SRY基因研究进展及其在动物性别鉴定中的应用_孙伟丽

ＺＨＵＡＮＬＵＮ ＺＯＮＧＳＨＵ
专论 综述
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｖｏｌ．１６ Ｎｏ．３ ２００８
Ｓ ＲＹ 基因研究进展及其在动物
性别鉴定中的应用
孙伟丽， 李光玉， 钟 伟， 常忠娟
（ 中国农业科学院特产研究所， 吉林 吉林 １３２１０９）
全称是 Ｙ 染色体性别决定区， 是哺乳动物雄性的性别 决定基因， 是 Ｙ 染色体上决定生物雄性性别的基因片 段。ＳＲＹ 基因是睾丸决定因子（ ｔｅｓｔｉｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ） 的最佳候选基因， 已经得到很多试验的证实。ＳＲＹ 基因 普遍存在于哺乳动物 Ｙ 染色体中， 但位置、大小、结构 等不尽相同。ＳＲＹ 基因的检测可以做到特异而快速地 判 定 性 别 结 果 。 ＳＲＹ 基 因 最 早 于 １９９０ 年 首 先 由 Ｓｉｎｃｌａｉｒ 等 从 人 类 Ｙ 染 色 体 上 分 离 出 来 ， 并 且 经 过 Ｋｏｏｐｍａｎ 等通过转基因小鼠证实。Ｋｏｏｐｍａｎ 等将含有 ＳＲＹ 基因的 ＤＮＡ 片段（１４ ｋｂ）移植给 ＸＸ 鼠体内， 小鼠 发育为雄性， 这一实验结果揭示了动物性别控制的根 本途径。当该基因有突变、缺失和易位等均可导致性反 转或生殖器发育异常。从发现 ＳＲＹ 基因至今不到 ２０ 年的时间里， 生物学研究学者关于该基因开展了多方 面的研究， 取得了很大的进展。 ２ ＳＲＹ 基因克隆研究现状
原理是从早期胚胎取下少量细胞， 将其 ＤＮＡ 与 Ｙ 染色体特异性标记的 ＤＮＡ 序列杂交， 阳性为雄性胚 胎， 阴性为雌性胚胎。用于检测的 ＤＮＡ 探针方法有两 种：荧光原位杂交法（ＦＩＳＨ）和 ＤＮＡ 探针提取物结合法， ＦＩＳＨ 可以直接利用荧光标记的 Ｙ 染色体特异性 ＤＮＡ 序列与待测细胞杂交， 在荧光显微镜下观察， 阳性为雄 性， 阴性为雌性。ＦＩＳＨ 包括荧光素探针制备、探针与靶 ＤＮＡ 的变性及杂交、观察鉴定 ３ 个步骤。ＤＮＡ 探针法 准确率达 ９５％ 以上， 与 其 他 方 法 相 比 ， 具 有 高 效 快 速 和错误率低的优势， 在实践中也取得了较好的效果。 Ｌｅｏｎａｒｄ 等首次鉴定牛囊胚获得成功， 准确率为 ９５％ ， Ｔａｔｓｕｏｋａｗａｒａｓａｋｉ 等报道， 用双探针标记 ＦＩＳＨ 准确鉴 定精子染色体。 ３．２ ＰＣＲ 反应法
自 １９９０ 年 ＳＲＹ 基因首次被分离出来， 随后人们 对于这个与性别决定有关的基因研究热情有增无减。 很多动物 ＳＲＹ 基因相继被克隆、测序： 在国 内 研 究 领 域， 杨其沅等对牦牛 ＳＲＹ 和 ＴＲＯ 基因部分序列进行 克隆与测序分析。赵雪等研究了牛 ＳＲＹ 基因的克隆与 测序， 克隆出长度为 ２ ７１３ ｂｐ 的牛 ＳＲＹ 基因。裴杰等 发表论文“中国荷斯坦牛 ＳＲＹ 基因编码区的克隆与原 核表达”， 结果表明 ＳＲＹ 基因编码区长 ６８７ ｂｐ， 编码 ２２９ 个氨基酸。付强等对水牛 ＳＲＹ 基因进行了克隆及 序列分析， 并且用 ＢＬＡＳＴ 与牛属动物 ＳＲＹ 基因比对， 结果显示同源性为 ９６％ 。帅丽芳等发表论文“１３／１７ 罗
目前， 除了人类很多性别发育异常或性别反转患 者 ＳＲＹ 基因被分离研究外， 很多动物的 ＳＲＹ 基因相继 通 过 ＰＣＲ 扩 增 法 或 从 ＤＮＡ 文 库 中 筛 选 的 方 法 获 得 。 为 利 用 ＳＲＹ 基 因 进 行 性 别 鉴 定 和 性 别 控 制 提 供 理 论 依据。 ３ 利用 ＳＲＹ 基因进行性别鉴定
