生化前沿-生物质谱技术的发展与应用

两种软电离方式(离子化技术)
让生物大分子飞起来了！
(1).Electrospray Ionization (ESI) 电喷雾离子化
电喷雾质谱仪
John B. Fenn
(2). Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, 基质辅助激光解析/电离 (MALDI)
ຫໍສະໝຸດ Baidu
---------- 大分子能够飞起来了！
原创论文的发表-----诺贝尔奖的依据
1987年9月第二届中日质谱学研讨会，来自 著名的霍普金斯大学 (Johns Hopkins University) 的 Robert Cotter教授，将他的结果传真到欧 洲的质谱实验室 ； 大阪大学助理教授松尾竹清，及时提醒田中 务必要将研究成果尽快写成英语论文 ，使得 结果在 Rapid Communications in Mass Spectrome try上发表（1988年）
Wolfgang Paul 1989 Nobel Prize for Physics "for the development of the ion trap technique"
John Bennet Fenn 2002 Nobel Prize for Chemistry "for the development of soft desorption ionisation methods (ESI) for mass spectrometric analyses of biological macromolecules"
John B. Fenn
Koichi Tanaka
WüThRich
43 57 29 15 71 85 99 113 142 m/z
在质谱仪发明后相当长的时间里，质谱
技术只用于小分子物质的测定，为什么？
1、早期质谱的测定的质量范围有限；
2、电离方式太剧烈，不适合热不稳定、挥发 性差的生物大分子物质。 3、生物大分子在解吸附和离子化过程中难以 保持完整，形成的碎片太多且规律性不强……
岛津制作所是一家生产科学测试仪器的公司， 学物理、化学和生化等专业的人应该有闻其名，但 在日本该公司只能算一家不大有名的 中小企业。
东北大学是除东京大学、京都大学以外的一所 非常优秀的大学。田中毕业于东北大学工学部电气 工学专业，与化学、 生化等领域完全无缘。
生物类大分子的检测-------公认的超级难题
MALDI使用激光束和固 态基质，即用脉冲式激 光束作用于样品盘上的 基质和样品。
基质的作用: *吸收激光能量使基质和 样品一起汽化; *避免或减少样品的降解; *促进样品的离子化。
MALDI质谱仪
MALDI 基质
O OH OH HO
O
OH
O
OH MeO N OMe
OH
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) ( 2,5-二羟基苯甲酸)
进样系统
离子源
质量分析器
检测器
质谱仪需要在高真空下工作：离子源（10-3 10 -5 Pa ） 质量分析器（10 -6 Pa ）
生物质谱的两种软电离离子化原理
1 . 电喷雾离子化 ESI: ElectroSpray Ionization
2 . 基质辅助激光解吸离子化 MALDI: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
Other information can be inferred from a weight measurement.
Post-translational modifications Molecular interactions Shape Sequence Physical dimensions etc...

The Five Mass Spectrometry Nobel Prize Pioneers
Joseph John Thomson 1906 Nobel Prize for Physics "in recognition of the great merits of his theoretical and experimental investigations on the conduction of electricity by gases"
质谱图

由总离子色谱图可以得到任何一个组分的质谱图。 通常由色谱峰峰顶处得到相应质谱图。
在30min的总离子扫描图
915离子峰的MS/MS图谱
792离子峰的MS/MS图谱
ESI 特点
1.可生成高度带电的离子而不发生碎裂，通 过检测带电状态，可计算离子的真实分子 量。 2.多肽离子带有多个电荷，在较小的m/z范 围内可以检测大分子质量范围的分子 (100,000Da)。 3.由于采用液相方式进样，可与高效液相色 谱等方法联用分离多肽混合物。 4.nanospray技术降低样品用量（1ul/小 时），提高检测灵敏度。
OH
a-cyano-4hydroxycinnamic acid （CCA） (a-氰基-4-羟基肉桂酸)
3,5-dimethoxy-4hydroxycinnamic acid (sinapinic acid，SA)
( 芥子酸)
田中耕一其人----日本的阿甘

１９５９年出生，１９８３年获日本东北 大学学士学位，任职于京都市岛津制作所 (岛津国际贸易(上海)有限公司)，为该公司 研发工程师，分析测量事业部生命科学商 务中心、生命科学研究所主任。
The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules" "for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules"
第一节 生物质谱发展史
质谱（ Mass Spectrometry）是带电 原子、分子或分子碎片按质荷比（或 质量）的大小顺序排列的图谱。 质谱仪是一类能使物质粒子转化成离 子并通过适当的电场、磁场将它们按 空间位置、时间先后实现质荷比分离， 同时检测强度进行物质分析的仪器。

