抗菌药物耐药突变选择窗的研究进展

图 1 在含不同浓度氟喹诺酮药物琼脂平板上的菌落恢复生长曲线
收集 M WS 内生长 的菌株 进行 靶位 基因序 列分 析显示 : 靶位基因氨基酸的改变与药物浓 度有关。菌落恢复生长过程 中 , 氟喹诺酮类 药物 处于 较 低浓 度时 富 集的 细菌 是 非 gy rA 基因突变菌 [ 7 8] , 在适度药物浓 度下是 由几个 不同的 g yr A 基 因突变引起。随着药物浓度的增 加 , 细菌选择压力增加 , 有更 多的保护性 gy rA 基因突变。当药 物浓度 足够高 时可抑 制最 不敏感的一步突变菌生 长。当药物 浓度高 于 M P C 时绝 大多 数的突变菌均不会扩增 。 细菌产生耐药是一个阶梯式 逐步发展的过程。为了检测 这个过程 , 曾有实验将野生 型流行 性嗜血 杆菌接 种到含 环丙 沙星的培养基 上 , 筛选 出 gy rA 基因 突变 体。将 该突 变体 再 接种到含更高环丙沙星浓度的培 养基上 , 又产生了 par C 基因 突变。在每一次突 变体 选择 过程 中 , M IC 和 M P C 值 不断 增 大 , 继而出现了 g yr A par C g yr A 三步耐药突变体 [ 9] 。 细菌发生耐药突变 并在菌 群中得 到优势 生长 , 是细菌 产 生耐药的必需 条件。实 验室 标准 的 M IC 测定 使用 10 5 菌 落 形成单位 ( CFU ) 细菌 , 而细菌发生自发突变的频率很低 , 仅为
基 金 项 目: 国 家 科 技 基 础 条 件 平 台 工 作 重 点 项 目 ( 2005D K A 21202 Baidu Nhomakorabea) ; 河北省卫生厅医学重点课题 ( 08075) 通信作者 : 赵建宏 , Email: z haojh _2002@ yahoo. com 李静现工作单位 : 秦皇岛海港医院 检验科 , 河北 秦皇岛 066000
图 2 血清或组织液中药物浓度的药代动力学变化
M SW 理论认为 , 当 两种 不同 作用 机制 的抗 菌药 物联 合 应用并同时处于 M IC 之上时 , 而细菌需 同时发生两种耐 药突 变才能生长 , 是因为不同作 用机制 的抗菌 药物联 合应用 提供 了一种关闭 M SW 的途径 ( 即使这些 药物有相当 高的 M PC) 。 Z inner 等 [ 23] 在体外药 动学 模型成 功证 明了 利奈 唑胺 联合 多 西环素在限制耐利奈 唑胺屎 肠球菌 突变体 产生的协 同作用。 结果显示 , 单独使用利奈唑胺 ( AU C 24 / M IC 70 小时 ) 处理时 , 在 2 M IC 16 M IC 浓 度 上 有 耐 药 菌 生 长 ; 在 利 奈 唑 胺 ( A U C24 / M IC 230 小 时 ) 处 理 时 无 菌 生 长。 而 利 奈 唑 胺 ( A U C24 / M IC 70 小 时 ) 和 多西 环 素 ( A U C24 / M IC 230 小 时 ) 联合处理可起到同样 的保护 作用 , 说明利 奈唑胺 与多西 环素 在防止肠球菌耐药方面 有协同作用。 随着 M SW 理论的 发展 , 不断 有科 学家将 该理 论由体 外 引入体内。在小鼠体内应用氟喹诺酮类药 物作用于结核分枝 杆菌 , 验证了 M SW 理论。 在小鼠 体内 分别模 拟人 体莫西 沙 星的治疗浓度 ( 0. 25% 莫西沙星 ) 和 高于 M PC 浓度 ( 1. 5% 莫 西沙星 ) 进行比较。前者第 28 天就筛选出了莫西沙星耐 药突 变体 , 在 56 天 时 有 16% ( 3/ 19) 的 大 鼠被 筛 选 出了 突 变菌。 而高于 M PC 组大鼠无耐药突变菌株产生 [ 24] 。 如果药物浓度长期 处于选 择窗范 围内 , 将导致 更多突 变 体的富集。而且经研究发现药物浓度在选 择窗内所处的位置 对于所选择出的突变 体的类 型及数量 也有影 响 : 突变体 多集 中在选择窗的下半部分而非上半 部分。可 能是由于当药物浓 度接近选择窗顶部时能够更有效 的杀死突变体。我国学者崔 俊昌等 [ 25 26] 就在兔感染金黄 色葡萄球 菌模型 研究中 发现 , 当 药物浓度位于 M SW 下部时比药物浓度位于中上部时早 24~ 48 小时 出现耐 药。但当 药物 浓度 保持在 M SW 的 上部时 所 选出的菌株有更高的耐 药性( 4~ 8 倍 ) 。 5 MSW 理论的潜在应用
