柱层析法和薄层层析法简介
柱层析和薄层析
柱层析技术柱层析原理:柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。
一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。
当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。
硅胶柱层析流动相：极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸一般都是利用极性相似相容原理，看流动相与固定相的极性，大部分是固定相的极性小于流动相，然后流动相的极性与所要洗脱的物质极性比较接近，从而将物质洗脱下来一，定义(chromatography) 柱层析技术又称柱色谱技术。
在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。
将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。
在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。
二，装柱方法装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。
不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm 左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。
干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。
接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。
通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。
干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。
柱层析和薄层析
柱层析技术柱层析原理:柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。
一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。
当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。
硅胶柱层析流动相：极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸一般都是利用极性相似相容原理，看流动相与固定相的极性，大部分是固定相的极性小于流动相，然后流动相的极性与所要洗脱的物质极性比较接近，从而将物质洗脱下来一，定义(chromatography) 柱层析技术又称柱色谱技术。
在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。
将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。
在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。
二，装柱方法装柱子（添硅胶）时，有两种方法：即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。
不论干法还是湿法，硅胶（固定相）的上表面一定要平整，并且硅胶（固定相）的高度一般为15cm 左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。
湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。
干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装的很结实。
接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。
通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。
干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。
薄层层析与柱层析
薄层层析的步骤：
点板 TLC的展开 选择展开溶剂 显示
Rf =B/A
薄层层析在有机化学中的应用
•证实两个化合物相等 •测定混合物中组分的数目 •决定适用于柱层析分离用的溶剂 •监控柱层析分离 •检查通过柱层析、结晶或萃取所达到的分 离效果 •监控一个反应的进程
各类化合物的极性
饱和烃
烯烃ห้องสมุดไป่ตู้
芳烃，卤代
物
极
硫化物
性 加
醚类
大
硝基化合物
醛、酮、酯
醇、胺
亚砜
酰胺
石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 CH2Cl2 CHCl3 Ether Eactheytal te 吡啶 丙酮 乙醇 甲醇 水 乙酸
常用洗脱溶剂
极 性 加 大
显示法
碘 （除了饱和烃和卤代烃外） 紫外灯 硝酸银稀溶液（卤代烃） 硫酸 2，4-二硝基苯肼（醛和酮） 三氧化铬、重铬酸钾和高锰酸钾（易氧化） 对二甲氨基苯甲醛（胺类） 茚三酮（氨基酸）
柱层析和薄层层析实验报告
