第八章 分子杂交技术ppt课件
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杂交技术 PPT课件
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1.印迹技术
印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素：
选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。
13
⑴ 固相支持物的选择
①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏；
②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少；
特别适用于菌落原位印迹法。
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尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。
19
⑵ 印迹方法
①斑点或狭缝印迹 ②虹吸印迹法 ③电转印迹法 ④真空转移法
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c. 将 凝 胶 浸 泡 于 适 量 的 变 性 液 中 (1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使 DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如 果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前， 用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min,因为片段 的大小直接影响转移率速。小于15Kb，转移 1h。
复性的（速度）过程的影响因素：
①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞 机率越大，复性速度越快。
②DNA的分子量：大分子量的DNA扩 散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很 难形成正确配对，因此复性速度较慢。
③温度：温度过高，有利于DNA变性 而不利于复性；而温度过低，碰撞机率 减少，易形成局部错误配对，适宜的温 度是较Tm值低15℃～25℃。
d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法 和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将 DNA从凝胶转移到固相支持物上
1.印迹技术
印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素：
选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。
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⑴ 固相支持物的选择
①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏；
②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少；
特别适用于菌落原位印迹法。
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尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。
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⑵ 印迹方法
①斑点或狭缝印迹 ②虹吸印迹法 ③电转印迹法 ④真空转移法
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c. 将 凝 胶 浸 泡 于 适 量 的 变 性 液 中 (1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使 DNA变性，即将双链DNA变成单链DNA。如 果DNA片段较大(大于15kb)，可在变性前， 用稀盐酸（0.2mol/L）处理10min,因为片段 的大小直接影响转移率速。小于15Kb，转移 1h。
复性的（速度）过程的影响因素：
①DNA的浓度：DNA浓度越大、碰撞 机率越大，复性速度越快。
②DNA的分子量：大分子量的DNA扩 散速度较慢，碰撞机率较少，同时又很 难形成正确配对，因此复性速度较慢。
③温度：温度过高，有利于DNA变性 而不利于复性；而温度过低，碰撞机率 减少，易形成局部错误配对，适宜的温 度是较Tm值低15℃～25℃。
d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法 和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将 DNA从凝胶转移到固相支持物上
核酸分子杂交技术 ppt课件
ppt课件
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一、常见的核酸探针
（一）基因组DNA探针
基因组DNA探针的制备是将染色体DNA通过超声击断或限制性内 切酶不完全水解，获得许多染色体 DNA的随机片段，选择长度约 15-20kb的DNA片段重组到λ 噬菌体中，经体外包装感染大肠杆菌， 在固体培养基上形成许多噬菌斑。筛选出含目的基因的重组体后， 将目的基因 DNA片段再次亚克隆到大肠杆菌质粒中保存，以便需 要时扩增。 基因组DNA制备还可以通过 PCR扩增基因组DNA的特定片段，然 后将其克隆到大肠杆菌质粒中保存。由于真核基因组含有不编码的 内含子序列，因此，真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂 交效率要明显低于cDNA探针。
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(3) 酶
常用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶对核酸探针进行标记。
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(4) 荧光素
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC），最大吸收波 长为490nm～495nm，最大发射波长为520nm～530nm，呈黄绿色 荧光， 四乙基罗达明：最大吸收波长为570nm，最大发射波长为595～ 600nm，呈橙红色荧光。
ppt课件 11
二、核酸分子杂交的基本原理