质谱技术发展历史

提出问题：生物高分子(分子量在10000Da以上)很难从 样品中被离子化而又不发生裂解地进入质谱分析所必 需的气相。 理论基础：“快速致热引发分子去吸附”的离子化方 法----成功关键在于能否在非常短的时间内让液相内大 分子达到高温。 解决方案：激光脉冲通常能在极短时间内产生极高的 能量，显然是一个非常诱人的选择，但难点就在于能 否找到一种吸收介质(matrix，基质)将光能高效转换为 热能再转移到包埋其内的大分子样品溶液中。 试验摸索：测定Vb (1315Da），试用超细金属粉末 (UFMP-Co)：将 UFMP与质谱仪要检测的有机样品混 合，使用激光照射使 UFMP在短时间内达到高温。

生物质谱技术
电喷雾质谱技术和基质辅助激光解吸附质谱 技术是诞生于80年代末期的两项软电离技术。 这两项技术的出现使传统的主要用于小分子 物质研究的质谱技术发生了革命性的变革。 特点： 高灵敏度: pmol甚至fmol的水平 高质量检测范围: 分子量几万到几十万 准确地分析生物大分子成为可能，使质 谱技术真正地走入了生命科学的研究领域， 并得到迅速的发展。
解析分子离子的同位素峰也可确定带电数和分子量
总离子色谱图

总离子强度：采集到 的每个质谱的所有离子 相加；

总离子强度随时间变 化的曲线就是总离子色 谱图,总离子色谱图的 横座标是出峰时间,纵 座标是峰高。

图中每个峰表示样品 的一个组份,由每个峰 可以得到相应化合物的 质谱图；峰面积和该组 份含量成正比,可用于 定量。


但德国学者由于早在1987年9月就收到了Cotter 教 授的传真，亲眼看到了田中等人成功检测100KD蛋白 多聚体的质谱，基于学术规范他们在论文的参考文 献里征引田中的会议摘要。
Franz Hillenkamp
生物质谱的组成

主要由真空系统、电学系统、分析系统组成。
包括:进样装置（真空系统） 离子化源(ESI、MALDI)，质量分析器(各种型号) 离子检测器，数据分析系统
质谱的开发历史要追溯到20世纪初J.J.Thomson 创制的抛物线质谱装置，1919年Aston制成了第 一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上 的里程碑。 最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原 子量，随着质谱技术不断发展改进，到20世纪 50年代后期，广泛地应用于无机化合物和有机 化合物的测定。 80年代后期，质谱技术在生命科学领域的应用， 更为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特 的生物质谱技术。
John Fenn
Koichi Tanaka
生物大分子分析技术 获得2002年诺贝尔化学奖

2002年诺贝尔化学奖由在质谱和核磁共振这两个重要领 域的科学家们分享。获奖者，质谱领域的John.B.Fenn和 KOICHI TANAKA，核磁共振领域的Kurt WüThRich，以 不同的方式对这些方法在生物大分子领域的进一步发展 作出了贡献。这意味着一个革命性的突破，使化学生物 学成为我们这个时代的“大科学”。
Koichi Tanaka 2002 Nobel Prize for Chemistry "for the development of soft desorption ionisation methods (MALDI) for mass spectrometric analyses of biological macromolecules"



一次错误导致一个伟大的成就
田中耕一在实验过程中成功使蛋白质离子化的过程
(1) 分散UFMP-Co时错误地使用了甘油（丙三醇）而不是丙酮作为基质；
(2) 因为Co很贵，如果扔掉了太浪费；怎么办？ 希望通过持续不断地用激光照射使甘油挥发，再加丙酮；
(3) 观察图谱,希望看到甘油的峰（92Da）消失，意外发现了1315Da峰。 （神奇：UFMP-甘油混合介质 能够检测大分子？？？） (4) 验证：UFMP-甘油混合介质用于检测更大的生物分子 通过优化实验参数 ： 34529道尔顿的羧肽酶 (Carboxypeptidase A) ----1985年 100872道尔顿的溶菌酶 (lysozyme)七聚体 -----1987年
生物质谱技术的发展与应用
陈 平
湖南师范大学
生命科学学院生物化学教研室
内
容
第一部分 生物质谱的发展及原理
第二部分 蛋白质组学鉴定技术方法学研究
第三部分 生物质谱在科学研究中的应用实例
第一部分 生物质谱的发展及原理
Mass Spectrometry:
A method to “weigh” molecules
Francis William Aston 1922 Nobel Prize for Chemistry "for his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a large number of nonradioactive elements, and for his enunciation of the whole-number rule"
1 . 电喷雾离子化 ESI: ElectroSpray Ionization

电喷雾电离是在液态下完成。 电喷雾电离利用位于一根毛细管和质谱仪 进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产 生以喷雾形式存在的带电液滴，当使用干燥气 或加热时，溶剂蒸发，液体体积缩小，最终生 成去溶剂化离子。
离子带多个电荷使得在较小的m/z范围内 能够检测大分子质量分子

科学家的科研道德

仅仅两个多月后，德国的两位教授Michael Karas和 Franz Hillenkamp就在<分析化学> 杂志上联名发表 了他们独立研制的用尼克酸(nicotinic acid)为介 质的新方法。
这种方法和田中的方法原理相似，但是经过时间的 检验，德国学者的方法实用性更强，经过他们后来 不断的改良与发展成为现代 MALDI质谱仪的基础。