第三章基因工程载体

（2）有选择性标记 Ampr、Tetr、Kanr等。
（3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。
（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。
（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性。 （7）具有较好的安全性，不能任意转移。
载体 的种类
基因工程中常用的载体有5类：
如pDF41、pDF42、pBR322。
外源DNA
抗生素抗性
无抗生素抗性
（5）正选择的质粒载体
Direct selection vectors
质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细 胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转 化菌细胞才能在选择培养基上生长。
可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而 减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。
胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力，如抗生
素抗性、对重金属离子的抗性、分泌细菌毒素等。
分子量在1-500kb之间广泛存在于细菌。
二、质粒（plasmid）的基本特征
1、自主复制性 ：质粒DNA携带复制起始区 （ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
质粒（plasmid）
单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
第一节
一、质粒（plasmid）
质粒载体
独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状 DNA分子（Covalently Closed Circular DNA, ccc
DNA）。并不是细胞生长所必需的，但可以赋予细
第三章 基因工程载体
vectors
1. 载体 （Vectors）
定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
MCS
复制起始点
ori
pUC
Ampr
遗传标记
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。
3.EB浓度达到饱和时，超螺旋质粒DNA分子密度
大于线形和开环的质粒DNA，从而分开。
CsCl密度梯度离心基本步骤
用含有EDTA的缓冲液悬浮菌
体
加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加入含EB的CsCl中超速离心 在紫外灯下吸取cccDNA
并稀释沉淀cccDNA
质粒DNA纯度高、周期长、
设备要求高、EB污染
pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19
（1）元件来源
a .ori来自pBR322质粒的复制起点 b. 标记基因（ampr）:pBR322的Ampr基因 c. lacz’基因：大肠杆菌lac操纵子DNA区段，编码 β-半乳糖苷酶-肽链，是LacZ氨基端的一个片段. 载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主 细胞。
长度4363bp，易于纯化，可以携带6-8Kb的外源 DNA片段。
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copies
④ 安全
失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通 过接合转移。
⑤具有较多的单一酶切位点（24种）
4. pUC系列
在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体。
只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体 不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子（1-3拷贝），如pSC101。
2、可转移性：在天然条件下，很多天然
质粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细
胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依
赖于质粒上的mob基因产物。
Conjugative
（2）克隆位点
具有MCS（多克隆位点）区段：位于lacZ’基因的 5’端。10个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏 该基 因功能。
菌落蓝白选择的原理：
IPTG：异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，乳糖
类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱 导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导 lacz’所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段 （α－肽）的合成。
不亲和群（incompatibility group)：
指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。
基因工程中，作为受体的细胞最好不含内源质粒。
4、携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往 往携带一个或多个遗传标记基因，这使寄主生
物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性：抗生素、重金属、毒性阴离子等 物质合成: 细菌毒素、有机碱
天然质粒，属严紧型低拷贝质粒。9.09 kb。 四环素抗性Tetr。
2.克隆位点
2. ColE1 天然质粒，属松弛型、高拷贝质粒，6.3Kb。
有氯霉素扩增效应，每个细胞1000-3000拷贝
选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基 因（immE1） colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌。
Amp
r
Tc
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入 有DNA插入
Amp
r
Tc r
转化
不含质粒载体
Amp r Tc r
无菌落
Amp Tc
r
外源DNA s
Amp r Tc s
筛选重组子 含有空质粒载体 阳性菌落
含有重组质粒载体
提取DNA 电泳
Amp＋Tetr
Amp Tc s
重 组 DNA
Amp
② 分子小，克隆能力大
plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。