根据核酸变性和复性的原理，不同来 源的 DNA 变性后，若这些异源 DNA 之间存在某些相同序列的区域，在退 火条件下则可形成DNA-DNA异源双 链；或将变性的单链 DNA 与 RNA 经 复性处理可以形成DNA-RNA杂合双 链。这种不同来源的单链核酸分子在 合适的条件下，通过碱基互补形成双 链杂交体的过程称为核酸分子杂交 （molecular hybridization）。
基因组学课件 第8章 分子杂交与印迹技术
➢ 操作步骤：
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
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3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
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3、Western 印迹杂交
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3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
64
2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
65
4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
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4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
60
4、原位杂交（in situ hybridization）
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2、分子印迹（blot、bloting）
✓ 蛋白样品的制备 ✓ 蛋白样品的分离-（SDS-PAGE） ✓ 转膜 ✓ 封闭 ✓ 一抗杂交 ✓ 二抗杂交 ✓ 底物显色
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3、Western 印迹杂交
➢ 酶联显色：
HRP：底物为DAB AP：底物为BCIP/NBT
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3、Western 印迹杂交
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3、Western 印迹杂交
转印方法：毛细管虹吸法
➢ 利用毛细管的虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移至滤膜上。 ➢ DNA片段由液体携带而从凝胶转移并聚集于薄膜表面。液体通过毛
细管作用抽吸通过凝胶，借助于一叠干的吸水纸巾产生并维持毛细 管作用。转移的速度取决于DNA片段的大小和凝胶中琼脂糖的浓度， 小片段DNA（<1kb）1h内就能够从0.7%琼脂糖上几乎定量地转移， 而较大片段的DNA转移较慢且效率较低。
3）荧光原位杂交
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2）组织/细胞原位杂交
➢ 特点:
能在成分复杂的组织中进行单一 细胞的研究
不需从组织或细胞中提取核酸， 对含量极低的靶序列灵敏度高
能准确反映组织细胞的相互关系 及功能状态
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4、原位杂交（in situ hybridization）
1）菌落原位杂交 2）组织/细胞原位杂交 3）荧光原位杂交
5、斑点杂交(dot blot)
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4、原位杂交（in situ hybridization）
➢ 核酸原位杂交特点：
（1）不受组织成分的影响； （2）灵敏度高； （3）可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系
及功能； （4）可检测多个探针。
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4、原位杂交（in situ hybridization）
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2、分子印迹（blot、bloting）
核酸的分子杂交1310PPT课件
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重物 支持平台
玻璃板
吸水纸
湿滤纸 膜 胶 湿滤纸 湿滤纸桥
20×SSC
毛细管虹吸法Southern转膜示意图
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玻璃容器 24
5. 探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法
制备探针、标记。
6. Southern杂交
（1） 预杂交 封闭膜上所有能与DNA结合的位点转印后 的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）4～6小时
⑵ 液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放
在液体中进行杂交反应。
两种杂交形式的基本原理都是一样的。
从发展历史来看,先有液相杂交,后有固—液相杂交.
.
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四、核酸分子杂交的过程—DNA的变性与复性
1.变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸
碱或紫外线照射，可以导致两条DNA链之间的氢键断
裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、
如尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核
酸分子。
除物理、化学因素外，DNA分子的组成也影响变性。最主
要的因素是DNA分子中的GC含量，GC含量高的DNA不易变性，而
AT含量高的DNA容易变性。另外,环状DNA比线性DNA难于变性.
.
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2.复性
DNA的变性是可逆的，即两条互补的单链DNA分
（2） 杂交 （过夜）
7. 杂交结果的检测
（1） 放射线标记——放射自显影，感光胶片，显出黑 色杂交带；
（2） 非放射线标记——直接显出杂交带，进行检测。
.
25
②
③ ①
分子杂交实验过程 .
