第七章_模拟酶.pdf分解
酶的人工模拟或模拟酶
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接 与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应 速度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中 的Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化 为下式：
第一节 酶促反应动力学
整理上式可得 Km= [S] 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的 底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓 度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下， 其Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：
一般说来，模拟酶是在分子 水平上模拟酶活性部位的形状、 大小及其微环境等结构特征，以 及酶的作用机理和立体化学等特 性的一门科学。
模拟酶的研究就是吸收酶中 那些起主导作用的因素利用有机 化学、生物化学等方法，设计和 合成一些较天然酶简单的非蛋白 分子或蛋白质分子，以这些分子 作为模型来模拟酶对其作用底物 的结合和催化过程。
图2-1 单底物酶促反应的反应速度与底物浓度的关系
第一节 酶促反应动力学
1913年前后，米彻利斯（Michaelis）和曼吞（Menten）在前人工作的基础上， 通过大量的定量研究，提出了酶促动力学基本原理，并推导出了著名的米-曼氏方 程，推导过程如下：
模拟酶的分类
模拟酶的分类摘要：模拟酶又称人工合成酶，是一类利用有机化学方法合成的比天然蛋白酶分子简单的非蛋白质分子。
酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。
酶容易受到多种物理、化学因素的影响而失活，所以不能用酶广泛取代工业催化剂。
研究模拟酶主要是为了解决酶的以上缺点。
模拟酶是20世纪60年代发展起来的一个新的研究领域，是仿生学一个重要内容。
1、根据Kirby分类法1.1 单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性1.2 机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成1.3 单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子2、按照模拟酶的属性2.1 主-客体酶模型2.1.1环状糊精酶模型环状糊精（简称CD）是由多个D-葡萄糖以1，4-糖苷键结合而成的一类环状低聚糖。
根据还原糖数量的不同，可分为六个，七个及八个环状糊精三种，他们均是略呈锥形的圆筒，其伯羟基和仲羟基分别位于圆筒较小和较大的开口端。
这样CD分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体形成氢键，其内侧C上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，故具有疏水性，因而能包容多种客体分子，很类似酶对底物的识别。
作为人工酶模型的主体分子虽有若干种，但环状糊精是迄今应用最广泛且较优越的主体分子。
环状糊精酶模型又可分为水解酶的模拟，转氨酶的模拟，核糖核酸酶的模拟，桥联环状糊精模拟酶模型。
2.1.2 合成的主-客体酶模型主客体化学与超分子化学的迅速发展极大地促进了人们对酶催化的认识，同时也为构建新的模拟酶创造了条件。
除天然存在的宿主酶模型，人们合成了冠醚、穴醚、环番、环芳烃等大环多齿配体用来构筑酶模型。
2.2 胶束模拟酶胶束在水溶液中提供了疏水微环境，可以对底物进行束缚。
如果将催化基团如硫醇基、羟基和一些辅酶共价或非共价的链接或吸附在胶束上，就有可能提供活性中心部位，使胶束具有成为酶活力的胶束模拟酶。
第七章化学人工酶和酶的非水相催化解析
1983年，Rupley等人从溶菌酶的结论得知，一个 干燥蛋白的水合过程经过4个步骤： (1)加入的水首先与酶分子表面的带电基团结合， 达到每克蛋白质0~0.07g水。 (2)然后与酶分子表面的极性基团结合(每克蛋白 质0.07~0.25g水)。 (3)多出来的水再凝聚到蛋白质分子表而相互作 用较弱的部位(每克蛋白质0.25~0.38g水)。 (4)最后，酶分子表面完全水化，被一层水分子 所覆盖(每克蛋白质0.38g水，大约300个水分子)。
第二节 非水介质中的酶催化反应
1984年A. Zaks 和A.M Klibanov 首 次发表了关于非水相介质中脂肪酶的催 化行为及热稳定性的研究报道，引起了 广泛的关注。传统的酶学领域迅速产生 一个全新的分支非水酶学。 现在非水酶学方法在多肽合成、聚 合物合成、药物合成以及立体异构体拆 分等方面显示出广阔的应用前景。
一、半合成酶
半合成酶 将具有一定结构和功能的物质与特异的 蛋白质结合，便可形成新的生物催化剂—— 半合成酶。
一、半合成酶
1．将具有催化活性的金属或金属有机物与 具有特异性的蛋白质相结合，形成半合 成酶。 Gray与Margalit将电子传递催化剂 [Rn(NH3)5]3+，与巨头鲸肌红蛋白结合， 产生半合成的无机生物酶。肌红蛋白传 递氧气， Rn(NH3)5]3+能氧化各种有机物 (如抗坏血酸)。这种人工酶的催化效率是 钙一咪唑复合物的200倍，接近天然的抗 坏血用人工方法合成 具有催化活性的多肽。 1977年人工合成一个八肽具有溶菌酶的活 性。
三、设计要点
设计前： 酶活性中心-底物复合物的结构 酶的专一性及其同底物结合方式的能力 反应的动力学及各中间物的知识
三、设计要点
设计中： 为底物提供良好的微环境（疏水性） 应提供形成离子键、氢键的可能性，以利 于结合底物 催化基团必须相对于结合点尽可能同底物 的功能团相接近 应具有足够的水溶性，并在接近生理条件 下保持其催化活性
模拟酶
酶的模拟工作可分为 整体模拟， 包括微环境在 内的整个酶活 性部位的化学 模拟。 模拟。
合成有类似 酶活性中心 酶活性的简单 模拟 络合物
2.模拟酶的理论基础 2.
