌株所用酶的种类和浓度都有很大差异。

酶的种类、浓度是制备原生质体最关键的因素。

细菌一般采用溶菌酶去壁,浓度为0.02~0.5 mg/ml。

酶解时间对原生质体制备的影响：酶解时间的长短直接影响原生质体化的效果,处理时间过短,脱壁不完全;处理时间过长,会导致原生质体脱水皱缩,再生率显著降低。

时间从20min~10 h不等。

温度对原生质体制备的影响：不同的酶均有各自的最适酶解温度。

酶解时温度选择的原则是既有利于原生质体化,又能防止原生质体被破坏。

细菌的最适酶解温度一般为35~37e或42e,真菌的最适酶解温度为30~35e,放线菌的最适酶解温度为28~37e。

pH值对原生质体制备的影响：酶解时的pH值随酶和菌种有一定的差异,需根据实际情况对pH值进行优化。

pH6.0对菌种S-37原生质体制备有利。

缓冲液和稳定剂对原生质体制备的影响：细胞壁脱去后,原生质体必须在高渗环境中保存及生长,否则会因为渗透压而破裂。

稳定剂类型和渗透压也是原生质体制备的重要因素。

选用合适的稳定剂不仅能获得较高的原生质体制备率,而且得到的原生质体大小较均匀。

常用的缓冲液有磷酸缓冲体系和柠檬酸缓冲体系。

渗透压稳定剂分为两类:一类是盐溶液系统,包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2,浓度为0.3~1.0 mol/L;一类是糖溶液系统,包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖、纤维二糖、鼠李糖等,浓度为0.3~0.6 mol/L。

一般认为易于渗入细胞膜或易被分解的物质不宜作稳定剂。

酶解方式对原生质体制备的影响：制备原生质体时轻轻摇动或敲击管壁可让酶与菌体混合更均匀,并保持良好的通气条件,有利于提高原生质体率。

有人曾对比了用试管、锥形瓶和培养皿等容器制备原生质体的效果,结果使用培养皿时原
生质体分离效果最好,原生质体制备率高于试管或锥形瓶3~5倍。

2.2.2.2 影响原生质体融合的因素
融合剂PEG对原生质体融合的影响：仅将原生质体混合在一起融合频率并不高,需要添加PEG(聚乙二醇)提高融合率。

PEG的相对分子量和浓度高低对融合都有较大影响。

PEG的浓度一般为30%~50%,浓度过高会导致原生质体皱缩甚至中毒,过低导致原生质体破裂。

PEG的相对分子量从1 000~6 000不等,因菌种不同而定。

融合时间和温度对原生质体融合的影响：PEG处理时间是融合的最关键因素之一,尤其是对高Ca2+和高pH值溶液处理时,时间长短非常重要。

PEG溶液加入后,原生质体间即强烈地发生黏着,融合能长时间有效进行,因此PEG处理的时间常很短。

融合处理时间1~60 min,大多数情况下为1~10 min。

由于PEG有一定的毒性,处理时间过长,会导致原生质体失活。

温度对原生质体融合也有一定的影响。

细胞膜在较高温度下流动性增加, PEG黏度下降,有利于原生质体的融合。

融合菌株间的亲和力对原生质体融合的影响：到目前为止,并不是所有的菌种间都能利用原生质体融合技术进行融合,其中很大一部分原因是亲本菌株间的亲源关系造成的。

虽然原生质体融合技术能够跨越种、属的界限,但某些远源关系的菌株融合后融合子重组染色体不稳定,容易发生分离现象。

另外,原生质体的活性不高也会导致融合率低下。

无机离子对原生质体融合的影响:原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合,而K+、Na+会显著降低融合率,融合时一般Ca2+0.01 mol/L、Mg2+0.02 mol/L为佳。