柱层析和薄层层析实验报告篇一：柱层析实验报告柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂6．饱和氯化钠溶液3．丙酮7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃）8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
实验柱层析和薄层层析
实验柱层析和薄层层析层析法是通过分离混合物组分的一种方法，主要有柱层析和薄层层析两种。
本文将介绍它们的原理、步骤和应用。
实验柱层析原理实验柱层析是一种液相色谱分离技术，基于混合物组分在固定相和流动相之间相互分配的差异进行分离。
实验柱层析一般采用正交试验法，即通过改变柱填料、流动相、流速和溶质质量浓度等参数，以缩小响应面，得到最佳分离条件。
步骤1.选择合适的柱径和柱高，并选用合适的柱填料。
2.准备流动相，并过滤除杂质。
将柱填料与流动相充分浸泡，使柱填料达到平衡状态。
3.将混合物加到柱顶，并开始淋洗。
此时各组分在流动相和固定相之间交替分配，被固定相吸附或溶解，同时前进，终于分离。
4.根据检测结果，确定样品组分并计算出分离效果和纯度。
应用实验柱层析作为一种分离技术，广泛应用于医药、化学、生物学等领域。
常见的应用包括：1.分离蛋白质、核苷酸等生物大分子。
2.对化合物进行分离、纯化和定量分析。
3.分离和提取天然产物和药物。
薄层层析原理薄层层析是一种比较简单、快速的分离方法，其原理与柱层析类似，只是采用了薄层硅胶或氧化铝等作为固定相，可直接对液态和固态样品进行分离。
步骤1.准备薄层柱。
2.准备固定相毛细管与混合样品。
3.在薄层柱上涂上一层液态固定相，然后将其晾干。
4.将样品分别点于薄层柱的一端，放入发展槽中，加入足量发展剂。
5.等到液面距离薄层柱顶端约0.5cm时取出，划线，停发展，晾干。
6.在笼罩于发展剂蒸汽中的小钵中烘干至静止。
应用薄层层析作为快速分离、纯化和检测生物和化学样品的一种常用手段，其应用包括：1.对合成的物质进行纯化和分离。
2.植物药的含量测定。
3.对复杂化学物质进行溶剂系统选择和定性分析。
实验柱层析和薄层层析都是常见的层析法，虽然原理类似但有各自的优缺点和应用场景。
在实际应用中，需要根据具体的分离任务选择合适的方法。
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S')一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
柱层析和薄层层析实验报告
柱层析和薄层层析实验报告实验目的：1.了解柱层析和薄层层析的原理和方法；2.掌握柱层析和薄层层析的操作技能；3.熟悉柱层析和薄层层析在不同化合物分离和纯化过程中的应用。
实验原理：柱层析是基于分子在固体填充柱层析柱中的分配系数不同，使得溶液中的化合物能够以不同的速率通过柱层析柱，并在柱中相互分离的一种技术。
薄层层析是将待检样品加载在薄层层析板上，通过毛细作用使得样品在薄层上上升，并在薄层上相互分离的一种技术。
实验仪器和试剂：柱层析仪、薄层层析仪、柱层析柱、薄层层析板、溶液样品、色谱柱填充物、色谱溶剂、染色剂等。
实验步骤：1.柱层析（1）将填充好色谱柱的柱层析仪放置于实验台上并连接好流动相系统；（2）用适当的色谱溶剂预洗柱层析柱；（3）将样品加入柱层析柱并开启流动相系统，实时监测溶液流出；（4）根据溶液流出的情况和实验要求，采集柱层析柱流出的不同组分。
2.薄层层析（1）准备薄层层析板，标记好起点；（2）在薄层层析板上加载待测样品，并使其干燥；（3）将薄层层析板置于薄层层析仪中，并加入适当的色谱溶剂，使其与薄层层析板产生足够的接触；（4）升级薄层层析板，使样品在薄层上上升；（5）取出薄层层析板，根据实验要求，在带有紫外光源下观察色谱斑点，并记录下色谱斑点的相对迁移距离。
实验结果：1.柱层析实验结果展示了分离出的不同组分的溶液，并标记了每个组分的相对迁移时间和相对含量；2.薄层层析实验结果展示了在薄层上分离出的样品斑点，并根据相对迁移距离判断样品的相对含量和分离效果。
实验讨论：1.柱层析和薄层层析在实验过程中的优缺点；2.实验结果是否符合预期，若不符合预期，可能的原因和改进方法；3.模拟实际应用场景，讨论柱层析和薄层层析在不同化合物分离和纯化过程中的应用。
实验结论：通过本次实验，我们掌握了柱层析和薄层层析的原理和实验方法，熟悉了柱层析和薄层层析的操作技能。
柱层析和薄层层析是分离和纯化化合物常用的技术手段，在生物医药、食品安全等领域都有广泛应用。
柱层析法和薄层层析法简介
柱层析法和薄层层析法简介柱层析法和薄层层析法是化学分析中常用的分离和纯化技术。
柱层析法是一种基于样品在固定相和流动相之间的不同亲和性而进行分离的方法，而薄层层析法则是一种基于样品在薄层固定相上迁移的速率差异进行分离的方法。
下面将对这两种方法进行详细介绍。
一、柱层析法：柱层析法主要包括固定相的选择、柱填充、流动相的选择和柱层析实验步骤。
1.固定相的选择：柱层析法的关键在于选择合适的固定相，以实现样品的有效分离。
常见的固定相有硅胶、氧化铝等无机物固定相，以及聚合物固定相。
根据样品的特性和分离目的，可以选择不同性质的固定相。
2.柱填充：选择好固定相后，将其装入柱子中。
柱子的尺寸和形状因具体实验目的而异，可以选择不同规格的柱子。
柱层析时需要一定的流动相经过柱子，使样品发生分离。
3.流动相的选择：流动相在柱层析中起着溶解样品、推动样品迁移的作用。
选择流动相时要考虑其溶解度、极性和挥发性等因素，以满足样品有效分离的需要。
常用的流动相有水、醇、酸和有机溶剂等。
4.柱层析实验步骤：将样品溶解于流动相，注入柱子上方，通过柱子中流动相的推动，样品将被分离。
在柱层析过程中，可以收集不同部分的淋出液，进一步进行定量分析。
二、薄层层析法：薄层层析法是一种简单快捷的分离方法，主要利用样品成分在薄层和流动相之间的差异速率进行分离。