1.主客体化学： 主客体化学： 主客体化学
主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补。 主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补。 配位键或其他次级键连接。 配位键或其他次级键连接。
金属卟啉
是卟吩及其衍生物卟啉与金 属离子形成的配位化合物。 属离子形成的配位化合物。 卟啉是一类由四个吡咯类 亚基的α-碳原子通过次甲基 亚基的 碳原子通过次甲基 桥（=CH-）互联而形成的大 ） 分子杂环化合物， 分子杂环化合物，其主体骨架 是卟吩。 是卟吩。当主体中两个吡咯质 子被金属取代后即成金属卟啉 。
模拟酶
目录
模拟酶的概念 模拟酶的理论基础 2种模拟酶 分子印迹技术
1.模拟酶的概念 1.
• 指利用有机化学的方法合成一些比酶简单的非蛋白质分 子，可以模拟酶对底物的络合和催化过程，既可达到酶 可以模拟酶对底物的络合和催化过程， 催化的高效性，又可以克服酶的不稳定性。 催化的高效性，又可以克服酶的不稳定性。 模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及 模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、 其微环境等结构特征、 其微环境等结构特征、酶作用的机理和立体化学等特征 的一门科学。 的一门科学。 分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学。 分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学。
• 从分子印迹聚合物的形成来看,一般其过程 从分子印迹聚合物的形成来看, 分为3 分为3步:
1)将功能单体和模板分子按一定的比例进行混合, 1)将功能单体和模板分子按一定的比例进行混合, 将功能单体和模板分子按一定的比例进行混合 使其通过自由组装形成共价配合物或形成非共价 的加成产物; 的加成产物; 2)通过加入交联剂使其引发聚合进行聚合反应 通过加入交联剂使其引发聚合进行聚合反应, 2)通过加入交联剂使其引发聚合进行聚合反应,形 成聚合物; 成聚合物; 3)通过洗脱以除去模板分子得到目标产物 通过洗脱以除去模板分子得到目标产物。 3)通过洗脱以除去模板分子得到目标产物。
8.模拟酶
三、设计要点
1.设计前
酶活性中心的结构及酶一底物络合物的结
构；
酶的专一性及其同底物结合的方式与能力；
反应的动力学及各中间物的知识。
2 设计中
为底物提供良好的微环境 催化基团必须相对于结合点尽可能同
底物的功能团相接近
应具有足够的水溶性，并在接近生理
条件下保持其催化活性
四、酶模拟工作的3个层次
合成有类似酶活性的简单络合物 酶活性中心模拟
整体模拟，即包括微环境在内的 整个酶活性部位的化学模拟
五、模拟酶应具备的品质
能为底物提供良好的微环境；
催化基团同底物的功能团尽可能接近；
结构应是确定的，且具有一定的柔韧性或 半刚性；
在接近生理条件下保持催化活性y分类法
二、模拟酶的理论基础
一、模拟酶的酶学基础
酶的作用机制：过渡态理论
对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究
模拟酶在结构上必须具有两个特殊部位——底物结合 位点和催化位点。
二、主-客体化学和超分子化学
Cram提出主-客体化学：主体与客体通过配位键或 其他次级键形成稳定复合物的化学；体现为主体和 客体在结合部位的空间及电子排列的互补。 Lehn提出超分子化学：该分子的形成源于底物和受 体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接 受体与络合离子或分子结合形成具有稳定结构和性 质的实体，形成超分子 功能：分子识别、催化、选择性输出
3.分子印迹的方法
①非共价分子印迹
首先是印迹分子与功能单体相混合
然后功能单体与交联剂发生共聚合
最后使印迹分子从聚合物上脱离
非共价分子印迹方法已经用于对下列物
质具有选择性的聚合物的制备：染料、 二胺类、维生素、氨基酸衍生物、肽、 β—肾上腺素阻断剂、茶碱(1，3—二甲 基嘌呤)、核苷酸碱基、安定和萘普生(消 痛灵)等。
酶的模拟
设计模拟酶
? 催化基团的定向引入对催化效率的提高至关重 要。
? 要考虑到与底物的定向结合的能力。 ? 催化基团和底物之间必须具有相互匹配的立体
化学特征，这对形成良好的反应特异性和催化 效力是相当重要的。
设计人工酶模型应考虑：
? 单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样 催化活性的简单分子
二.按照模拟酶的属性
? 主-客体酶模型 ? 胶束酶模型 ? 肽酶 ? 抗体酶 ? 分子印迹酶模型 ? 半合成酶