目录
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பைடு நூலகம் 射 自 显 影 照 片
《分子杂交技术》PPT课件 (2)
优点：i. 用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。 ii. 用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要预
激活；易于操作
缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次）
2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同
(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂 主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同 位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
分子杂交技术
分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物 分子的一门技术。
分
备样
子
品 泳电 膜转
杂
交
制
原
理
及
流
交杂
示结 果 显
程
探针制备
图
精选课件ppt
1
一. 分子杂交种类
1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体
2）蛋白质的免疫分析
制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封 闭剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色 反应（EIA）
或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）
精选课件ppt
5
三、 杂交样品膜的制备
1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结 合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）
激活；易于操作
缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3次）
2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价结合，可用不同
(2) 用无菌牙签将各个菌落先转移至滤膜上,再转移至含有选择性抗生素但未放滤膜的琼脂 主平板上。应按一定的格子进行划线接种(或打点)。每菌落应分别划线于两个平板的相同 位置上。最后，在滤膜和主平板上同时划一个含有非重组质粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培养至划线的细菌菌落生长到0.5-1.0mm的宽度。
分子杂交技术
分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物 分子的一门技术。
分
备样
子
品 泳电 膜转
杂
交
制
原
理
及
流
交杂
示结 果 显
程
探针制备
图
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1
一. 分子杂交种类
1. 按其分子种类划分 1） DNA杂交—探针为DNA或RNA 2） RNA杂交—探针为DNA或cDNA 3） 蛋白质免疫分析—探针为抗体
2）蛋白质的免疫分析
制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封 闭剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色 反应（EIA）
或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA）
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三、 杂交样品膜的制备
1. 固定基质的种类与特性 1）硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子的结合，其机理不清楚，可能为被动吸附。 NCF不能结 合小分子DNA，RNA和蛋白质（<20,000）
核酸分子杂交及芯片技术(共68张PPT)
〔二〕标记法
•酶反响法 将标记物〔放射或非放射〕预先标记在核
苷酸分子上，然后通过酶促反响将标记的核 苷酸分子渗入探针分子中。
•化学反响法 利用标记物(非放射为主)分子上的活性基团
与核酸分子上的基团发生化学反响而将标记物 结合到探针分子上。
1、随机引物法〔random priming〕 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新
Vacuum blotting 30~60分钟
–more efficient and quantitative than capillary –must apply vacuum evenly and not too strongly
3．印迹类型
• Southern印迹杂交
• Northern印迹杂交 • 斑点及狭缝印迹杂交
1、利随用机D引N物A聚法用合〔酶ra特来nd合o异m成p与性ri模mi板n的g互〕补细的菌新的、DNA病链。毒的核酸作为探针对组织细胞进
行杂交，确定有无该病原体的感染。
FISH(荧光原位杂交)结果
地高辛标记的探针用抗地高辛-罗丹明显示(红色)
生物素标记的探针，用抗生物素蛋白-FITC显示(绿色)
在组织或细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量。
核酸原位杂交的根本步骤
1.细胞或组织的固定：载玻片 2.组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸外表蛋白质 3.探针的选择和标记
4.杂交 5.杂交结果检测
应用：
探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列
3、复性 变性DNA经过一定处理通过碱基互补重新形成双螺旋的过程。
杂交根本流程
〔一〕核酸分子与固相介质的结合
1.噬菌体/克隆的转移
2.从凝胶上转移DNA:毛细转移、真空转移、 电转移 〔二〕核酸的固定：烘烤〔80℃，2h〕、紫 外、碱
分子印迹渍与分子杂交技术PPT课件
斑点杂交（Dot blot）
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
.
9
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
.
19
菌落原位杂交
（Colony in situ hybridization）
菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝 酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌 以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标 记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信 号，并与平板上的菌落对位。
.
20
实验步骤如下：
①将滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单 菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相 同。
1.Extract DNA from cell
Extract RNA from cell
Extract protein from cell
2.Cut with restriction enzyme
3.Run on gel(usually agarose) Run on gel(usually agarose) Run on gel(usually poly -
斑点杂交（Dot blot）
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
.