薄层层析法主要包括薄层固定相的选择、样品的制备、样品在薄层上分离和可视化等步骤。
1.薄层固定相的选择：薄层层析法使用具有吸附性能的薄层材料作为固定相，如硅胶、氧化铝等。
根据样品特性和分离目的，可以选择不同性质的薄层固定相。
2.样品的制备：将样品溶解于合适的溶剂中，制备成涂布于薄层板上的样品。
样品的制备需要注意样品的浓度和纯度，以及溶剂的选择和配比。
3.样品在薄层上的分离：将样品涂布在薄层板上后，放置在流动相中，流动相将会迁移样品在薄层上形成的斑点。
样品的分离程度与样品成分的极性、溶剂的性质和薄层固定相的特性有关。
薄层色谱和柱层析
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缺点
柱层析法的缺点包括样品损失、洗脱峰易受干扰、操作参数难以控制等。此外， 对于某些特定组分的分离，柱层析法可能需要较长的分离时间和较多的样品量。
03
薄层色谱与柱层析的比 较
分离原理的比较
薄层色谱（TLC）
基于吸附剂对不同成分的吸附能力差异进行分离。
柱层析
基于固定相和流动相之间的分配平衡进行分离。
新型固定相
固定相是薄层色谱和柱层析中的重要组成部 分，用于吸附样品中的组分。研究者正在开 发新型固定相，以提高分离效率和特异性。 例如，一些新型固定相可以通过改变表面化 学性质、孔径和形貌等方式来提高分离性能
。
新技术的开发
微流控芯片技术
微流控芯片技术是一种新型的分离分析技术，具有高通量、高分辨率和高灵敏度等优点。 该技术可以将薄层色谱和柱层析集成在一个芯片上，实现快速、高效的分离分析。目前，
结果分析
分析实验结果，比较不同实验条件下的分离效果， 总结实验规律和改进措施。
05
薄层色谱和柱层析的发 展趋势
新材料的应用
硅胶替代品
硅胶是常用的薄层色谱和柱层析材料，但存 在一些限制，如硅胶粒径分布广、吸附能力 不稳定等。因此，研究者正在寻找硅胶的替 代品，如氧化铝、活性炭、聚合物等。这些 新材料具有更好的粒径控制、更稳定的吸附 性能和更高的分离效率。
实验操作步骤
洗脱
结果观察
选择合适的洗脱液进行洗脱，控制洗 脱速度和体积。
观察并记录样品在色谱柱上的分离情 况。
收集
根据需要将洗脱液收集到不同的容器 中。
实验结果分析
数据记录
详细记录实验数据，包括标准品和样品的分离情 况、洗脱液的体积和成分等。
薄层与柱层析技术
薄层色谱法T L C实践技术1目的1. 药典：薄层色谱法系将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与事宜的对照物按同法所得的色谱图对比，并可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴别、检查或含量测定。
2.如果你是做鉴别的话，薄层的系统适用性主要是做检测限和分离度；如果你是做含量测定，比如说用薄层扫描法，薄层的系统适用性应该做线性范围、同板精密度、异板精密度、回收率；4.手工铺制的板子，只适宜于定性分析，不宜于分离定量；5.化学药一般是作有关物质，需要一定的载药量，所以要适当增加厚度；6.中药一般较难分离，需要薄板，以增加分离度；8.如果你铺板目的是做分析用的话，肯定得很仔细用心；如果仅是天然药化那种粗略检查过柱子得到的馏分纯度，那就没有必要这么复杂了，也就是说速度可以快点，板的要求也没有必要这么高；10.要喷硫酸乙醇并定量的最好铺水板；铺水板是最考技术的，主要是碾磨技术，大家可以探讨一下；11.硫酸乙醇显色作定量分析的品种，但凡加了CMC-Na的板都易烘糊，尤其是温度高于100度时，后改用不加CMC辅的水板来作，就不会有烘糊现象，故也可推论CMC 易于与硫酸起糊化反应。
感觉辅水板关键是硅胶G与水的比例要达1：3.5左右，而且研磨后要尽快涂布，不能易于凝固而难于涂布。
2 CMC-Na溶液的配制1. 药典规定CMC-Na浓度为0.2％～0.5％，实际操作中0.4％～0.5％最为实用；CMC-Na 溶液的溶剂应用蒸馏水，以尽量减少污染。
2. 配制CMC-Na溶液，根据实际经验一般将溶液浓度配成0.3%，需要铺厚板可配成0.5%左右，薄板可配成0.2%即可。
CMC-Na溶解最好是自然溶解（浓度不是太高），也可在水浴中加热促溶（用时还是过滤一下好，避免铺出的板子有麻坑）。
3. 配制CMC-Na溶液时，可以先量取好蒸馏水，再将称量好的CMC-Na均匀撒在水中，用玻璃棒搅拌，如果操作的好的话可以不用加热都能溶解的很好；当溶解完全后，应该抽滤一下，这样铺的板子很均匀，不过滤会因为一些肉眼看不到的不溶物混入，这样铺的板子会出现许多小颗粒；4. 第一个关键的地方，你的CMC-Na溶液必须配制的好，放置的也要很好，完全分层之后只能取上清液。
薄层色谱和柱色谱色谱法是分离提纯和鉴定有机化合物的重要方法
图1 薄层色谱示意图 薄层色谱和柱色谱色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法，有着极其广泛的用途。
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配)的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。
流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相(可以是固体或液体)。
根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱等。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。
根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
