血管形成的测定方法(

血管形成的测定方法血管形成是从已经存在的血管床中通过内皮细胞增殖和迁移,以芽生或非芽生的方式生成新生血管系统的过程，与正常的生理过程(如伤口愈合、胚胎发育等)和许多病理过程(如肿瘤的生长和转移、类风湿性关节炎、脑和心血管等疾病)密切相关[1, 2]。

血管形成中的主要细胞是内皮细胞，它存在于所有的血管上，通过内皮细胞的迁移、增殖、分化和结构重建构成了新的毛细血管网。

除内皮细胞在血管发生过程起重要作用外，支持细胞(如肿瘤细胞、外周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞)、细胞外基质、血液细胞和体液成分也都与血管的发生有关。

因此，血管发生的测定非常复杂。

当今尚未有任何一种体外的实验方法能精确地模拟这一复杂的过程，但结合体外、体内血管形成的测定方法，可以有效地了解血管发生的作用机理。

本文介绍了当前体内外用来研究血管形成的一些基本方法和最新方法，并对这些方法的优缺点进行了深入探讨。

1 血管形成的体外测定方法体外测定血管形成的方法主要侧重于外源性抑制剂或刺激因子对内皮细胞的迁移、增殖和成管的作用。

对内皮细胞的测定，关键问题在于内皮细胞具有物种和器官的差异性。

内皮细胞表型的差异已在大血管衍生的内皮细胞(如人脐静脉内皮细胞)和微血管器官的内皮细胞(如人类皮肤毛细血管内皮细胞)中被证实[3, 4]。

在培养中，内皮细胞的活化状态、染色体表型、细胞表面抗原的表达和它们的生长特性都会发生改变，将失去体内生长的一些特性[3]。

另外，在体外，内皮细胞在静止环境、动态环境、结合不同的基质的情况下，它们的特征也不同，因此它并不能完全代表体内复杂的生理过程。

尽管用内皮细胞作为模型来研究体内血管发生具有很大的局限性，但体外测定方法具有快速、易定量、可重复性高等特点。

1.1 内皮细胞增殖测定法血管内皮细胞的增殖是血管发生的重要步骤。

目前，已有多种成熟的细胞增殖测定方法，如四氮唑盐还原法等。

[3H ] 胸腺嘧啶掺入法和细胞周期动力学检测法是两种主要的细胞增殖测定方法。

四氮唑盐〔3 (4,5 dimethylthiazol 2 yl) 2,5 diphenyl tetrazolium bromide, MTT 〕还原法，又称MTT比色法，是一种最常用的检测细胞存活和生长的方法。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒 (Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

MTT结晶形成量与细胞数成正比。

该方法已被用于检测活细胞增殖，并广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等[5]。

与之相比，[3H ] 胸腺嘧啶掺入法是一种更好的测定细胞增殖的方法。

将同位素氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H TdR)作为DNA合成的前体掺入到增殖细胞中,通过放射自显影观察细胞增殖情况。

传统的以5 溴脱氧尿苷(BrdU)作为核苷酸取代胸腺嘧啶掺入到新生成细胞的DNA中，通过用单克隆抗体检测与DNA结合的BrdU ，反映细胞增殖状态的方法，虽然较以上方法有所进步，但其仍或多或少的受外源性示踪物的影响[6]。