各菌种间略有差异。

2.2.2.3 培养基对原生质体再生的影响
再生培养基的组成对原生质体的再生影响相当明显,培养基中碳源会影响微生物原生质体的再生率。

在菌体生长培养基中添加适量的某些营养因子可有效提高再生率,常用的有酵母膏、蛋白质、氨基酸、水解酪蛋白、琥珀酸钠等。

稳定剂对原生质体再生的影响:稳定剂的种类和渗透压的大小是原生质体保持形状不破裂的关键因素,也是原生质体再生中的重要影响因素。

一般情况下,再生培养基中的最适稳定剂和最佳渗透压与酶解时类似,可以参照酶解时的条件进行。

酶解浓度和时间对原生质体再生的影响:酶解浓度和时间不仅仅影响原生质体制备,而且还会影响到原生质体再生。

酶浓度过高,时间过长,细胞壁去除完全,可以有效提高原生质体制备率。

但细胞脱壁太彻底,必然会影响原生质体的再生率。

再生方式对原生质体再生的影响:原生质体的再生可以通过固体或液体培养两种方式完成,同液体培养法相比,固体培养法明显有利于原生质体的再生。

微生物细胞去壁后很容易因为机械压力而破裂,可采用双层平板法再生:下层为固体培养基,上层为半固体培养基,中间摊布原生质体。

原生质体密度对原生质体再生的影响:再生时再生培养基上的菌体密度不能过高,否则先生长出的菌落会后覆盖生长的菌落。

其它因素对原生质体再生的影响:菌龄、预培养、残存菌体等因素对原生质体再生也有一定的影响,可以参考制备时的条件。

2.2.3 原生质体融合技术的研究进展
原生质体融合技术在微生物育种中的应用已经相当广泛，应用范围主要包括以下几方面。

改良菌种遗传特性：酿酒酵母是酿酒生产的菌种，在发酵后期，那些能凝集并形成絮状的酵母称凝集性酵母，而那些沉淀性不好的酵母称为粉状酵母。

具有良好凝集性的酵母可使酿酒发酵液澄清速度加快，降低酵母分离时的能量消耗，并且还可防止酵母在发酵液中长时间悬浮，导致细胞自溶而影响啤酒的风味。

酿酒酵母的凝集特性由其本身的遗传特性决定，一般凝集性较好的酿酒酵母往往发酵度偏低。

如果应用原生质体融合技术就能选育出具有较高的发酵度又具有较强的凝集性的融合重组菌株。

优化菌种发酵特性：许多微生物能在较高的温度下生存，有的能在45 ℃～65 ℃甚至更高温度下生长。

有的耐热菌可在98 ℃的温泉中生长繁殖。

这种耐热特性在工业上具有很重要的应用价值。

如在酒精酿造中，酿酒酵母在40 ℃时产酒率明显下降，要降低发酵液的温度，必须消耗大量能源。

因此，将酿酒酵母396（能利用甘蔗糖蜜生产酒精）和假丝酵母C6（45 ℃生长良好）原生质体融合，筛选得到在40 ℃条件下培养，原料利用率达94.3 ％，乙醇产量为59.7 g/L 的属间融合株。

质粒转移：微生物可通过转化、转导、接合和转染等多种方式传递遗传信息，但有些微生物不具备这些条件，它们的遗传物质传递研究和育种工作皆受到一定的限制。

由于原生质体融合可在种内、种间甚至更为远缘之间进行，因而通过原生质体融合有可能将质粒转移到非感受态菌株中，为基因转移和育种提供了新的途径。

原生质体与细胞核融合：现在还发展了细胞核与原生质体融合的方法，实现细胞核的直接转移。

该法首先制备营养缺陷型亲株的原生质体，然后使其在低渗溶液中破裂而释放出细离心，收集细胞核。

将细胞核与受体菌原生质体混合，在PEG 和Ca2+存在下进行融合，分离到基本培养基上选择融合子。

这一转移机制为：在PEG 和Ca2+存在条件下，受体菌原生质体在融合过程中，随着细胞膜的融合，捕获了供体菌的细胞核并将其摄入原生质体中。

应用这一技术可研究核与核，以及核与胞质之间的相互关系，并为育种工作提供了新的模式。

原生质体融合技术在其它微生物育种方面的应用：裘娟萍等以原生质体融合技术构建广谱抗噬菌体菌株。

肖在勤等将热灭活的凤尾菇原生质体与金针菇原生质体融合，选出双亲细胞质和细胞核都融合的无锁状联合菌株，经融合核分裂技术处理后，融合核分裂成为具有锁状联合的双核菌株。