环糊精结构示意
水解酶模型
?-Benzyme 人工酶，能模拟胰凝乳蛋白酶活 性，催化速度达天然酶同一数量级。 由?-环糊精和催化侧链组成，催化侧链含天 然酶的三种基团（羟基、咪唑基和羧基）， 且处在恰当位置上。 该全合成酶是非蛋白分子，比天然酶稳定。
模拟酶
? 又称人工合成酶，是一类利用有机化学方法 合成的，比天然酶简单的非蛋白质分子或蛋 白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对 其作用底物的结合和催化过程。
? 化学人工酶是在分子水平上模拟酶活性部位 的形状、大小及其微环境等结构特征，以及 酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。
模拟酶
? 在结构和必须具有两个特殊部位: ①底物结合位点，②催化位点。
分子印迹制备步骤
? ①选定印迹分子和功能 单体，使二者发生互补 反应；
? ②在印迹分子-单体复合 物周围发生聚合反应；
? ③用抽提法从聚合物中 除掉印迹分子。
Байду номын сангаас
用抽提法从聚合物中除去 印迹分子。则聚合物中留 有恰似印迹分子的空间， 可用于高分子高选择性分 离材料。 此技术又叫主一客体聚合 (Host-Guest Polymerization) 或模板聚 合(Template Polymerization) 。
模拟酶的概念
酶工程电子教案第八章酶的人工模拟教学目标了解抗体酶、印迹酶等人工酶（模拟酶）等新型酶的设计、原理和典型应用。
教学重点抗体酶的制备原理和应用；生物印迹酶的原理和应用。
教学方法以课堂讲授为主，课前布置学生自学和准备。
引入模拟酶就是根据酶的作用原理，模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成方法制成的高效、高选择性、结构比天然酶简单、具有催化活性、稳定性较高的非蛋白质分子的一类新型催化剂，也称酶的合成类似物。
或者叫酶模型或者叫人工酶。
一、模拟酶的概念1、模拟酶的酶学基础酶的作用机制：过渡态理论对简化的人工体系中识别、结合和催化的研究2、超分子化学主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补超分子：该分子形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合离子或分子结合形成稳定的，具有稳定结构和性质的实体，形成超分子。
功能：分子识别、催化、选择性输出二、模拟酶的分类和制备根据Kirby分类法：单纯酶模型：化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。
机理酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成。
单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。
按照模拟酶的属性：❑主-客体酶模型❑胶束酶模型❑肽酶❑半合成酶❑抗体酶分子印迹酶模型2.1 主-客体模型 2.2.1 环糊精模拟酶环糊精由淀粉通过环糊精葡萄糖基转移酶降解制得；是由D-吡喃葡萄糖单元以α-1，4-糖苷键相互结合成互为椅式构象的环状低聚糖，其分子通常含有6～12个吡喃葡萄糖单元。
有实用意义的是含6、7、8个吡喃葡萄糖单元的α、β、γ-环糊精，但α-环糊精空腔较小，γ-环糊精价格昂贵，常用的是β-环糊精。
①水解酶的模拟Bender 等人将实现了电荷中继系统的酰基酶催化部位引入CD 的第二面，成功地制备出人工酶β-Benzyme 。
催化对叔丁基苯基醋酸酯(p-NPAc)的水解比天然酶快一倍以上；kcat/K m 也与天然酶相当。
模拟酶
于催化双疏水部位酯底物11
O
NO2
2+ 的水解反应。底物11被两个CD包结后，配位于桥基的Cu 正好处于底物酯基的附近，有利于OH-对酯基的进攻，因而 显著地加速了水解反应。其催化速率比无催化剂时提高 2.2×10 5 倍。
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谷胱甘肽过氧化物酶(GPX，EC1.11.9)为含硒酶，是 生物体内重要的抗氧化物酶，能有效消除体内的自由 基，同超氧化歧化酶和过氧化氢酶共同作用，防止脂 质过氧化。因而在治疗和预防克山病、心血管病、肿 瘤等疾病具有明显效果。但是，此酶的来源有限、稳 定性差，以及分子质量大等缺点，限制了它的实际应 用，因此，人们把注意力集中在对此酶的工人模拟上。 为克服以往GPX模拟物如PZ51无底物结合部位的缺点， 罗贵民等利用环糊精为底物结合部位，硒为催化基团， 制备出双硒桥联环糊精（12）。