一、薄层色谱薄层色谱(Thin Layer Chromatography, TLC)属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。
适用于小量样品(几到几十微克，甚至0.01µg)的分离。
同时薄层色谱是一种非常有用的跟踪反应的手段，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
也常用作柱色谱的先导，可用于柱色谱分离中展开剂的选择，也可监视柱色谱分离状况和效果。
最常用的薄层色谱属于液-固吸附色谱，把吸附剂(如氧化铝、硅胶)和粘合剂(如煅石膏CaSO 4·H 2O 、羧甲基纤维素钠等)均匀地铺在一块玻璃板上形成薄层，将分离样品滴加在薄层的一端，当利用毛细作用使流动相沿着吸附剂薄层(固定相)移动时，吸附剂借各种分子间力(包括范德华力和氢键)作用于混合物中各组分，各组分以不同的作用强度被吸附。
被分离组分在固定相与流动相之间进行分配或吸附，经过反复无数次的分配平衡或吸附平衡，不同组分的极性化合物就会在薄层板上移动不同的距离。
极性强的化合物会“粘”在极性的吸附剂上，在薄板上移动的距离比较短。
薄层色谱和柱层析综述
薄层色谱和柱层析综述
薄层色谱（Thin Layer Chromatography， TLC）和柱层析（Column Chromatography，CC）均属于分离分析技术，广泛应用于化学、生物学、药学等领域，用于对混合物中的各组分进行快速、有效的分离。
薄层色谱和柱层析的相似点：
1.都是分离分析技术，都可以用来分离混合物中的各组分，以及鉴定化合物的结构和性质。
2.两者都基于组分之间的分子量大小、相对极性及分子结构等差异而分离，运用相同的原理及方法。
3.都需要在选择溶剂时考虑搭配，确保溶剂的性能以及所需的相对极性。
薄层色谱与柱层析有其明显的不同：
1.薄层色谱和柱层析在分离分析过程中采用的基体是不同的，前者采用的是薄膜，而后者采用的是柱状基体。
2.对溶剂的选择也不尽相同，薄层色谱可以采用溶剂萃取、溶剂烘干等技术，而柱层析则只能采用溶剂萃取技术。
3.薄层色谱的分离更加快捷方便，更适合分析稀释液，而柱层析分离速度较慢，适合分析浓度较高的混合物。
4.薄层色谱仪由于体积小、设备灵活简十，而柱层析仪的体积较大且操作较为复杂。
层析技术的种类及其基本原理
层析技术的种类及其基本原理层析技术是一种分离化合物的方法，它是基于物质在不同相中的分布系数不同而实现的。
层析技术主要包括三种类型：薄层层析、柱层析和气相色谱。
一、薄层层析1.1 基本原理薄层层析是一种简单易行的分离方法，它利用了化合物在固定相和移动相之间的分配系数差异进行分离。
通常情况下，我们将待测样品涂在硅胶或氧化铝等吸附剂上，然后将其放置在一个玻璃板上，形成一个薄而均匀的涂层。
接着，我们将这个玻璃板放入一个密闭的槽中，在槽底部加入适量移动相。
当移动相向上升时，它会与样品发生反应并带走它们。
由于不同化合物在固定相和移动相之间具有不同的分配系数，因此它们会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
1.2 分类根据吸附剂的不同，薄层层析可以进一步分为硅胶层析、氧化铝层析和纸层析等。
1.3 应用薄层层析广泛应用于食品、化妆品、药品等行业中，用于分离和鉴定其中的成分。
二、柱层析2.1 基本原理柱层析是一种利用固定相和移动相之间的互作用进行分离的方法。
通常情况下，我们将待测样品注入到一个装有固定相的柱子中，然后通过加入适量移动相来进行分离。
在这个过程中，不同化合物会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
2.2 分类根据固定相的不同，柱层析可以进一步分为凝胶柱层析、反相柱层析和离子交换柱层析等。
2.3 应用柱层析广泛应用于生物技术、制药工业以及环境监测等领域中，常用于纯化和提取目标物质。
三、气相色谱3.1 基本原理气相色谱是一种利用气体载流体将混合物分离成单独组分的方法。
通常情况下，我们将待测样品注入到一个装有固定相的柱子中，然后通过加热来蒸发样品中的化合物，并将它们带入气相。
接着，我们将气相送入到一台质谱仪中进行分析。
在这个过程中，不同化合物会以不同速度被带走，并最终被分离出来。
3.2 分类根据固定相的不同，气相色谱可以进一步分为毛细管气相色谱、开放管气相色谱和微柱气相色谱等。
3.3 应用气相色谱广泛应用于食品、环境、制药等领域中，常用于分析和鉴定其中的成分。
柱 层 析、薄 层 层 析
柱色谱、薄层色谱一、实验目的1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
二、实验原理色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面:1、分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。
2、精制提纯化合物有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。
3、鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯粹的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。
吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。
分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。