通过原生质体融合技术还可对耐热机理进行研究。

如有一株耐高温酵母一旦经EB诱变失去线粒体变为小菌落后，即失去耐高温特性。

说明耐热性与线粒体有关系。

因而应用原生质体技术对耐热性的转移和对耐热机理进行研究将是一条途径。

原生质体融合技术在植物育种中的应用: 植物原生质体培养和原生质体融合不仅是植物遗传改良的重要手段之一, 而且原生质体也是研究植物细胞壁再生、细胞分裂和分化等一系列细胞遗传和生理过程的良好试验材料。

应用原生质体融合技术获得体细胞杂种, 可以克服其种间杂交不育的缺点, 也可以将野生植物中的核控制和胞质控制的优良品质、农艺性状及抗性基因转入栽培种中。

兽医预防科学领域的应用：在已有原生质体融合的研究基础上,进行的主要是把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上,对血清型多而又无交叉免疫保护的病原菌研制多价疫苗时,有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量,达到提高免疫效果的目的。

2.2.4 新技术的提出
基因组重排技术：20世纪90年代,美国加州Maxgen公司在原生质体融合技
术的基础上提出了基因组重排技术(genomeshuffling)技术的概念,基因组重排技术是经典微生物诱变育种技术与原生质体融合技术的有机结合。

首先对微生物菌体进行诱变,筛选出正向突变菌株,然后通过原生质体/递推式融合使正向突变的若干个菌株进行原生质体融合,筛选出符合育种要求的融合子,从而在短时间内获得性状得到大幅度提高的菌株。

由于此技术在无需了解微生物遗传性状的条件下即能实现微生物的定向育种,获得正向突变的菌株,自此技术诞生以来,短短几年时间里在工业生产菌种改进及开发方面就获得了成功的应用。

分子克隆与原生质体融合育种技术相结合：如王将分子克隆与原生质体融合育种技术相结合，从高产Monacolin K 的转化子H1 基因组中获得T-DNA 夹带的Monacolin K 合成关联的DNA 片段(mkWL)。

并且建立了以潮霉素为遗传标记的红曲菌原生质体融合方法。

2.2.5 原生质体融合技术的展望
在过去的30多年中,原生质体融合技术逐步发展完善,并已成功应用于微生物育种技术中。

影响原生质体制备、再生、融合的影响因素相当复杂,在不同的条件或方法下得率相差极为显著,合适的条件制备率可达90%以上。

原生质体融合技术作为遗传育种的一个有效手段，已广泛应用微生物、植物育种中。

但是由于融合子的筛选方法对亲本菌株要求较高,需要其自身具有或通过人为诱导使其具有某种特征型标记,若能发展出一种更为普遍的筛选方法,则能大大减少对亲本菌株的限制。

另外,目前对菌株融合效果大都通过表型特征来评价,因此,原生质体融合技术虽然能快速改进工业生产菌种或优化代谢途径,却很难使人们了解发生改进或优化的原因。

微生物育种工作的各个方面。

都只局限于两个菌之间的融合，没有扩展到3 个以上的菌之间的融合，如果我们能够开展多个菌之间的融合，则有可能获得同时具多个优良性状的菌株，进一步扩宽这一技术的应用。

并且原生质体融合技术运用否能成功仍受到客观因素的影响，这些都有待于我们进一步去研究和解决。

如果将原生质体融合技术与代谢工程及各种分析方法相结合,即可阐明表型或代谢途径得到优化的分子机制,甚至发现代谢网络中一些未知的调节机制。

相信随着原生质体融合技术的一步应用发展,以及与重组DNA技术、代谢工程及其分析方法等其它生物技术相结合,必将在功能基因组学的研究、揭示基因型和表型的关系以及工业微生物菌种的改进等方面发挥越来越重要的作用。

参考文献
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