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1980年报道了第一个人工转氨酶6。在它的存在下， 苯并咪唑基酮酸转氨基速度比吡哆胺单独存在时快200 倍，而且表现出良好的底物选择性。CD空腔能稳定结 合类似亚胺中间体的过渡态是提高催化速度的关键。 由于β-CD本身具有手性，可以预料产物氨基酸也应该 具有光学活性，事实上，产物中D、L异构体的含量确 实不同，说明该人工酶有一定的立体选择性。 6的不足之处在于它不具备催化基团。Tabushi等将催 化基团氨基引入CD得到模拟酶7。乙二胺的引入不仅 使反应加速2000倍以上，还为氨基酸的形成造就了一 个极强的手性环境。靠近乙二胺一面的质子转移受到 抑制，从而表现出很好的立体选择性。
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图5.2 4和5催化环状磷酸二酯的水解反应
（3）转氨酶的模拟 磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是许多涉及氨基酸的酶促转 化的辅酶，其中最重要的是转氨酶催化的酮酸与氨基 酸之间的相互转化。吡哆醛（胺）本身也能实现转氨 作用，但由于辅酶本身无底物结合部位，反应速度远 不如酶存在时快。显然，有效的转氨酶模型除了具有 辅酶体系外，还应有特定的结合部位，这种结合部位 能够选择性地与底物形成复合物。
模拟酶
模拟酶研究展望
在自然界的发展和生命进化中,动植物为了生
存,进化出了酶的高效催化,激素的精密调控等 无数绝妙的生物机能。通过自然的启发引导 和科学工作者探索，以及新技术的使用将大 大加快模拟酶研究的发展,对酶结构及作用机 理的进一步了解,在化学家及生物学家共同协 作下,不断改进合成手段和采用新技术,必将有 更多更好的酶模型和模拟酶问世。
模拟酶
model enzyme
生命科学学院 生物技术0501班 吉忠忠
什么是模拟酶？
模拟酶是人工合成或经过人工修饰的用来 模拟酶的结构、特性、作用原理以及酶在生 物体内的化学反应过程的高分子。 酶是一类有催化活性的蛋白质，它具有催 化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。 天然酶易变性失活,提纯困难,价格昂贵,给储 藏及使用带来不便，也不能用天然酶广泛取 代工业催化剂。为了解决酶的以上缺点就出 现了对模拟酶的研究。
预计今后国内外有关模拟酶的研究将呈现几个方向： (1)由简单模拟向高级模拟发展：既模拟天然酶活 性中心的催化部位又模拟其结合部位,以提高模拟酶 的催化活性。 (2)将组合库技术,分子印迹等现代手段用于构造模 拟酶体系,研制出各种选择性强,灵敏度高且易于制 备的模拟酶传感器以适用于苛刻条件,复杂体系中重 要生化组分的快速检测。 (3)开发出更多可多部位结合且具有多重识别功能 的模拟酶,采用体外方法研究生物体内酶催化信息, 探讨生物体系的生命现象的真谛。 总之,通过生物化学手段研究生命科学,揭示生命的 奥秘是目前发展的重要趋势。在生物学,仿生学及计 算机等学科的推动下,有关模拟酶的研究及其在分析 中的应用将日臻完善。
单核及双核配合物模拟酶
已知的酶有1000多种,其中1/3以上含有金属
离子。大多数情况下金属离子是金属酶的活 性中心,它是进行电子转移,键合外来分子和进 行催化反应的部位。其成键方式,配位环境和 空间结构与配位化合物极为类似。通过对配 体的设计和剪裁可合成出与天然酶活性中心 结构相似的配合物,用以模拟酶的结构和功能, 这对没有获得单晶结构和功能及反应机理尚 不完全清楚的金属酶特别有用。
第七章酶的模拟
52%
策略：
一系列端基为咪唑基、羧基、羟基或氨 基的长链化合物溶于水，形成“簇”， 每个簇为一多组分混合体系，每一个组 分含有一个潜在的催化基团，可与相邻 的催化基团协同作用。
五、抗体酶（Abzyme） 又称催化抗体（catalytic antibody）
理论基础：过渡态理论。
制备方法： 1.过渡态类似物设计
1986年Schultz以对硝基苯酚磷酸胆碱酯（PNPPC）作为相应 的羧酸二酯的过渡态类似物。
诱导产生的抗体酶使水解反应速度加快12000倍。
利用过渡态类似物制备抗体酶
③ 从聚合物中除掉印迹分子。
2．分子印迹酶 印迹底物及其类似物 印迹过渡态类似物
3．生物印迹酶 利用配体诱导酶活性中心构象发生变
化，形成一种高活性的构象形式，此种 构象形式因酶在有机介质中的高度刚性 或通过交联固定而得到保持。
有机相生物印迹酶 水相生物印迹酶
枯草杆菌蛋白酶从含有竞争性抑制剂的水溶液 中冻干出来后，再将抑制剂除去，该酶在辛烷 中催化酯化反应的速度比不含抑制剂的水溶液 中冻干出来的酶高100倍
cavity
பைடு நூலகம் 1． 水解蛋白酶的模拟
利用β-CD作为酶的结合部位，而连在其 侧链上的羧基、咪唑基及CD本身的一个 羟基共同构成催化中心，实现了胰凝乳 蛋白酶的模拟。
组氨酸咪唑基的引入