柱色谱常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S ‘)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S‘)一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
薄层色谱和柱层析
• 硅胶薄层板是目前使用最广的薄层板，有硅胶G板、硅胶GF254
板、硅胶H板和硅胶HF254板等规格。
• 高效薄层板（HPTLC，High Performance TLC）所使用的固
定相较普通薄层板平均粒度小，颗粒分布范围窄，因此在相对 (xiāngduì)短的展开距离中可以达到更好的分离效果。
1）苯：石油醚=1：1 2）苯+5%乙酸乙酯
1）70%醋酸 2）30%醋酸 3）丁醇：醋酸：水=4：1：5
共四十九页
邻联茴香胺乙酸溶液 1%三氯化铝的乙醇溶液
柱色谱法 (Column Chromatograph)
柱色谱是较经典的有机物分离技术，原理和薄层色谱相 同，但装置有所不同，主要由一个均匀玻璃柱和填充填料组 成(zǔ chénɡ)，填料是决定柱效的主要因素，填料必须满足具有 不溶于所使用流动相、不使欲分离的样品破坏或分解、惰性 大、可逆性强和吸附容量大。同时，填料颗粒直径要均匀。 最常见的柱色谱是硅胶色谱、氧化铝色谱、离子交换柱色谱、 聚酰胺柱色谱和凝胶柱色谱。
例：环己烷－丙酮－二乙胺－水（10:5:2:5）这个系统中，水是极性大的溶剂，环 己烷是极性小的溶剂，后者的加入可以降低分离物质的Rf值，丙酮起着混合整个系统 及降低展开剂粘度的作用，少量二乙胺的加入控制了展开剂的pH值以使分离后的斑 点不致拖尾，分离清晰。
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显色
1. 有色化合物——直接(zhíjiē)定位
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倾倒
展开
常用展开剂
对展开剂的要求
① 对被测组分有良好的溶解性；
② 有良好的分离效果(xiàoguǒ)；
③ 斑点圆整不拖尾；
④ Rf值最好在0.3-0.5，组分较多最好在0.25-0.75；
柱层析和薄层层析实验报告
柱层析和薄层层析实验报告Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】柱层析和薄层层析实验报告篇一：柱层析实验报告柱层析分离色素一、【实验目的】1．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。
2．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。
二、【实验原理】叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。
从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。
利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。
分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。
柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。
常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。
吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。
由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。
继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。
用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。
本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。
由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。
三、【实验材料】原料：新鲜的菠菜叶试剂：1．无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝2．石英砂 6．饱和氯化钠溶液3．丙酮7.水硫酸钠4．石油醚（60-90℃） 8洗脱液：丙酮：石油醚＝1：9 器材：层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管，铁架台四、【实验操作】1．色素的提取：20克菠菜，加少许石英砂，再加20毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30毫升石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中,再加入40毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入20毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干燥5分钟，备用.2．样品的浓缩：将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体5-8毫升左右，以备加样使用。
薄层色谱和柱层析
色谱系统 展开方式 流速控制 平衡时间 分析样品 样品量 板高（μ m） 有效板数 检测方式 溶剂用量 溶剂更换 固定相
