植物组织培养综述

植物组织培养技术综述

摘要：组织培养是细胞生物学研究最常用的方法之一，是指从生物体中取出组织或细胞，在离体的条件下模拟体内的生理环境，使其生存、生长、繁殖或传代，借以观察、研究细胞的生长发育等生命活动现象。植物组织培养以其条件可控、便于观察的优点，在快速繁殖、育种、保护珍贵苗木等工作中应用广泛。以菊花的组织培养为例，从原理、方法和常见问题三个方面对植物组织培养进行讨论。

关键词：菊花；花瓣；MS培养基；组织培养

1 引言

自1902年，德国植物学家Haberlandt根据细胞学说，提出单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）理论以来，组织培养技术的研究已有100多年历史。植物组织培养是指在无菌的条件下，将离体的植物器官（根、茎、叶、花、果实等）、组织（形成层、花药、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞），以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。根据所培养的植物材料的不同，可以把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养、悬浮组织培养、器官培养（胚、花药、子房、根和茎的培养等）、茎尖分生组织培养和原生质体组织培养。现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用，成为最引人注目的生物技术之一，广泛应用于植物的快速繁殖、品种改良、基因工程育种、种质资源保存、次生代谢产物生产等方面，产生了巨大的经济效益和社会效益，对现代农业和医药等领域产生了深刻影响。

2 组织培养基本原理

植物细胞具有全能性，即生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。离体的植物组织或细胞（也称外植体），在培养了一段时间以后会通过细胞分裂形成愈伤组织（愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞）。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物组织的脱分化，或者叫作去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫作再分化。再分化产生的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。

目前普遍使用的是MS培养基，其主要成分包括：大量元素，如N、P、S、K、Ca、Mg；微量元素，如B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co；有机物，如甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等，同时还要添加一些植物激素。MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4摄氏度保存配制好的培养基母液来制备。

细胞生长素和分裂素的比例影响组织块的分化方向。50年代，F.Skoog和ler在烟草茎髓愈伤组织中发现分裂素/生长素的比例高时，利于芽的分化；比例低时，利于根的分化；两者比例适中水平时，愈伤组织占优势。

3 菊花花瓣分化培养的基本操作

3.1 MS培养基的配制

适合菊花花瓣分化培养的培养基为MS+3mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+糖3%+琼脂0.7%，pH 5.8。

3.2 外植体的灭菌消毒

选取新鲜的菊花花瓣，用洗衣服洗净表面，自来水冲洗30min，再用吸水纸吸干水分。然后移入超净工作台，用70%乙醇消毒30s，接着用饱和漂白粉消毒20min或0.1% HgCl2溶液消毒10min。最后用无菌水洗5~6次，灭菌过的滤纸吸干水分。

3.3 接种培养

用灭菌的剪刀把花瓣头尾剪去，剪成一至两段，接种在MS+3mg/L6-BA+0.1mg/L NAA的培养基中，经26~28℃，光照度1000~2000lx，每天照光12h，培养14d左右，就可诱导出愈伤组织，再培养10~15d便可分化出不定芽。当芽长到1~2cm时，分割芽转入MS+0.5mg/L NAA生根培养基中，继续培养10d左右，就可长出白根，形成完整的植株。

4 植物组织培养中常遇到的问题

4.1 操作中需注意的事项

（1）接种需要严格执行无菌操作：用的工具、器具、培养基必须结果高压灭菌。接种前，要用紫外消毒接种室20min，接种者要用肥皂洗干净双手，然后用70%酒精棉球消毒。

（2）外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件。

（3）要轻压外植体，保证与培养基的充分接触，但又要注意不可完全浸没，因为需要与空气接触。（4）接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒，控制好温度和光照。

4.2 褐变现象

在组培过程中，部分外植体会产生褐变现象。这是由于建立外植体无菌系时，切口处细胞受损，破坏了酚类化合物和多酚氧化酶的分隔状态，两者相遇形成醌类，并进一步与蛋白质聚合，从而引起组织代谢紊乱、生长停滞，最终衰老死亡。影响褐变的因素较多，这些因素包括品种基因型、外植体年龄、部位以及大小和取材时间、外植体消毒方式、培养基配方、光照强度。控制组培过程中褐变的措施有；选取幼龄外植体抗氧剂，吸附剂等。

4.3 玻璃化现象

玻璃化现象是植物组织培养过程中特有的一种生理失调或生理病变，多数发生在植物茎尖培养和离体快繁中，因为组织上畸形，吸收器官，光合器官发育不全，很难移栽成活。影响组培苗玻璃化的原因有以下几种类型：激素的种类、浓度；琼脂的浓度；外植体的取材部位；不适宜的培养条件。因此采取的克服方法也要因原因的不同而决定。

4.4 白化苗

这种白化苗的形成原因并不是无质体，而是质体结构不完整，不能正常合成叶绿素，因此这种苗一般是不能遗传的。

4.5 染色体数目变异

通过愈伤组织培养植株时，常会出现染色体数目的变异，包括倍性变异和非倍性变异。这种变异普遍认为是有丝分裂异常现象，可视为染色体什么的变异和结构变异最直接的细胞学证据。

5 组织培养的应用

5.1快速繁殖优良种苗

由于组织培养有周期短、增殖率高、不受季节限制等特点，这就可以在短时间内快速培养出大量的植物，而且使不能或很难繁殖的植物进行繁殖。

5.2无病毒苗的培养

植物在生长过程中都会遭受到病毒不同程度的危害，从而影响产量和品质。为了解决这些问题，可以采用茎尖培养的方法，得到无病毒植株，该方法已在很多作物的常规生产上得到应用，如马铃薯、甘薯、草莓、苹果、菊花等。

5.3在育种上的应用

植物组织培养技术还为育种提供了许多新的手段和方法，如用花药培养单倍体植株；用原生质体进行体细胞杂交和基因转移；用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精等；种质资源的保存等。