2．核糖核酸酶的模拟
催化基团所处的位置可对反应的选择性 起作用。
碱性条件下水解，同
时产生Ⅱ和Ⅲ两种产 物，而在A的催化下 水解只生成Ⅲ； B催 化水解反应只生成Ⅱ。
模拟酶
分子印迹
聚合物中产生呢？ 如果以一种分子充当模板，其周围用聚合 物交联，当模板分子除去后，此聚合物就 留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建 合适，这种聚合物就像‘‘锁”对钥匙具 有选择性识别作用一样，这种技术被称为 分子印迹技术。
分子印迹 所谓分子印迹(molecular imprinting) 是制备对某一化合物具有选择 性的聚合物的过程，这个化合 物叫印迹分子(print molecule，P)， 也叫做模板分子(template，T)。
非水相生物印迹酶制备示意图
在有机相中,生物印迹蛋白质由于保
持了对印迹分子的结合构象而对相 应的底物产生了酶活力， 那么这种构象能否在水相中得以保 持，从而产生相应的酶活力呢？
水相生物印迹酶
研究结果表明，采用交联剂完全可以固
定印迹分子的构象，在水相中产生高效 催化的生物印迹酶。利用这种方法已成 功地模拟了许多酶(如酯水解酶、HF水 解酶、葡萄糖异构酶等)，有的甚至达到 了天然酶的催化效率。
种作用力，且键的数目又多，可大大改善聚合物的识 别能力。
③ 交联剂的类型和用量：交联少会减低聚合物的坚
固程度，难于限定负责选择性部位的形状和其中的基 团取向，导致识别力下降。使用旋光性交联剂，则可 能造成与模板分子有附加的手性相互作用，提高识别 力。
④ 聚合条件：低温聚合较好
印记分子的优点和局限性
还是大分子(如蛋白质等)已被应用于各种印迹 技术中。
2 固相萃取
通常样品的制备都包括溶剂萃取，由于分
子印迹技术的出现，这可以用固相萃取代替，
并且可利用分子印迹聚合物选择性富集目标分 析物。由于印迹聚合物即可在有机溶剂中使用， 又可在水溶液中使用，故与其他萃取过程相比， 具有独特的优点。
模拟酶
主 讲 人：祁佳 吕彩霞 指导老师：赵健 袁勤生
第一节 前言
背景介绍 基本概念 理论基础
背景介绍
1、天然酶的特点
温和条件下，高效、专一地催化某 些化学反应；应用于糖生物工业、能 源工业、饲料产业以及医药行业。
对热敏感、稳定性差、分离回收 不易、来源有限，限制了天然酶的 规模开发和利用。
2、酶工程技术
O
O
O
O
O CH2 O O SH
O
O
O CH2 O O S C CH2 NH C CH2 NH3+
O
O
3. 超氧化物歧化酶的模拟
超氧化物歧化酶（SOD）生理作用： 通过 催化超氧阴离子自由基的歧化反应，有效控制 体内活性氧数量，避免细胞与组织受到过量活 性氧的损伤。
天然SOD酶缺陷：体外存活时间短，较难 被人体吸收利用。
核糖核酸酶的模拟
Breslow等 人设计合成了两 种环糊精A、B模 拟核糖核酸酶。
A X= N N
B X= SCH2 N N
转氨酶的模拟
磷酸吡哆醛
与磷酸吡哆胺是
转氨酶的辅酶，
将磷酸吡哆胺连 在β环糊精的bc原子上，可以 模拟转氨酶。
CH2NH2
HO
CH2 S CH2
sp-102
CO O-
H
His-57
N NH O
Ser-195
α -胰凝乳蛋白酶电荷中继系统
水解酶的模拟（2）
本德等人利用β 环糊精的空穴作为底 物的结合部位，以连 在环糊精侧链上的羧 基、咪唑基及环糊精 自身的一个羟基共同 构成催化中心 。
水解酶的模拟（3）
用CD作为母体 设计合成的水解酶 使乙酸对硝基苯酯 水解速度增加900 倍，磷酸对硝基乙 酸苯酯水解速度增 加2900—3700倍。
第七章_模拟酶.pdf
第七章模拟酶第一节模拟酶的理论基础和策略一、模拟酶的概念二十世纪的大部分时期，科学家一直在利用化学模拟作为阐明自然界中生物体行为的基础。
早在二十世纪中叶，人们就已认识到研究和模拟生物体系是开辟新技术的途径之一，并自觉地把生物界作为各种技术思想、设计原理和发明创造的源泉。
通过对生物体系的结构与功能的研究，为设计和建造新的技术提供新的思想、新原理、新方法和新途径。
设计一种像酶那样的高效催化剂是科学家们一直追求的目标。
而对酶功能的模拟是当今自然科学领域中的前沿课题之一。
在过去的20年里，化学家对利用简单的分子模型构建酶的特征进行了深入的研究。
经过长期的努力，新的催化剂—模拟酶就逐渐被研制和开发出来。
模拟酶又称人工酶或酶模型。
——生物有机化学的一个分支。
由于天然酶的种类繁多，模拟的途径、方法、原理和目的不同，对模拟酶至今没有一个公认的定义。
一般说来，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。
模拟酶的研究就是吸收酶中那些起主导作用的因素利用有机化学、生物化学等方法，设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。