同时细胞增殖的变化可能是由细胞毒性而非测试药物的影响作用，因此结合细胞增殖测定法和细胞凋亡检测法的特点，可能会获得更为精确的结果。

1.2 内皮细胞迁移测定法目前，对血管内皮细胞迁移的影响，已经有很多有效的测定方法。

其中以改良的Boyden Chamber 或Transwell 法最常用[7] 。

这些方法均是通过观测穿过一定孔径(如8 μm) 硝酸纤维素薄膜的细胞数量,确定细胞迁移能力。

近年来虽然又有新型Millicell HA 底膜培养皿式双室联合培养系统出现,但是它们的原理一样,利用细胞穿过微孔滤膜来观测一种细胞对另一种细胞迁移的影响。

划痕损伤的方法在国外出现较早。

用移液器滴头或刀片在单层血管内皮细胞的培养皿上划痕，为边缘内皮细胞迁移提供一裸露区域。

经过创伤后边缘的单层内皮细胞可迁移至创伤区域，并重新形成新的单层内皮细胞层。

在光镜下计数从损伤边缘迁移出的细胞数和迁移的相对距离，并计算出细胞的实际迁移距离。

然而这种方法的定量具有任意性。

1.3 成管测定法血管形成中最典型的测定是对内皮细胞形成三维结构能力的测定。

在体外给予适合的细胞外基质成分，内皮细胞能形成管状结构。

在含有胶原和纤维蛋白凝块的塑料培养皿中，内皮细胞初期在水平面形成细胞条索结构，经过12 h或更长时间培养，细胞条索开始向上发出分支，贯穿凝胶形成三维的管状网络结构[8]。

在一系列的血管发生测定中，成管测定占有重要的位置[9, 10]。

内皮细胞不仅能在二维空间形成毛细管，也能在三维空间对细胞行为进行定量分析，这更为接近体内细胞生长的环境。

定量分析包括在凝胶中从下到上对不同长度管进行拍照，测量每个管的长度(水平面上的宽度和垂直面的高度)和管的最大直径等。

1.4 器官培养测定法器官培养方法极大地推进了对血管形成的测定。

器官血管形成测定法包括鼠主动脉环、鸡主动脉弓、猪颈动脉、胎儿鼠骨移植测定法等。

这些测定法非常相似，其中鼠主动脉环测定应用最为广泛。

在体外，通常把分离的器官片段、胎盘或部分器官放于含有待检测物质的基质(如纤维)中培养，10～14 d后，可检测内皮细胞生长形成血管，通过测量移植体的长度和形成微血管的数目来定量测定血管的发生[11]。

然而，血管定量测定也非常困难，因为微血管的向外生长总是成簇在一起，因此它们所覆盖的区域就很难测定。

2 血管形成的体内测定方法以上叙述的一系列体外测定方法已被用来研究血管形成的不同方面，然而对不同来源内皮细胞的分离和体外培养发现，不同来源的血管内皮细胞对各种外界因素的反应不同。

体外培养的内皮细胞行为和形态受到多种实验参数的影响：基质的自然状况、所用培养介质及血清的类型、各种外界因素、收集细胞的方法以及传代次数等。

因此，近年来体内实验系统被广泛地重视和应用，并且得到迅速发展。

在以往发表的很多文章中，大量的体内测定法已经被详细的描述过，笔者结合最新的进展作进一步的详述。

2.1 背侧皮肤/气囊模型测定法β背侧皮肤/气囊模型是用来检测药物对由体内癌细胞所触发的新生血管生成反应的影响[12]。

用滤纸覆盖微孔环两侧，形成一个腔系，用肿瘤细胞悬浊液填充这个腔系，然后将其植入到麻醉老鼠的经皮下注射形成的皮下气囊中。

用检测物质处理后，将腔室除掉，然后将相同的多聚物环放置在与腔系直接接触的位点。

新生血管形成的反应可通过计数新生血管的数目来检测。

这种检测法相对来说操作比较简单，然而操作仍需细心，以避免引起腔系表面血管的形成，因为微孔环本身能诱导新生血管的形成，从而掩盖了由细胞所诱导的新生血管的形成。

2.2 海绵聚合体植入和基质胶塞测定法在皮下植入包含细胞或血管发生刺激因子的聚合体基质(以海绵或基质胶塞的形式)已经越来越多的应用于研究体内血管的发生[13]。

将被检测物直接或制成片剂置于海绵中，通过一系列的方法，如组织学(组织浸润)、形态学(血管密度)、生物化学(DNA 、蛋白和血红蛋白的含量) 等方法检测新生血管生成[14]。