收稿日期： ２００８－ ０２－ ２５ 作者简介： 孙伟丽（ １９８２－ ） ， 女， 硕士研究生， 助理研究员。
伯逊易位猪 ＳＲＹ 基因的克隆及其序列分析”。杨弘等 发表论文“奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼 ＳＲＹ 基因同源 克隆和序列分析”， 并根据这些结果构建了罗非鱼系统 分类树， 表明奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼具有很近的 亲缘关系。张亮等在对林麝及马麝 ＳＲＹ 基因片段克隆 及其在系统进化分析中的应用得出， 克隆的林麝及马 麝 ＳＲＹ 基因片段经测序， 其长度为 ６８４ｂｐ。从父亲遗传 角度出发， 利用 ＧｅｎＢａｎｋ 中收录的 １８ 种偶蹄目 ＳＲＹ 基因， 用邻位相接法（ＮＪ）和最大简约法（ＭＰ）分别构建了 鹿科、牛科和麝科的系统进化树。聚类树显示麝形成一 个单系， 支持麝作为独立一科的观点。鲁晓萱进行小麂 ＳＲＹ 基因的克隆和测序， 张悦等进行了染色体显微切 割与 ＤＯＰ－ ＰＣＲ 结合对赤麂 ＳＲＹ 基因克隆、测序及初 步定位的研究。
方向， 以期为将来能有效利用该基因达到性别控制提供思路。
关键词： ＳＲＹ 基因； 性别鉴定； 性别控制
中图分类号： Ｓ８１４．４
文献标识码： Ｂ
文章编号： １００５－ ２７３９（２００８）０３－ ０００１－ ０３
１ ＳＲＹ 基因概述 ＳＲＹ 基因（ ｓｅｘ－ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｙ－ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）
聚合酶链 式 反 应（ＰＣＲ）是 ２０ 世 纪 ８０ 年 代 发 展 起 来的一项 ＤＮＡ 体外扩增技术。其原理是通过合成 ＳＲＹ 基因或其他 Ｙ 染色体上特异性片段的部分序列作为引 物， 在一定条件下进行 ＰＣＲ 扩增反应， 能 扩 增 出 目 标 片段的胚胎为雄性， 否则为雌性。其操作程序主要分为 ４ 步： 第 １ 步， 胚胎的获取， 第 ２ 步， 引物的设计， 根据 ＳＲＹ 基 因 或 Ｙ 染 色 体 上 特 异 性 片 段 设 计 引 物 ， 第 ３ 步， ＰＣＲ 扩增， 第 ４ 步， 电泳检测。能同时检测出目标基 因或目标特异性片段的为雄性胚胎， 否则为雌性胚胎。 该方法具有特异性强、灵敏度高、快速、准确、简便等优 点。自 Ｈｅｒｒ 等建立早期胚胎性别鉴定 ＰＣＲ 方法以来， 在奶牛胚胎鉴定中取得了显著的实践效果， 曾溢涛等 通过对奶牛 ＳＲＹ 基因的直接测序， 设计引物用 ＰＣＲ 扩 增 ＳＲＹ 基因检测奶牛胚胎的性别。杨建明等通过扩增 奶牛 Ｙ 染色体特异 ＤＮＡ 序列鉴定奶牛早期胚胎性别。 该方法存在的最大问题是容易污染， 因而在操作过程 中必须严格操作规程， 以避免外源 ＤＮＡ 的污染。
家畜胚胎的性别鉴定和后代性比例的控制， 是现 代畜牧科学研究和生产的重大课题之一， 它对提高畜
