基因工程与基因组学

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RH （Radiation Hybrid）方法
• 将人的细胞（染色体）用X-光照射打断染色体，
该细胞与鼠细胞融合，使DNA片段能插入到鼠 的染色体上，扩增的细胞株中的人DNA片段 (5-10Mb),得到克隆（也有STS出现），用作分 析。
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YAC（Yeast Artificial chromosome）方法
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ⅰ：STS
• STS路标：STS（Sequence Tagged Site）是物 理路标，如用激光切的染色体上DNA段。 当 人的染色体片段在鼠的细胞中，其标记是STS。 STS可以较粗（长），也可以更细（短）。
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例：人类基因组计划（HGP, human genome project）
• 1986.3.7 美国一个叫dulbecco在Science 上发表一篇文 章：“肿瘤研究的一个转折点：人类基因组的全序列 分析”。人有3×10 9 bp，工作是浩瀚的。 • 1990年，美国国立卫生院对“人类基因组计划”立项， 拨款30亿美元。 • 2000年，完成人的基因组草图，完成结构基因组学。 • 2005年，完成功能基因组学。
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中国的基因组工作室
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我国的工作人员正在测序
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HGP实验室（图）
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中国基因组人员在工作
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一、建立DNA（cDNA)文库
• 创造人的46个染色体的DNA文库，该DNA是 工作的材料。测序可能要做若干次重复，因此， 要有一定数量的DNA做原料，即，可克隆的 DNA片段（clonable Fragmant）。 • DNA文库有cDNA（complementary DNA）文 库和gDNA(genome DNA)文库两种。
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几个概念2
• 限制性内切核酸酶（restriction endonucleases) 和连接酶：DNA切开与连接； • 感染（infection)： 载体进入受体的一种方式； • 转化、转导等。 • 基因繁殖且表达。
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3. 基因工程的主要步骤：
• ①. 目的基因获得： • ⑴ 物理分离法；
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TAC 文库
TAC(Transformation-competent Artificial chromosome)叫可转化人工染色体。 载体是pYLTAC7(p1质粒和Ri质粒），可用于 植物。
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HAC文库
• HAC(Human Artificial chromosome)叫人类人 工染色体。
• 利用酵母染色体结构和复制系统（着丝点、端 粒、复制子）来复制人的DNA分子；可克隆 200～2000kb的DNA； • 特点：克隆片段大，可达Mb级别，用作自动 分析材料。
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pYAC
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BAC（Bacterial Artificial Chromosome ）：
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HGP的目标
• 1. Generate sets of full-length cDNA clones and sequences that represent human genes and model organisms. （分析出代表人类全部基因和模式生物的 全长cDNA克隆和序列）。 • 2. Support research on methods for studying functions of nonprotein-coding sequences（产生一 种方法用来研究非蛋白编码序列的功能）。 • 3. Develop technology for comprehensive analysis of gene expression（研究一些技术用来理解和分析基 因的表达）。
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1. 取材
• 选取的原始个体不同，DNA文库的基因序列， DNA序列肯定不同。白种人、黄种人、黑种人、 不同地区的人，选什么人，研究者有他们的想 法，可能是科学家，也可能是他们自己，更可 能是随机取样；
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2.文库的建立
• • • • • DNA文库技术 RH（Radiation Hybrid） YAC(yeast Artificial chromosome) BAC(Bacterial Artificial chromosome) PAC,cosmid,fosmid等.
• 把人的染色体片段嵌入细菌的质粒（F质粒） 中，可运载扩增100～300kb DNA。
• 特点：较小，便于普通测序。但自动测序时显 得小。
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PAC文库
• PAC(P1-derived Artificial chromosome）是P1 噬菌体为载体的DNA文库。可以看出，PAC肯 定较小，携带90-150kb 的DNA。Loannou将 PAC用于人基因组，构建了12万个插入片段， 长度为110-120kb，容量是人基因组的3倍。 • 120000×110×1000=1.32×1010/（3×109）） =4.4倍，保守即约为3倍。
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显微镜下人的染色体
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人的染色体组
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HGP与中国
• 1998年8月11日，中科院遗传所“人类基因 组中心”成立。 1999年2月，中心决定进行大规模基因组测 序，以创造加入“国际测序俱乐部”的条件。 同年7月7日，中国在国际人类基因组测序协作 组登记，申请加入“国际测序俱乐部”。 • 并承担了1%的染色体测序任务。
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测序的两种思路
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四、建立物理图谱和遗传图谱
• ① 染色体编号 • 先将各个染色体分离，编号：1 # ，1’ # ，2 # ， 2’#…… • 以染色体为单位甚至更小的单位用shut-gun方 法再进行测序。
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②路标技术
• 在不能切割成小片段进而编号时，一条染色体上要设 计几个标志，相当于编号，称路标技术（Landmark）， 这个路标是有顺序的，路标愈多，之间的距离愈近， 路标图谱愈精密。，目前的路标有： • i STS 标志 • ii EST 标志 • iii SNP标志 • iv RFLP 、 FLAP标志（酶切点标志） • V SSR标记
第九章 基因工程与基因组学
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第一节 基因工程
• 概念：利用DNA重组技术，把一个细胞中的基 因转移到另一个细胞中，并使该基因控制的性 状能够正确表达，这项技术称基因工程（gene engineering).