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
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9
流程 1.将核酸分子酶切成 为多个片段 2.变性电泳（或者电 泳之后变性）， 使各片段分离 3.将凝胶中的核酸片 段转移到固相支 持物上 4.预杂交 杂交 5.洗膜 6.检测
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菌落原位杂交
（Colony in situ hybridization）
菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝 酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌 以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标 记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信 号，并与平板上的菌落对位。
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实验步骤如下：
①将滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上，用无菌牙签挑取单 菌落种于滤膜和主琼脂平板上，排列成方格栅，膜和板上菌落位置相 同。
1.Extract DNA from cell
Extract RNA from cell
Extract protein from cell
2.Cut with restriction enzyme
3.Run on gel(usually agarose) Run on gel(usually agarose) Run on gel(usually poly -
斑点杂交（Dot blot）
菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）
组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）可以确定探针的互补序列 在胞内的空间位置
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核酸分子杂交技术李ppt文档
4. 随机引物延伸标记方法
是从单链DNA或RNA模板合成高比活 性的32P标记探针所选用的方法。原理: 使 长 6-8nt 的 寡 核 苷 酸 片 段 与 变 性 的 DNA 或 RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下， 以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为 引物引发DNA链的合成，在反应时将α-32P dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处 理后，新合成链（探针片段）与模板解离， 即得到无数各种大小的探针DNA。因为所 用真核苷酸片段很短，在低温条件下可与 模板DNA随机发生退火反应，因此，被称 为随机引物(random primer)。这种随机引 物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。
2. DNA快速核酸标记
大肠杆菌聚合酶I经枯草杆菌酶切割可得到两条多肽 链，其中分子量为76kD的大片断称为Klenow片段。该酶 具有完整聚合酶I的5’→3’ 核酸聚合酶活性和3’→5’ 核酸 外 切 酶 活 性 ， 但 缺 乏 5’→3’ 核 酸 外 切 酶 活 性 。 利 用 Klenow片段可以填补由限制性酶消解DNA所产生的3’凹 陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3’ 末 端 。 用 Klenow 片 段 标 记 末 端 一 般 只 用 一 种 [α-32P] dNTP，加入反应的[α-32P] dNTP取决于延伸的5’末端序 列。
核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍有可 能进行碱基配对，这取决于修饰的部位和修饰物的性质。
标记的探针每1kb只掺入10-30个修饰碱基，仅4％-12 ％的单个碱基被修饰的类似物取代。
尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在，但对整个 杂交分子的稳定性影响很小。
二、核酸探针的种类
根据标记方法不同可分为：
放射性探针
非放射性探针
《杂交技术》幻灯片PPT
C
1
2
3
4
5
6
7
8
rRNA
Northern杂交检测
〔四〕、Western杂交
1、定义、 是将蛋白质先经电泳〔 SDS —PAGE 胶〕别离，
然后转移到固相载体上，最后用特异性抗体进 展免疫测定或蛋白质的染色。
Western 印迹法又称蛋白质印迹技术，它是70年 代末，80年代初开展起来的一种蛋白质检测新 技术。其根本过程
结合的探针〔用放射性检测仪探测放射强度〕。
(5) 洗完的膜用滤纸吸干膜外表的水份，并用保鲜膜包裹，
且保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。
X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒， 置-70℃低温冰箱中曝光。
(7) 根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片
2. 随机引物合成法
• 随机引物：能与任何DNA模板的多个位点配对互
补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段。
• 随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA
模板结合,在DNA聚合酶Klenow大片段的作用下,
能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为 原料合成新的与模板DNA互补的探针。 • 通常产物平均长度为400-600个核苷酸。
3、 RNA变性电泳的方法
用一定剂量的乙二醛-二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢 氧化汞等处理RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过 程中变性而完全解离形成单链。
Northern 杂交和 Southern 杂交主要区别在于： Northern 杂交中待测的物质是 RNA。 Southern 杂交中待测的物质是 DNA。
blot一词，有不同翻译，有人叫“印迹法〞， 也有人翻译为“斑渍法〞，更为普通的 是直接称为Southern blot)
第八章 分子杂交技术ppt课件
.
44
1、鉴别RNA 2、探针可用DNA或RNA片段 3、待测样品为总RNA或mRNA
.
45
Northern印迹与Southern 印迹的不同点
1. 总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式 存在，可直接应用于电泳；
2、变性：RNA电泳前加热变性，电泳在变性条件下进行, 以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。 变性电泳主要有3种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟 甲基汞变性电泳。DNA电泳前和电泳 中不变性
杂交过夜（至少18h），然后在较高温度下用盐溶液洗膜。
.
39
3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特 异结合的DNA
在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射 性检测仪探测膜上的放射强度。当放射 强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即 停止洗膜。
洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用
滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包
完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此
之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同
源性）就可以形成杂交双链
.
2
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷 酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。 但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短 （如20～30个核苷酸），则难免会出现 准确性差的假阳性现象。
.