因此，模拟酶是从分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学。
迄今为止，已经有了多种类型的模拟酶：——小分子仿酶体系有环糊精、冠醚、环番、环芳烃和卟啉等大环化合物等。
——大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印迹酶模型和胶束酶模型等。
——利用化学修饰、基因突变等手段改造天然酶产生了具有新的催化活性的半合成人工酶。
其中，抗体酶就是一个典型的例子，抗体酶的出现和快速发展为酶的人工模拟又开辟了一条新的道路。
二、模拟酶的理论基础1．模拟酶的酶学基础酶是如何发生效力的？对酶的催化机制，人们提出了很多理论，试图从不同角度阐述酶发挥高效率的原因。
在众多的假说中，Pauling在1946年提出的的过渡态理论得到了广泛的认同。
模拟酶人工酶
29
抗体
• 由抗原诱导产生的，在结构上与抗原高度 互补并与抗原具有特异结合功能的免疫球 蛋白。
• 抗体的最显著的特征是
– 多样性和专一性
酶是生物催化剂
• 酶是一类具有催化功能的生物分子 • 酶反应有两个主要的特征：
– 高催化效率、高选择性
• 如果该胶束中加入带羟基的表面活性剂N，N-二 甲基-N-（2-羟乙基）十八烷基氨溴化物，共同 催化PNPA的水解，先生成酰基咪唑基中间体， 然后酰基转移到羟基上（电荷中继系统），与α胰凝乳蛋白酶水解很相似。
25
辅酶的胶束酶模型
• 将疏水性VB6长链衍生物与阳离子胶束混合 形成泡囊体系中，在Cu2+存在下可将酮酸 转化为氨基酸，有效模拟了VB6为辅酶的转 氨基作用，氨基酸的收率达52%.
• 过渡态与反应物的能阶之差 称为活化能。
• 获得活化能的多少与反应的 速度成正比。
过渡态理论
过渡态理论认为，酶与底物的结合经历了一个 易于形成产物的过渡态，实际上是降低了反应 所需的活化能。
与反应过渡状态结合作用
• 在酶催化的反应中，与酶的活性中心形成 复合物--实际上是底物形成的过渡状态，
抗体酶设想
• 1969年Jencks根据抗体结合抗原的高度特异性 ，与天然酶结合底物的高度专一性相类似的特性 ，在过渡态理论的基础上首先提出设想：
• 能与化学反应中过渡态结合的抗体，可能 具有酶的活性，催化反应的进行。
• 1986年Lerner和Schultz证实了这一设想。
抗体酶的发现
• Lerner和Schultz分别领导各自的研究小组 首次观察到了抗体具有选择性的催化活性。
第六章-人工模拟酶03
但由于它是由化学合成方法所制备的，因此又 具有天然分子识别系统所不具备的抗恶劣环境的能 力，从而表现出高度的稳定性和长的使用寿命。
（二）分子印迹发展的基本趋向：
（1）预组装方式： 印迹分子先共价结合到功能单体上，然后聚合，
聚合后再打开共价键去除印迹分子。 印迹分子与功能单体以可逆的共价键结合，如
目前，全世界至少有包括瑞典、日本、德国、 美国、中国在内的10多个国家、100个以上的学术 机构和企事业单位在从事这一技术的研究与开发。
模拟生物分子的分子识别和功能是当今最富 挑战的课题。
二、分子印迹技术的原理与特点
• 分子印迹技术的原理 当模板分子（印迹分子）与带有官能团的单
体分子接触时，会尽可能同单体官能团形成多重 作用点，待聚合后，这种作用就会被固定下来， 当模板分子被除去后，聚合物中就形成了与模板 分子在空间上互补的具有多重作用位点的结合部 位，这样的结合部位对模板分子可产生相互作用 ，因而对以此模板分子具有特异的结合能力。
构建模拟酶的酶模型分子：环糊精、 穴醚、卟林等。
模拟酶的理论基础
1. 酶的作用机制： 过渡态理论
2 人工系统研究 对简化的人工体系中识别、结合和催化
3 主客体化学： 主体和客体在结合部位的空间及电子排列
的互补。配位键或其他次级键连接。 4 超分子化学：
该分子形成源于底物和受体的结合，这种 结合基于非共价键相互作用，当接受体与络合 离子或分子结合形成具有稳定结构和性质的实 体，形成“超分子”。
硼酸酯、亚胺、西佛碱、缩醛酮、酯等，所采用的 单体通常是低分子的化合物，此单体与印迹分子形 成的共价键键能适当，在聚合时能牢固结合、聚合 后又能完全脱除。
特点：空间位置固定准确，能够移走大量的印迹 分子。但是，对携带适当结合基团的化合物选择性 低。
高级生物化学专题二：模拟酶
广义酸基团（质子供体）
广义碱基团（质子受体）
COOH NH3+ OH SH
COO¨ NH2 OS-
C
NH C H
CH
N+H
C
NH C H
CH
N∶
蛋白质中作为广义酸碱催化的功能基团
5.微环境效应
