杂交瘤细胞的纯化

2~4周
HT培养基
普通培养基
• 只有杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT 和TK，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
骨髓瘤细胞： HGPRTˉ或TKˉ 脾细胞： HGPRT+，TK+ 杂交瘤细胞： HGPRT+，TK+
死亡 存活但短命
存活
筛选方法
HAT
融合后 培
的混合 养
物
基
次日 骨髓瘤细胞死亡
7~10天 未融合的骨髓瘤细胞死去， 杂交瘤细胞逐渐长成细胞 集落
• 实验所用骨髓瘤细胞是HGPRT缺陷（HGPRT-） 和TK缺陷（TK-）细胞，不能利用培养基中 的H和T，且未融合骨髓瘤细胞合成DNA的主 要途径被培养基中的A阻断，所以未融合骨 髓瘤细胞不能在HAT培养基中生长。
• 未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死 亡。
• 脾细胞和脾细胞自身融合的细胞能在HAT培 养基上正常生活,但不能增殖,所以经过数代 后,HAT培养基上没有脾细胞和脾细胞自身融 合的细胞。
补救合成途径
细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖 转移酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶 （TK），将核苷酸前体合成核苷酸以供 DNA合成的原料。
DNA的生物合成途径与HAT选择培养基
糖和
A
氨基酸
T
TMP
核苷酸 前体
TK HGPRT
H
IMP
核苷酸 DNA
H—hypoxanthine （次黄嘌呤） A—aminopterin （氨基喋呤） T—thymidine （胸腺嘧啶核苷）
杂交瘤细胞的纯化原理与方法
杂交瘤细胞的筛选
未融合的免疫细胞在培养6~10天后 会自行死亡；异型多核细胞分裂不正常， 培养过程中也会死亡；未融合的骨髓瘤 细胞因其生长快不利于杂交瘤细胞生长， 所以要将杂交瘤细胞筛选出。
杂交瘤细胞的筛选
脾细ห้องสมุดไป่ตู้ (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞 脾细胞脾细胞
筛选出 不能长期存活
骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞
脾细胞
骨髓瘤细胞
不能长期存活
HAT培养基进行筛选
原理
细胞DNA合成有两条途径： 从头合成途径 补救合成途径
从头合成途径
即利用糖和氨基酸这些可从培养液中摄 取的简单的含碳、含氮复合物来合成核苷 酸，进而合成DNA。
这一过程需四氢叶酸参与供甲基及甲 酰基，因此该途径可被叶酸拮抗物氨基喋 呤（A）阻断。