28
（1）毛细管虹吸印迹法
利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中 的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是： 容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬 酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤 纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动， 同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝 胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上
自学内容2分子杂交技术
可编辑ppt
6
基本方法
• 将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝 胶电泳分离各酶解片段；
• 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移 将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干 固定，凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转 移到滤膜的过程中继续保持着。
• 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用 放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置， 确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片 段dization & Blotting Technology
可编辑ppt
1
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一 起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定 的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形 成杂交双链(heteroduplex) 。
4
二、印渍技术的类别及应用
• DNA印迹技术 Southern blotting
• RNA印迹技术 Northern blotting
• 蛋白质印迹技术 Western blotting
• 斑点印迹
Dot blotting
• 原位杂交
in situ hybridization
• DNA点阵
DNA array
• 检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋 白质转移到固相载体上，用特异的抗血
清对蛋白质进行鉴定及定量的方法
• 主要步骤：
– 蛋白质样品的制备 – 聚丙烯酰胺凝胶
– 蛋白质的电转移：尼龙膜 – 靶蛋白的免疫学检测
• 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应 • 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应 • 显色反应：酶促反应
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(1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针
.
15
合成寡核苷酸探针注意原则
(1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续
8个以上碱基序列相同，最好不用。
第八章
分子杂交技术
.
1
第一节 分子杂交的原理
核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按
碱基配对原则形成双链的过程。
分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（
主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序
.
4
变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
.
5
杂交过程是高度特异性的,可以根据所使
用的探针已知序列进行特异性的靶序列
检测。
.
6
一、DNA变性与复性
（一）DNA变性
1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间 的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链
完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此
之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同
源性）就可以形成杂交双链
.
2
不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷 酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。 但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短 （如20～30个核苷酸），则难免会出现 准确性差的假阳性现象。
.
19
按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相杂交
膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交
RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法
.
20
一、Southern杂交
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相 载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探 针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交 信号。通过Southern杂交可以判断被检测的 DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片 段的长度。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植 物基因组DNA≤20分钟。
链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成 中心序列
（4）形成完整的双链分子
.
10
二. 分子杂交的一般程序
待测核酸制备
电泳
制备探针核酸片段
滤膜上核酸固化
探针标记
杂交
加入标记核酸探针
去除未参与杂交的探针
检测杂交信号
.
11
制备DNA或RNA样品→与固定基质结合 →80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→ 洗涤→放射自显影或显色反应。
杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
.
3
杂交的双方：探针和要检测的核酸。
将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记 的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出 目的DNA或RNA分子所处的位置。
被检测的核酸：
克隆化的基因组DNA 提纯的
细胞总DNA 细胞总RNA
细胞内杂交（细胞原位杂交）
.
12
三、 核酸探针的制备
探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目 的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
.
13
1.探针的制备方法
长度一般以50~300bp为宜，有时达1.5kb。 制备方法：
(1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
.
14
2. 探针的分类
据来源及性质不同可分为：
核酸 分子链间的氢键完全断裂。
（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双 链核酸分子链 间的氢键断裂。
（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛 等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
.
7
GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
.
8
（二）复性
1、定义：变性的单链核酸分子在一
定条件下按碱基互补原则重新结合为双
链核酸的过程，称复性或杂交。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补 形成双链：
DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
.
9
2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern
.
印迹杂交的技术流程
23
（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
.
24
（二）待测DNA样品的电泳分离
所用分子量标准可用核素标记，杂交后的标准分子量 DNA也能显影出条带。
.
16
3 . 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要 对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信 号。
.
17
标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物
.
18
第二节 核酸分子杂交的方法
按其分子种类划分 （1）Southern印迹杂交 （2）Northern印迹杂交 3） Western印迹杂交
.
25
（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）
分子量超过10kb的较大的DNA片段，需要很长 的转移时间。必须将最长的DNA片段控制在大 约2kb以下。
如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理（ DNA 产生缺口将提高转移的质量）。
把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动， 直到溴酚蓝从蓝变黄。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂 洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
.
22
限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤 膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 DNA，探针为DNA或RNA。
利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析
、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等
。
.