大 , 抗菌作用越强。时间依 赖性抗 菌药物抗 菌作用 主要决 定 于药物浓度 ( 指游离药物浓度而非总浓度 ) 超过 M IC 的时间 , 超过 M IC 时间越长 , 即 T > M IC 越大 , 抗菌作用越好 , 并 不要 求有很高的药 物浓度。 A U C 24 / M IC 和 T > M IC 用 来评价 抗 菌药物对敏感细菌的累积杀伤力 。将这一 关系引入到耐药突 变亚群 , 用 M P C 来替代 M IC 。因为 测定 M IC 通 常会忽 略突 变亚群 , 应用 A U C24 / M P C 和 T > M P C 可 能 比 AU C 24 / M IC 和 T > M IC 更精确。
临床荟萃
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Clin ical Focu s, January 20, 2010, V ol 25, N o. 2
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10- 7 ( 10 - 8 ~ 10 - 6 ) , 因 此 , M IC 测量 时几 乎不 能发 现耐 药突 变菌。当细菌数量达 1014 时 , 才可能出 现同 时发 生两次 耐药 突变的菌株。临床感染中 某一部位 菌量 可达 10 10 , 但是 不可 能达到 10 14 , 而从 10 10 菌群中能发现耐药突 变菌。所 以 , M P C 的测定就是将 > 10 10 CF U 的菌接 种到 一系 列高于 M IC 浓度 的药物平板上 , 无菌落生长的最低药物浓度即 为 M PC 值。 细菌的接种 量可 影响 耐药 突 变体 的恢 复 生长 [ 10 11] 。如 果接种量太少可能不出现突变体的富集 , 接种量适度 , 最不敏 感的非靶位突变体将会被 富集 , 少数靶 位突变 体的生 长需要 较大的接种量。但接种量过 大会导 致野生 敏感菌 生长 , 建议 采用每个平板菌的接种量为 109 CFU 。因此有 必要增 加琼脂 平板的数量来减少接种菌的密集度。 3 菌落恢复生长曲线 菌落恢复生长曲线一般 可见两 种类型 , 一种 表现为 随着 药物浓度增加菌落恢复生 长出现一 个快速 下降 , 然后 有一个 很大的平台期 , 见于氟喹 诺酮类 药物对分 枝杆菌 [ 3, 7] 、 红霉素 和利福平对 金黄 色 葡萄 球菌 [ 2, 12] 引 起的 耐药。 另一 种表 现 为 , 随着药物浓度增加菌 落恢复 生长出 现一个 快速下 降之后 有一个小的拐点而不是明显的平台。这个小拐点推测是由于 细菌两个独立的药物作用靶 位点对 药物有相 似的亲 和力 ( 例 如 DN A 回旋酶和 DN A 拓扑酶对氟喹诺酮 类药物 ) 。而此时 需要菌体同时 发 生两 次突 变 才可 能生 长 [ 13 14] , 其 M IC 值与 M PC 值非常接近 , 所以 , 没有明显的平台期而 只有一个 拐点。 已经丢失了两个药物作用 靶位点中 一个的 突变菌 , 就 会造成 在菌落恢复生长曲线上出现一个明显的平台期。使细菌有多 重作用靶位点 , 且对 药物 的敏 感性 相似 , 这 就解 释了 为 什么 内酰胺类 药 物 对 肺 炎 链 球 菌 的 M IC 和 M PC 值 非 常 接 近 [ 15] , 也为联合用药缩小或关闭 M SW 提供了理论依据。 有时菌落恢复生长曲线 会出现 一个很 大的平台 ( 即 选择 窗无限大 ) 而没 有第 2 次下 降 , 例如 利福 平作 用于 大肠 埃希 菌、 利福平 对金 黄 色葡 萄 球菌 A T CC29213 引 起 的耐 药 [ 16] 。 提示不能用足够大的药物 浓度来阻 断突变 菌生长 , 一 步突变 菌获得了保护。所以 , 利 福平虽 然对金黄 色葡萄 球菌有 很强 的抗菌活性 , 但单药治疗时效果却不好。 人们曾设想 M P C 与 M IC 之 间是否 有某 种固定 的联 系 , 能从 M IC 推断出 M PC 。经 过大 量的 研究 诸如 : 氟 喹诺 酮药 物对分枝杆菌 ( r2 = 0. 39) 、 金黄色葡萄球菌和肺炎 链球菌[ 17] 及环丙沙星对 临床 分离 大 肠埃 希菌 [ 18] 的研 究 中显 示 , M PC 与 M IC 相关性极低 , 提示用 M IC 来推断 M PC 是不可靠的。 4 体外动力模型和体内动物实验 因为药物浓度在体外培养基上是固定的而在体内的浓度 是波动的 , 因此有必要 将这两 种情况 进行比 较。通过体 外动 力模型实验对金黄色葡萄 球菌的研 究表明 , 当 氟喹诺 酮药物 浓度高于或低于在培养 基上所 测得 的 M SW 时 , 将不会 出现 耐药突变体的富集 , 而当药物 浓度处 于 M I C 和 M PC 之 间也 就是落在 M SW 时 , 将导致耐药突变体选择性扩增 ( 图 2) 。其 他众多类似实验也证明了该观点 [ 19 22] 。 传统 量 化 抗 菌 药 物 活 性 的 的 参 数 是 药 代 动 力 学 ( pha rmacokinetics, PK ) 和 药 效 动 力 学 ( pharmacodynamics, PD) , 且根据 P K/ PD 的特性 将抗 菌药物 分为 两类 , 即时 间依 赖性抗菌药物和浓度依赖性药物。浓度依赖性抗菌药物的抗 菌作用决定于药 物的 峰浓度 ( Cmax ) , 峰 浓度 和 M IC 比 值越