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牧生产的经济效益有着十分重要的意义。由于性别不 同， 某些家畜的生产性能和特点也不相同， 性别之间的 经济价值也相差悬殊。以牛为例， 对奶牛来说， 产奶母 牛的经济效益较高， 因此人们都希望它多产母犊。以鹿 为例， 鹿茸是营养价值很高的一类保健品， 公鹿能够生 鹿茸而母鹿则不能， 如能有计划地控制雄性的出生率， 就可以按照人们的意愿获得最大的经济效益。以经济 动物林蛙为例， 如果能够在林蛙胚胎发育的适当时期， 用适宜的化学、物理、激素刺激等方法诱导雌性产生 ， 增加雌性的比例， 将能够大大增加经济收益。带动林蛙 养殖行业发展。
利用 ＳＲＹ 基因对 早 期 胚 胎 进 行 性 别 鉴 定 的 主 要 报道有， 吕文发进行了扩增 ＳＲＹ 基因鉴定 牛 、羊 胚 胎
性别的初步研究， 利用自行设计的 ＳＲＹ 基因 ３ 对常规 ＰＣＲ 引物扩增牛 ＳＲＹ 基因和羊的 ＳＲＹ 基因。结果表 明： 第 ２ 对引物扩增出公牛和公羊基因组的 ＤＮＡ７５０ ｂｐ 左右清晰条带， 而母牛、母羊基因组 ＤＮＡ 无此扩增 条带， 说明第 ２ 对引物可以应用于牛和羊的早期胚胎 性别鉴定。张秀华等利用 ＳＲＹ 基因和微卫星标记鉴定 反刍动物性别， 以反刍动物为研究对象， 应用多重 ＰＣＲ 技术扩增绵羊基因组中 Ｘ、Ｙ 染 色 体 上 的 ４ 个 微 卫 星 标记和 ＳＲＹ 基因。根据基因型进行性别鉴定， 试图通 过一次 ＤＮＡ 扩增同时提供性别鉴定和基因分型的信 息。结果表明， 所设计 ＳＲＹ 基因的引物具有高度特异 性， 是性别鉴定的主要依据， 得出结论在被检个体中， 能 同 时 扩 增 出 ＳＲＹ 基 因 、ＭＣＭ１５８、ＭＡＦ４５， Ｘ 染 色 体 上 ＭＩＬＶＥＴ０９ 和 ＡＥ２５， 且 Ｘ 染色体上的 ＭＩＬＶＥＴ０９、 ＡＥ２５ 基因型为纯合子的个体为正常的雄性；被检个体 中 只 有 Ｙ 染 色 体 上 ＭＣＭ１５８、ＭＡＦ４５ 和 Ｘ 染 色 体 上 ＭＩＬＶＥＴ０９、ＡＥ２５ 的扩增产物， 而没有 ＳＲＹ 基因的扩 增产物， 则被检个体为雌性， 且 ＭＩＬＶＥＴ０９、ＡＥ２５ 的基 因型对雌性个体的性别判断无影响。杨宝田等应用 ＳＲＹ－ ＰＣＲ 扩 增 鉴 定 狍（Ｃａｐｒｅｏｌｕｓ ｃａｐｒｅｏｌｕｓ）的 性 别 ， 对 ＳＲＹ－ ＰＣＲ 产物克隆测序， 得到 １８５ｂｐ 的 ＳＲＹ 基因部 分核苷酸序列。试验为狍种群性别比率及其种群动态 变化机制研究提供了资料。王加连等开展了 ＰＣＲ 扩增 ＳＲＹ 基因进行鲸类动物性别的鉴定的研究， 用 ＰＣＲ 扩 增江豚、长喙真海豚等鲸类动物的 ＳＲＹ 基因片断， 并 对其进行凝胶电泳分析来鉴定鲸类动物的性别。通过 此方法对 ８７ 个已知性别鲸类动物标本的检验， 结果完 全正确， 并进一步应用此方法成功地完成了另外 ３３ 个 未知性别鲸类标本的性别鉴定。由此建立了一套简单、 快速、可靠的鲸类动物的性别鉴定方法。侯建等利用 ＳＲＹ－ ＰＣＲ 法快速鉴定体外培养兔胎儿成纤 维 细 胞 系 的性别， 他们从怀孕 １７ｄ 母兔取得 ３ 个胎儿， 分离培 养 得 到 ３ 个 胎 儿 成 纤 维 细 胞 系 ＲＦＦ１ 、ＲＦＦ２ 和 ＲＦＦ３ 。通过扩增兔 ＳＲＹ 基因核心序列片段对 ３ 个细 胞系的性别进行鉴定（ ＳＲＹ－ ＰＣＲ） 。结果表明： ＲＦＦ１ 和 ＲＦＦ３ 为雄性， ＲＦＦ２ 为雌性。进一步利用染色体 核型分析法鉴定 ３ 个细胞系的性别， 与 ＳＲＹ－ ＰＣＲ 法 的结果完全一致。因此表明实验所用的 ＳＲＹ－ ＰＣＲ 的 引物、细胞基因组 ＤＮＡ 的提取方法、ＰＣＲ 反应条件是 合适的， 可以快速准确地鉴定体外培养的兔胎儿成纤 维细胞的性别。 ４ 利用 ＳＲＹ 基因进行胚胎性别控制 ４．１ 通过 Ｘ、Ｙ 精子分离进行性别控制