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细菌的接合：
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1.原理： 噬菌体转导
• • • • • • • U形（戴维斯）管实验： 1950年，Davis,B设计， A: trp- his+ B: trp+ his混合培养后，10-7细胞 得到100个trp+ his+ 。 没有接合，怎么而来？
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4. 基因工程的成就：
• • • • 1.三大支柱：干扰素、人的脑激素、胰岛素 2. 人的抗凝血因子转到羊身上； 3. 抗虫：Bt基因、胰蛋白酶基因、 4. 抗病：抗病毒基因
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5. 基因工程要做些什么？
• • • • • • • 1. 固N； 2. 大豆蛋白基因转到水稻中； 3. 动物蛋白基因转到植物中； 4. 疫苗抗原转到植物中； 5. 新的抗病虫基因转到新品种上； 6. 大象的生长基因转到猪身上； 7. 观赏新类型；等等
• • • • • ⑵化学合成法； ⑶酶切（鸟枪射击）法； ⑷ 逆转录法； ⑸ 噬菌体摄取法； ⑹基因组克隆法等
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②. 载体与DNA重组
• ⑴合适载体；质粒、噬菌体、转座子等 • ⑵限制性内切酶； • ⑶连接酶；
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重组1
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重组2
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4. Improve methods for genome-wide mutagenesis （研究一些技术用来研究整个基因组的突变产生）。 • 5. Develop technology for large-scale protein analyses. • 研究蛋白质大规模分析技术。
③内切酶
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④ 把重组DNA分子送入受体：
• • • • • ⑴转化： ⑵转导； ⑶基因枪 ⑷注射； ⑸其它一切介导方法。
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转化
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注射
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电激
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基因枪
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脂质体示意图
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脂质体
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基因组计划（genome project)：
• • • • • •
研究一个基因组的全部工作的规划： 1.测定全部DNA序列； 2.构建基因组的物理图谱； 3.构建基因组的遗传图谱； 4.构建基因组的转录图谱； 5.分析基因组的功能。
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目前实施的基因组计划：
微生物：大肠杆菌、噬菌体、酵母 植物：拟南芥、水稻； 动物：果蝇、猪、牛、鸡等； 人。
• CGCTCAGC • TGGTGATT • GTGT
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Sanger
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2.连续测序法 •
•
• • • • • 随机引物 二轮
一轮
测出的序列 作为二轮的引物
• • •
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三轮 测出的序列 作为三轮的引物
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三、测序---及连接方法的遴选
• 对文库中的各片段逐一测序，测序后的连接则是一个 巨大的任务（生物信息学）。目前有两种思路： • 1. 第一种是全基因组散弹法（whole genome shut-gun)： 即从文库中随机取，然后分析，分析后再根据碱基序 列进行拼接，由Celera提出。 • 步骤：取全基因组DNA —→ 纯化酶切或超声波打断— → 电泳—→ 回收DNA片段—→ 构建质粒文库 —→转 化宿主菌—→ 扩增培养—→ 提质粒DNA为模板进行 PCR测序—→ 上测序仪—→处理测序数据—→补缺— → 完整基因组序列。
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亮氨酸转导
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这就是天然基因工程（基因转 移）过程!
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2. 几个概念：
• 供体（donor)：品系甲，提供基因； • 受体（recepter)：品系乙，接受基因； • 目的基因（target gene)：被转移的基因，亮氨 酸； • 载体(vecter)：噬菌体，携带基因； DNA重组（recombination)：噬菌体插入大肠 杆菌的过程，目的基因与载体结合；
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第二节 基因组学
• 概念：研究生物体全基因组的分子结构和遗传 功能的学科称基因组学（genomics)。 • 结构基因组学（structural genomics)：以分析 测定基因组核苷酸序列为主要目的的基因组研 究； • 功能基因组学（functional genomics)：研究全 基因组的基因及其功能，又叫后基因组学 （post-genomics)。
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二、DNA序列测定原理
• 将DNA片段用荧光等分析仪，测出DNA序列 碱基排列顺序。 • DNA 序列测定方法： • 1.化学降解法：G反应；G+T反应；T+C反应 和C反应； • 2.Sanger的双脱氧法：A/T/G/C四个反应。 • 3.自动测序法
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1. Sanger 的测序方法
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⑴. shutgun法
全基因组DNA 随机酶切成小片段 拼接 补缺 完整基因组序列
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2. 层次散弹（hierarchical shutgun）
• 第二种是层次散弹（hierarchical shutgun）。即把 大的基因组先进行分层，如染色体编号、染色体下片 段编号、小片段上作物理标记，然后再对小片段测序， 这样使最后“拼接”变得容易得多。
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研究结果：
• 是一种温和型噬菌体（P22）携带的结果。 • 噬菌体：称可过滤因子。 • 概念：以噬菌体为媒介，把一个细菌的基因导 入另一细菌，这一过程称转导（transduction).
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烈性噬菌体：T2, T4
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温和型噬菌体：λ , P1, P22