生物化学技术与原理 (2)

第一章生物化学基本操作与要求

1.洗涤剂的种类配置与应用

（1）铬酸洗液

由重铬酸钾与浓硫酸组成，具强酸性、强氧化性，适合用于玻璃器皿的洗涤。棕褐色，用久了之后颜色变绿，失效

（2）30％硝酸洗涤CO2测定仪器及微量滴管

（3）45％尿素洗涤蛋白制剂、血样

（4）有机溶剂

（5）去污粉

2.化学试剂的分级

3.什么是准确度、精密度？

1. 准确度与误差

准确度的高低可用误差衡量

绝对误差＝测定值－真实值

相对误差＝绝对误差/真实值×100％

2. 精密度与偏差

精密度指多次测量结果相互吻合的程度，表示测定的再现性。

精密度的高低用偏差衡量。

绝对偏差＝测定值－算术平均值

相对偏差＝绝对偏差/算术平均值×100％

4.如何提高实验的准确度、精密度？

准确度——系统误差

（1）仪器校正

（2）空白实验

（3）对照实验

精密度——偶然误差

（1）平均取样

（2）多次取样

第二章层析技术

1.层析技术及其原理

层析（色谱）技术是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。

层析都是由互不相溶的两个相组成:一是固定相，一是流动相。层析时，利用混合物中各组分理化性质的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（Kd）不同，随着流动相从

固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。

2.名词

固定相：固定相是层析的基质。它可以是固体物质（如吸附剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。

流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。

分配系数：分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用Kd来表示。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。

Kd =固定相中的总量/流动相中的总量

3.层析法的分类

(一)根据流动相的形式分类

气相色谱法：气固色谱法和气液色谱法

液相色谱法：液固色谱法和液液色谱法

（二）按固定相的形式分类

柱层析法：柱层析法是将固定相装在一金属或玻璃柱中做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。

纸层析法：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。

薄层层析法：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。

(三)按分离原理分类

1.吸附层析

2.分配层析（正相色谱、反相色谱）

3.凝胶排阻层析

4.离子交换层析

5.亲和层析法

4.几种主要凝胶的名称、型号、及型号数字代表的含义

1）交联葡聚糖凝胶，Sephadex 的主要型号G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml/g干胶）乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。

2）聚丙烯酰凝胶，Bio-gel P，p值表示不同的交联度，p越大，孔径越大。P后的数字乘1000相当于凝胶排阻极限。

3）琼脂糖凝胶，常见的主要有Amersham(Pharmacia)(GE) 生产的Sepharose（2B ~6B）和Bio-Rad 生产的Bio-gel A

4) Ultragel 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶

5）Sephacryl凝胶

6） Superdex凝胶、Superrose凝胶

7）聚乙烯醇凝胶toyopearl

8）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel

5.凝胶层析及其基本原理、操作过程和主要应用

凝胶色谱也称为凝胶排阻层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。

原理：由于被分离物质的分子大小不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层

析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动

速度慢而后流出层析柱。

操作过程：

1）凝胶的选择：粒子大小与孔径的选择分组分离、分级分离

2）层析柱：柱内径、长度；比值1:25~100

3）凝胶处理：吸水膨化，要对凝胶进行纯化，排除气泡

4）装柱：避免气泡，漏出粒子，防止分层

5）柱填充的检查

凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。

6）加样

要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。

一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－10％左右。

7）洗脱

和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。一般采用低离子强度的盐溶液一般凝胶的流速是10 cm / hr

8）再生：洗脱完毕

9）保存

凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02％的叠氮化钠，4°C下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥。

应用：

1）脱盐及去除小分子杂质

2）蛋白质的分离、生物大分子的纯化

3）分子量测定，K ＝－b lg MW＋c Ve＝－b'lg MW＋c‘

4）去热源物质

5）溶液的浓缩

6.离子交换层析的原理、离子交换剂的类型

依据各种带电离子或生物大分子与带相反电荷离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。

（1）根据离子交换剂的基质

分离小分子物质：聚苯乙烯离子交换剂

分离大分子物质：葡聚糖离子交换剂

（2）离子交换剂的电荷基团：

阴离子交换剂:

AE-纤维素（弱碱型）

PAB-纤维素（弱碱型）

DEAE-纤维素

DEAE -Sephadex

DEAE -纤维素（强碱型）

QAE-纤维素（强碱型）