12:25:49
薄层色谱与HPLC的对比 薄层色谱 HPLC 开放式 闭路 展开 洗脱 吸附剂的毛细管作用 由泵调节 短 不定 可同时分析多个 每次一个样品 高 低 30 2～ 5 < 600 ～5000 静态 动态 少 多 易 难 一次弃去 重复使用
12:25:49
薄层色谱中，Rf值与组分的分配系数K值有关：
K=Cs/CM =溶质在固定相中浓度/溶质在流动相中浓度
若该组分的移动距离为d1，流动相移动距离为dm ,
d2=dm－d1 Rf =d1/dm=d1/(d1+d2)
如果组分的分配系数大，则在水中分配量大，移动距离小， Rf小。因此，K与d1、d2有如下关系：
（ Ⅵ ）具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解析 （ Ⅶ ）为便于观察分离结果，吸附剂最好为白色。
常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅酸镁、而 CaO 、 MgO、Ca(OH)2、Mg(OH)2、CaSO4、Ca3(PO4)2、Mg3(PO4)2、 淀粉、蔗糖等，或因碱性太大，或吸附性太弱，用途有限，活 性炭因吸附性太强和黑色，使应用受到限制。
12:25:49
（Ⅲ）样品的极性 物质的极性愈大，氧化铝和硅胶吸附愈牢，物质极性大小 如下： 饱和烃 < 不饱和烃 < 醚 < 酯 < 醛 < 酮 < 胺< 羟基化合物 < 酸和碱 吸附太牢也不易分离，如果硅胶、氧化铝吸附性太强，可 掺入不同比例的硅藻土，或其它低吸附性物质。 （3）常用吸附剂 硅胶： 105～110℃ 活化，但不能高于170℃ 。 氧化铝：180～200 ℃活化
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柱层析法和薄层层析法简介
柱层析法
1. 原理
流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。
随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。
2. 柱色谱分离条件
⑴固定相选择
柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。
以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。
这些作用的强度依次为：
成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。
有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。
常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等
色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。
酸性氧化铝pH约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9-10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。
吸附剂的活性与其含水量有关。
含水量越低，活性越高。
脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。
硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。
活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。
吸附剂的粒度越小，比表面越大，分离效果越明显，但流动相流过越慢，有时会产生分离带的再重叠，适得其反。
⑵流动相选择
色谱分离使用的流动相又称展开剂。
展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。
在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。
在氧化铝柱中，选择适当极性的展开剂能使各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离带，流出色谱柱。
石油醚、环己烷、四氯化碳、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、乙醇、甲醇、水、乙酸、对极性有机物的溶解作用逐渐增强。
当一种溶剂不能实现很好的分离时，选择使用不同极性的溶剂分级洗脱。
如一种溶剂作为展开剂只洗脱了混合物中一种化合物，对其它组分不能展开洗脱，需换一种极性更大的溶剂进行第二次洗脱。
这样分次用不同的展开剂可以将各组分分离。
薄层层析法
薄层层析又叫薄板色谱，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。
此外，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”。
原理：
吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。
干燥后在涂层的一端点样，放入一个盛有少量展开剂的的有盖容器中。
展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动。
经过在吸附剂和展开剂之间的多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。
色谱条件
⑴固定相选择