21
步骤：
(1)酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然 后使DNA原位变性。
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合成寡核苷酸探针注意原则
(1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续
8个以上碱基序列相同，最好不用。
第八章
分子杂交技术
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第一节 分子杂交的原理
核酸分子杂交（nucleic acid hybridization） 指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按
碱基配对原则形成双链的过程。
分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键（
主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序
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变性
复性
DNA-DNA 杂交双链分子
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杂交过程是高度特异性的,可以根据所使
用的探针已知序列进行特异性的靶序列
检测。
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一、DNA变性与复性
（一）DNA变性
1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间 的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性
2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链
完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此
之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同
源性）就可以形成杂交双链
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不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子
若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷 酸以上)，可以得到很准确的鉴定结果。 但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短 （如20～30个核苷酸），则难免会出现 准确性差的假阳性现象。
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按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相杂交
膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交
RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法
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一、Southern杂交
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相 载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探 针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交 信号。通过Southern杂交可以判断被检测的 DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片 段的长度。
注意：处理人类基因组DNA≤10分钟；处理植 物基因组DNA≤20分钟。
链重新解离
（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成 中心序列
（4）形成完整的双链分子
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二. 分子杂交的一般程序
待测核酸制备
电泳
制备探针核酸片段
滤膜上核酸固化
探针标记
杂交
加入标记核酸探针
去除未参与杂交的探针
检测杂交信号
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制备DNA或RNA样品→与固定基质结合 →80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→ 洗涤→放射自显影或显色反应。
杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列， 已知核酸序列称探针。
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杂交的双方：探针和要检测的核酸。
将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记 的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出 目的DNA或RNA分子所处的位置。
被检测的核酸：
克隆化的基因组DNA 提纯的
细胞总DNA 细胞总RNA
细胞内杂交（细胞原位杂交）
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三、 核酸探针的制备
探针（Probe)的概念:
一段带有检测标记的与目的基因或目 的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
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1.探针的制备方法
长度一般以50~300bp为宜，有时达1.5kb。 制备方法：
(1) DNA重组技术 (2) PCR扩增 (3) 化学合成
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2. 探针的分类
据来源及性质不同可分为：
核酸 分子链间的氢键完全断裂。
（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双 链核酸分子链 间的氢键断裂。
（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛 等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。
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GC含量与Tm值之间的关系 （G+C）%=（Tm-69.3) ×2.44 Tm =(G+C)%×0.41+69.3
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（二）复性
1、定义：变性的单链核酸分子在一
定条件下按碱基互补原则重新结合为双
链核酸的过程，称复性或杂交。
具有互补序列的两条单链核酸都可互补 形成双链：
DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、 寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。
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2、复性过程 （1）单链分子间碰撞形成局部双链 （2）局部双链周围的碱基如不配对时，双
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern
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印迹杂交的技术流程
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（一）待测核酸样品的制备 1、裂解或破碎细胞 2、抽取纯化基因组DNA 3、限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段
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（二）待测DNA样品的电泳分离
所用分子量标准可用核素标记，杂交后的标准分子量 DNA也能显影出条带。
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3 . 核酸探针的标记
为确定探针是否与相应基因组DNA杂交，有必要 对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信 号。
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标记的种类
同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针 非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物
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第二节 核酸分子杂交的方法
按其分子种类划分 （1）Southern印迹杂交 （2）Northern印迹杂交 3） Western印迹杂交
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（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）
分子量超过10kb的较大的DNA片段，需要很长 的转移时间。必须将最长的DNA片段控制在大 约2kb以下。
如果靶序列>5kb，则需进行脱嘌呤处理（ DNA 产生缺口将提高转移的质量）。
把凝胶浸在0.25mol/LHCl中，室温轻轻晃动， 直到溴酚蓝从蓝变黄。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。 (4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂 洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
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限制性酶切割
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
DNA经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤 膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为 DNA，探针为DNA或RNA。
利用这一技术可进行克隆基因DNA的酶切图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析
、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等
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步骤：
(1)酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然 后使DNA原位变性。