酶的活性中心周围的环境是一个非极性环境，即 低介电环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的 催化基团和底物分子的敏感键之间有很大的反应力， 有助于加速酶促反应。 如果酶的活性中心周围是一个高介电环境中，活 性中心就会有水分子存在，水分子对带电离子有屏蔽 作用，削弱带电离子之间的静电作用，不利于酶促反 应的进行。例如： 酶活性中心的羧基与水形成 氢键，导致酶活性中心羧基表 面有一层水化层，水分子的屏 蔽作用，大大削弱了酶分子与 底物离子间的静电相互引力， 不利于酶促反应。
293
260 222 214 712 615 611 502
2, 其它键及键能
• • • • A，配价键及键能 B, Vander Waals 力 C， 离子键及键能 (二)，DNA水解
• 1，Homogeneous Ce4+ complexes The ternary of Ce4+ + Pr + dextran has more activity, although homogeneous Ce4+ complexes has catalytic activity (see, fig1)
A570nm
五，磷酯键水解酶模拟物研究进展
（一），生物分子中键及键能 1，共价键及键能
键的类型 键能(KJ/mol) 键的类型 键能(KJ/mol)
O-H
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第七章模拟酶
第一节模拟酶的理论基础和策略
一、模拟酶的概念
二十世纪的大部分时期，科学家一直在利用化学模拟作为阐明自然界中生物体行为的基础。
早在二十世纪中叶，人们就已认识到研究和模拟生物体系是开辟新技术的途径之一，并自觉地把生物界作为各种技术思想、设计原理和发明创造的源泉。
通过对生物体系的结构与功能的研究，为设计和建造新的技术提供新的思想、新原理、新方法和新途径。
设计一种像酶那样的高效催化剂是科学家们一直追求的目标。
而对酶功能的模拟是当今自然科学领域中的前沿课题之一。
在过去的20年里，化学家对利用简单的分子模型构建酶的特征进行了深入的研究。
经过长期的努力，新的催化剂—模拟酶就逐渐被研制和开发出来。
模拟酶又称人工酶或酶模型。
——生物有机化学的一个分支。
由于天然酶的种类繁多，模拟的途径、方法、原理和目的不同，对模拟酶至今没有一个公认的定义。
一般说来，模拟酶是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性的一门科学。
模拟酶的研究就是吸收酶中那些起主导作用的因素利用有机化学、生物化学等方法，设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。
因此，模拟酶是从分子水平上模拟生物功能的一门边缘科学。
迄今为止，已经有了多种类型的模拟酶：——小分子仿酶体系有环糊精、冠醚、环
番、环芳烃和卟啉等大环化合物等。
——大分子仿酶体系有聚合物酶模型，分子印迹酶模型和胶束酶模型等。
——利用化学修饰、基因突变等手段改造天然酶产生了具有新的催化活性的半
合成人工酶。
其中，抗体酶就是一个典型的例子，抗体酶的出现和快速发展为酶的人工模拟又开辟了一条新的道路。
二、模拟酶的理论基础
1．模拟酶的酶学基础
酶是如何发生效力的？对酶的催化机制，人们提出了很多理论，试图从不同角度阐述酶发挥高效率的原因。
在众多的假说中，Pauling在1946年提出的的过渡态理论得到了广泛的认同。
基于Pauling稳定过渡态理论，目前对酶的催化机制解释是酶先
与底物结合，进而选择性稳定某
一特定反应的过渡态(ES)，降低反应的活化能，从而加快反应速度。
设计模拟酶：
——基于酶的作用机制，——基于对简化的人工体系中识别、
结合和催化的研究。
要想得到一个真正有效的模拟酶，这两方面就必须统一结合。
在设计模拟酶时除具备催化基团之外，还要考虑到与底物定向结合的能力。
模拟酶要和酶一样，能够在底物结合中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低反应的活化能。
酶模型的催化基团和底物之间必须具有相互匹配的立体化学特征，这对形成良好的反应特异性和催化效力是相当重要的。
2. 超分子化学
Pederson和Cram报道了一系列光学活性冠醚的合成方法。
这些冠醚可以作为主体而与伯铵盐客体形成复合物。
Cram把主体与客体通过配位键或其它次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主-客体”化学(host-guest chemistry)。
主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补，这种主客体互补与酶和它所识别的底物结合情况近似。
主-客体化学和超分子化学已成为酶人工模拟的重要理论基础，是人工模拟酶研究的重要理论武器。
根据酶催化反应机理，若合成出能识别底物又具有酶活性部位催化基团的主体分子，就能有效地模拟酶的催化过程。
通常，在设计模拟酶之前，应当对酶的结构和酶学性质有深入的了解：——(1)酶活性中心-底物复合物的结构；