柱色谱中提到的吸附剂都可以用作为薄层色谱的固定相，分离性能及使用选择同柱色谱的选择原则相同（各种吸附剂见柱色谱表1）。
一般用于薄层色谱时，要求吸附剂的粒度更小。
商品吸附剂区分为色谱级（用于柱色谱）和薄层色谱级（用于薄层色谱）。
⑵展开剂选择
薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。
展开剂的极性越大，对化合物的洗脱力也越大。
选择展开剂时，除参照表列溶剂极性来选择外，更多地采用试验的方法，在一块薄层板上进行试验：
①若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极性过强；
②若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂的极性过弱。
当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。
先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂
与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。
合适的混合展开剂常需多次仔细选择才能确定。
⑶相对移动值
从点样原点开始到展开后的溶剂前沿，是溶剂的移动距离，记为l0，混合物中各组分的移动距离分别记为l1，l2，l3。
在不同的展开条件下，各化合物的移动距离不会相同，而在同一条件下，相对于展开剂的移动距离，各化合物有可比较的展开数据，称为相对移动值。
⑷显色
分离的化合物若有颜色，很容易识别出来各个样点。
但多数情况下化合物没有颜色，要识别样点，必须使样点显色。
通用的显色方法有碘蒸气显色和紫外线显色。
①碘蒸气显色：将展开的薄层板挥发干展开剂后，放在盛有碘晶体的封闭容器中，升华产生的碘蒸气能与有机物分子形成有色的缔合物，完成显色。
②紫外线显色：用掺有荧光剂的固定相材料（如硅胶F，氧化铝F等）制板，展开后在用紫外线照射展开的干燥薄层板，板上的有机物会吸收紫外线，在板上出现相应的色点，可以被观察到。
有时对于特殊有机物使用专用的显色剂显色。
此时常用盛有显色剂溶液的喷雾器喷板显色。
薄层色谱应用
⑴可用于判断两个化合物是否相同（同一展开条件下是否有相同的移动值）；
⑵可用于确定混合物中含有的组分数；
⑶可用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果；
⑷可用于检测反应过程。
【柱色谱操作步骤】
1、装柱
用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部，轻轻塞紧，关闭活塞，通过一干燥的玻璃漏斗向柱中慢慢加入色谱柱用中性氧化铝10g，并用橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部，使填装紧密，在上面加一片小圆滤纸或脱脂棉使表面水平。
用滴管沿管壁加入酒精，使酒精顺柱体向下展开，打开活塞，控制流出速度为1滴/秒。
2、进样
待酒精全部浸润氧化铝，液面刚好流至滤纸面时，立即用滴管从层析柱管中心加入待分离样品溶液，当此溶液流至接近滤纸面时，立即用少量溶剂洗下管壁的有色物质，如此连续2—3次，直至洗净为止。
3、洗脱
依次用酒精和NaOH洗脱，控制流出速度。
整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。
（每一种试剂加入前，前一种都要刚刚浸过滤纸片）
【薄层色谱操作步骤】
1、薄层板的制备（湿板的制备）
薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。
薄层应尽量均匀且厚度要固定。
否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。
在烧杯中放入2g硅胶，加入5—6ml蒸馏水，调成糊状。
将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。
也可买市售的硅胶板切割成适宜大小备用。
本实验用此法制备薄层板：吸附剂为硅胶G，用0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液调成浆料。
2、点样
先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，吹干。
斑点直径一般不超过2mm。
若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。
若在同一板上点几个样，样点间距离应为0.5-1cm，且不能离边沿太近。
点样要轻，不可刺破薄层。
当展开剂到达距离另一端0.5cm处时拿出薄板，用铅笔将最远处做好记号，吹干样品点，测量l1、l0，计算Rf。
3、展开
薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。
在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过1cm。
将点好的薄层板小心放入层析缸中，点样一端朝下（点样面朝上），浸入展开剂中。
盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快在板上标上展开剂前沿位置。
吹干，观察斑点位置，计算Rf值。
实验关键及注意事项：
1、薄层层析时，薄层板的制备要厚薄均匀，表面平整光洁。
2、点样时，各样点间距1—1.5cm，样点直径应不超过2mm，不能太靠边。
3、柱层析时，柱子要致密紧实，无气泡。
洗柱、分离时洗脱剂液面不能低于柱中填充物上面。