然而，海绵的大小、形状和组分的不同对实验结果都会有影响;此外，植入能引起非特异性的免役应答，这些免役应答可能自身会导致血管形成的发生。

基质胶塞测定法被广泛用于评价生长因子的促血管新生能力,如VEGF[15]。

基质胶是富含层连蛋白的细胞基质, 可以诱导和保持多种细胞的分化。

基质胶在4 ℃时成液态, 与各种生长刺激因子混合后注射到小鼠腹部皮下组织, 在小鼠正常体温条件下很快形成固体凝胶, 使生长刺激因子缓慢释放。

通过组织学检测，图像分析塞内的血管面积(mm3) 或通过检测基质胶中血红蛋白的含量对血管生成进行定量分析。

尽管基质胶比较昂贵，但与人工海绵相比, 基质胶提供了血管发生更为自然的微环境。

2.3 鸡胚绒毛尿囊膜(chick choriollantoic membrane，CCM) 和卵黄囊(yolk sac membrane，YSM)膜测定法鸡胚绒毛尿囊膜和卵黄囊膜测定法是研究血管形成最常用的体内测定法[16]，在很多文章中都有比较详细的描述[17-19]。

目前这两种模型的应用已较成熟，并且广泛用于研究血管生成和抗血管生成中[20]。

CAM 模型有侧室开窗法和顶端气室开窗法，开窗暴露出CAM，以明胶海绵、定性滤纸或甲基纤维素作为载体，将药物植入到CAM 上,2～3 d 后就会观察到移植物周围典型的放射状排列的新生血管。

YSM法是对CAM法的改进，将72 h鸡胚整体去掉蛋壳，移植到无菌平皿中，这样在YSM发育过程中，可以持续观察血管发生的过程，并且可在更大范围和时间内定量测定血管的发生。

该方法克服了CAM法难以确定加样部位的缺陷，使药品加入部位一致，并可在同一部位多次给药，观察结果简便可靠。

另外，近20年来，鸡胚尿囊膜移植瘤模型也被用于肿瘤血管形成机制的研究。

这种模型可能是研究肿瘤诱导的血管发生最理想的模型，因为宿主的免疫系统还没有完全成熟，肿瘤种植到尿囊膜上2 d内保持无血管的状态，之后新生血管进入肿瘤，并且快速生长，形成丰富的血管网。

鸡胚尿囊膜和卵黄囊膜法技术具有相对操作比较简单、取材方便、无需特殊设备、经济、实验周期短、适合于大规模筛选等优点，又能定性或半定量的检测肿瘤组织、细胞分泌成分及各种生物因子对血管的活性作用，是研究肿瘤生物学特性，特别是肿瘤诱导血管发生的良好模型。

但CAM和YSM本身就是一个丰富的血管网络，这样就很难从已存在的血管中区分出新生的毛细血管[22]。

另外，CAM很容易发生炎症反应，对氧压的变化也非常敏感，所以开窗就成为实验过程中一个非常重要环节。

2.4 角膜血管形成测定法该测定法被认为是一种最好的定性检测方法。

角膜本身是一个无血管的部位，因此，经过血管发生诱导因子刺激而在角膜中所观察到的血管都是新生血管，这样就可以避免其他模型中所存在的原有血管干扰的现象[23]。

角膜微囊模型多采用啮齿动物如兔、鼠的角膜。

将含有诱导血管形成药物的片剂或多聚体植入角膜，使药物缓慢释放，触发新生血管的生成。

检测物质通常以缓慢释放的多聚体或片剂的形式植入到角膜中。

然而许多多聚体检测物成分可能会刺激角膜，引起炎症反应，从而干扰了血管发生的定量测定[24, 25]。

目前以聚乙烯海绵为载体给药的方法就避免或减少了这种影响。

实验中，可用计算机图像分析联合黑色墨汁灌注角膜来定量测定新血管发生的反应。

最近，荧光染料标记的高分子量葡聚糖已经广泛的应用于角膜血管发生[24]。

目前，出现了一种非侵袭性的记录整个角膜血管发生过程的方法[23]，计算机图像分析联合计算机图像数据采集的方法，通过像素计数来计算血管的面积。

角膜血管发生测定法的优点是:角膜本身没有已经存在的血管背景的问题，同时，实验对象比较普遍。