结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
三、质粒载体的构建
1、 质粒构建基本策略
1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选 择转化体
2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组 3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量 4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
3.碱裂解法
第二节 噬菌体或病毒DNA
Bacteriophage(phage) 是比细菌还小得多的微生 物，噬菌体侵犯细菌，可以 认为它是细菌里的“寄生 虫”。 组成：蛋白质、核酸. 结构：蛋白质外壳、尾巴 尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
ColE1、pMB1、pMB9为松弛性质粒。 具有低分子量、高拷贝数的优点。 具有氯霉素扩增效应：每个细胞的拷贝数1000
－3000个！
用途：适合大量增殖克隆基因、或需要表达大
量的基因产物。
（2）低拷贝数的质粒载体
由pSC101派生来的载体。 特点是拷贝数低。pLG338、pLG339等
2.质粒构建原则
1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS 2、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、PCR
3、组装合适的选择标记基因 4、选择合适的启动子 5、提高外源DNA的容量 6、需要灭活出发质粒上的某些编码基因 7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单
3. 质粒载体的类型
（1）高拷贝数的质粒载体
松弛型复制质粒（relaxed plasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝，如Col E1质粒。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
外源DNA
Colicin E1
无Colicin
用对外源colicin E1的免疫性和自身不能 合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。
3. pBR322：
p:质粒； BR：质粒两位主要 构建者姓氏的第一个 字母； 322：实验编号
人工构建载体
pSF2124 pSC101
三个亲本质粒：
pMB1:出发质粒(ColE1) pSF2124: Ampr pMB1 pSC101: Tetr
3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。

基因工程一般只能利用非接接合型质粒，保证分 子操作过程中质粒在细胞中的稳定性。
3.质粒的不相容性(incompatibility,又称不亲和性)：
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的 不同质粒，不能在同一个寄主细胞系中稳定地共 存的现象。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被 逐渐地排斥（稀释）掉。
适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因 内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因 （如tetr、ampr、cmr等）失活。
（6） 表达型质粒载体
使克隆在特定位点的外源基因置于大肠杆 菌的转录-翻译信号控制下，并能在细胞中正 常转录并转译成相应蛋白质的载体。
含有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终
止子，以便外源基因在受体细胞内的高效表达。
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
大肠杆菌表达型质粒载体的结构
四、经典的大肠杆菌质粒载体 1. pSC101
Fra Baidu bibliotek
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1 失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但 仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使lacz’
失活，不能表达α-肽，破坏了互补作用，细胞内无 有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生 白色菌落。
PUC载体的优点：
a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数， 平均每个细胞可达500-700个拷贝 b 具有MCS片段，可把具有两种不同粘性 末端的外源DNA片段直接克隆到pUC类载 体上。 c 可以用组织化学方法检测重组体.
IPTG
蓝色菌落
5-溴-4氯-靛蓝
菌落蓝白斑选择的原理： 在基因克隆时，细菌在含有IPTG和x－gal的培养
基中进行培养。 IPTG诱导质粒的lacz’基因产生 α-肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片 段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使x －gal水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝 色。
x-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖
苷，为生色底物，半乳糖苷酶+ x-gal
蓝色
α-互补：pUC类载体带有lacz’基因，编码半乳糖
苷酶氨基端片段（α-肽），此片段与宿主细胞所编码 的羧基端半乳糖苷酶实现基因内互补，形成有功能 的半乳糖苷酶，称α-互补。 菌落蓝白选择的原理：
五、质粒的分离纯化P60
1.CsCl密度梯度离心法原理
原理 1.EB能够嵌入DNA的碱基对之间，不同构型DNA 分子结合EB的量不同，从而密度不同。
2.完整的超螺旋质粒没有自由末端,解链比较困 难，结合EB的量少，密度较大.线形的DNA和 开环的质粒DNA由于松弛，可以 结合较多的EB 分子，则密度小.
2、沸水浴法
（1） 加溶菌酶破细胞壁 （2）将菌体悬浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液 中，溶解细胞膜。 （3）放入沸水浴中煮40秒， 使蛋白质变性 。 （4）离心， 变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来， 质粒DNA仍留在上清液中。 （5）异丙醇沉淀，乙醇洗涤。 制备的质粒不纯，收率低，制备规模小，但快 速，特别适用小量提取质粒。