关键词 : 抗生素 ; 抗药性 , 微生物 ; 突变 ; 药代动力学 中图分类号 : R987. 1 文献标识码 : A 文章编号 : 1004 583X ( 2010) 02 0164 04 随着抗生素的广泛应 用 , 细 菌的耐 药性成 为临床 棘手的 一个难题 , 因而引起了 多方面 的广泛 关注。耐药 突变体 的产 生会加速细菌耐药的进程 , 涉 及药物剂 量问题 , Zhao 等 [ 1 2] 和 Dong[ 3] 提 出 了 防 耐 药 变 异 浓 度 ( mutant preventio n co ncentrat ion, M P C) 和突变选择窗 ( mutant selection window , M SW) 理论。该理论强调 耐药突变亚群的存在先于 抗菌药物 治疗的使用 , 而当抗菌药物浓度落在特 定的范围即 M SW 时 , 才引起该突变亚 群选 择性 富集、 扩增。 M SW 的上 界是 能够 抑制最不敏感突变亚群 生长的 最低 药物浓 度 , 被称 作 M PC 。 选择窗的下界是能 够抑制 99% 的 接种 菌生 长的最 低抑 菌浓 度( M IC99) 。当治疗 药 物浓 度 低 于最 低 抑菌 浓 度 ( m inimal inhibitor y concentr atio n, M IC) 时敏感菌和一 步突变菌 均能存 活 , 抗生素治疗无效 ; 当治疗药物浓度高于 M IC 低于 M PC 时 只能将敏感菌杀死而筛选 出一步耐 药突变 菌 ; 当药物 浓度高 于 M PC 时敏感菌 和一 步突 变菌 均被 杀死 , 而 不会 造成 一步 突变菌的富集。传统的用药策略只能杀死敏感菌却导致了一 步突变菌的选择性富集 , 造成抗菌药物 的敏感性下 降。 M SW 理论旨在杀灭一步突变 菌。但是 否只 要药 物浓度 超过 M PC 就能限制细菌耐药性进 展 , 还 需更多 临床实 验来验 证。由于 细菌可在治 疗 过程 中 获 得 耐药 [ 4 6] , 从 公 共 卫 生角 度 来 看 , M SW 理论应用于 指导 合理 用药 对于 延长 抗菌 药物 的寿 命 , 延缓细菌耐药性进程意义重大。在耐药菌成为治疗难题的今 天 , 在用药关注 M IC 的 同时 , 必须 关注 不同 药物 的 M PC, 以 保护微生态环境 , 减少抗菌药物的附加损害。 1 MSW 的定义 M SW 是指 M IC 与 M P C 之间的浓度 范围。 M IC 是指能 够抑制细菌生长的最低 药物 浓度。 M PC 是 指防 止一步 耐药 突变株被选择性富集扩增 所需的最 低抗菌 药物浓 度 , 是评价 抗菌药物抗菌效力 , 反映 药物抑 制耐药 突变株 生长能 力的概 念。选择指数 ( SI) 指 M PC 与 M IC 之比 , 用 于比 较抗菌 药物 选择耐药突变体的 能力。 SI 越 小抗 菌药 物的 防突 变能 力越 强。 2 突变现则窗的理论基础 1999 年 Dong 等 [ 2 3] 在 对结核 分枝 杆菌和 金黄 色葡 萄球
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综述
抗菌药物耐药突变选择窗的研究进展
李 静, 时东彦 , 赵建宏
( 河北医科大学第二医院 检验科 河北省临床检验中心 , 河北 石家庄 050000)
菌的研究中发现 , 随着琼脂 平板中 氟喹诺 酮类药 物浓度 的增 加 , 平板中恢复生长的菌落数出现 2 次明显下降 ( 图 1) 。第 1 次下降发生在 M IC99 时 , 归因于大量野生型 敏感性细菌 的生 长被抑制或杀灭 ; 之后 观察到 一个 相对稳 定的 平台期 , 通 过 DN A 核酸序列分析 , 发现平台期生长的是选择出的耐药突变 菌株 ( 第一步突变菌 ) ; 随着药物浓度进一步增加 , 菌落数出现 第 2 次明显下降 , 直到 浓度增高至 某一限度 时琼脂中没 有菌 落生长 , 提示该 浓度 能阻 断最 不敏 感的、 一 步突 变菌 株的 生 长 , 该浓度即定义为 M PC 。显然 , 当药物浓度在 M IC 和 M PC 之间时 , 耐药突 变菌 株才 被选 择性 富集 扩增。 于是 , M IC 和 M PC 之间的这个浓度范围被定义为 M SW ( 图 1) 。