——(2)酶的专一性及其同底物结合的方式与能力；
——(3)反应的动力学及各中间物的知识。
设计人工酶模型应考虑如下因素：
——非共价相互作用是生物酶柔韧性、可变性和专一性的基础，故酶模型应为底物提供良好的微环境，便于与底物，特别是反应的过渡态以离子键、氢键等结合；——精心挑选的催化基团必须相对于结合点尽可能同底物的功能团相接近，以促使反应定向发生；——模型应具有足够的水溶性，并在接近生理条件下保持其催化活性。
在设计模拟酶方面，尽管有上述理论做指导，但是，目前尚缺乏系统的定量的理论体系。
令人欣喜的是，大量的实践证明，酶的高效性和高选择性并非天然酶所独有，人们利用各种策略发展了多种人工酶模型。
目前，在众多的模拟酶中，已有部分非常成功的例子，它们的催化效率和高选择性已能与生物酶相媲美。
第二节模拟酶的分类
根据Kirby分类法，模拟酶可分为：
——(1)单纯酶模型(enzyme-based mimics)，即以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性；——(2)机理酶模型(mechanism-based mimics)，即通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成；
——(3)单纯合成的酶样化合物(synzyme)，即一些化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。
按照模拟酶的属性，模拟酶可分为：——(1)主—客体酶模型，包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等；——(2)胶束酶模型；——(3)肽酶；—
—(4)抗体酶；
——(5)分子印迹酶模型；
——(6)半合成酶等。
近年来又出现了杂化酶和进化酶。
对酶的模拟已不是仅限于化学手段，
基因工程、蛋白质工程等分子生物学手段正在发挥越来越大的作用。
化学和分子生物学方法的结合使酶模拟更加成熟起来。
一、主客体酶模型
1．环糊精酶模型环糊精
(Cyclodextrin简称CD)
是由多个D-葡萄糖以α(1,4)糖苷键结合而成的一类环状低聚糖。
环糊精
根据葡萄糖单元的数量不同可分为
α(6个)，β(7个)及γ(8个)环糊精三种
每个葡萄糖残基均呈现无扭曲变形的椅式构象，整个分子组成类似轮胎的环柱形分子，分子内有空穴，其大小、形状是由组成环的葡萄糖残基数目而定的
CD略呈锥形的圆筒，其伯羟基（C6）和仲羟基（C2、C3）分别位于圆筒较小和较大开口端。
这样，CD分子外侧是亲水的，其羟
基可与多种客体形成氢键，其内侧是C-3，C-5上的氢原子和糖苷氧原子
组成的空腔，故具有疏水性，因而能包结多种客体分子，很类似酶对底物的识别。
作为人工酶模型的主体分子虽有若干种，但迄今被广泛采用且较为优越的当属环糊精。
CD分子和底物的结合常数不及某些酶对底物的结合常数大，因此以CD为主体的仿酶研究工作过去主要集中在对CD的修饰上，即在CD的两面引入催化基团，通过柔性或刚性加冕引入疏水基团，以改善CD的疏水结合和催化功能。
这样得到的修饰CD通常只有单包结部位和双重识别作用。
由于酶是通过对底物的多部位包结并具有多重识别位点来实现酶促反应的高效性和高选择性的。
为了增加环糊精的仿酶效果，近年来相继出现了桥联环糊精和聚合环糊精。
以它们为仿酶模型可以得到双重或多重疏水结合作用和多重识别作用。
利用环糊精为酶模型已对多种酶的催化作用进行了模拟。
在水解酶、核糖核酸酶、转氨酶、氧化还原酶、碳酸酐酶、硫胺素酶和羟醛缩合酶等方面都取得了很大的进
展。
①水解酶的模拟α-胰凝乳蛋白酶是一
种蛋白水解酶。
它具有疏水性的环状结合部位，能有效包结芳环，催化部位中含有57号组氨酸咪唑基，102号天冬氨酸羧基及195号丝氨酸羟基，三者共同组成了
所谓的“电荷中继系统”，在催化底物水解时起关键作用。
蛋白酶
α-胰凝乳蛋白酶的模拟:在β-环状糊精的侧链上接上一些基团，合成出了如下图的模拟酶。
利用β-环状糊精作为酶的结合部位，使羧基、咪唑基以及环糊精自身的羟基共同构成了催化中心，由此实现了α-胰凝乳蛋白酶的全模拟。
α-胰凝乳蛋白酶的模拟酶
Bender等人将实现了电荷中继系统的酰基酶催化部位引入CD的第二面，成功
地制备出人工酶β-Benzyme 。
COOH
N NH
OH S
1
β-Benzyme
β-Benzyme催化对叔丁基苯基醋酸酯(p-NPAc)的水解比天然酶快一倍以上，kcat/K m也与天然酶相当。
β-Benzyme曾以实现了天然酶的高效催化作用机理而闻名于世。
组氨酸咪唑基在酶催化中起着重要作用，将咪唑与环糊精相连结会获得更理想的模拟酶。
Rama等人
将咪唑在N上直
接与
β-CD的C-3相连，所得的模型2催化p-NPAc的水解比天然酶快一个数量2级。
N N。