第三章基因工程载体

3个会导致Ampr基因失活
9个导致Tetr基因失活
氨苄青霉素和四环素抗性 24个单一克隆位点。
pBR322的优点
① 双抗生素抗性选择标记
抗生素抗性基因的插入失活效应是检测重 组体质粒的有效方法，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。 获得重组载体的寄主细胞 在Aplasmid ）:在整个细胞
周期中随时可以复制，每个细胞中有许多拷贝, 一般10-60 拷贝，如Col E1质粒。
氯霉素扩增：在抑制蛋白合成并阻断细菌染色体
复制的氯霉素存在时，松弛型质粒可继续扩增， 其拷贝数可达2000-3000个，称氯霉素扩增效应
严紧型复制质粒 （stringent plasmid ）：
plasmid 接合型质粒（自我转移的 质粒）：质粒可从一个细胞自发转移到另一个细胞。
Non
Conjugative plasmid 非接合型质粒
（不能自我转移的质粒）：由于失去控制细菌配 对和自我转移的基因，质粒不能从一个细胞自发 的转移到另一个细胞。

结合型质粒：相对分子质量大、拷贝数小、 严紧型复制 非结合型质粒：相对分子质量小、拷贝数多、松弛型复制
① colicin E1基因的结构 cea imm 免疫基因 kil 溶菌基因
结构基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物 ③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
克隆位点
EcoR I
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA导致E1 失活，使受体菌不能合成E（ColE1-），但 仍表现出对E1免疫型（ImmE1+）。
外源DNA
Colicin E1
无Colicin
用对外源colicin E1的免疫性和自身不能 合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。
3. pBR322：
p:质粒； BR：质粒两位主要 构建者姓氏的第一个 字母； 322：实验编号
人工构建载体
pSF2124 pSC101
三个亲本质粒：
pMB1:出发质粒(ColE1) pSF2124: Ampr pMB1 pSC101: Tetr
如pDF41、pDF42、pBR322。
外源DNA
抗生素抗性
无抗生素抗性
（5）正选择的质粒载体
Direct selection vectors
质粒载体具有直接选择记号并赋予寄主细 胞相应的表型。只有带有选择标记基因的转 化菌细胞才能在选择培养基上生长。
可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而 减轻实验的工作量，提高了选择的敏感性。
IPTG
蓝色菌落
5-溴-4氯-靛蓝
菌落蓝白斑选择的原理： 在基因克隆时，细菌在含有IPTG和x－gal的培养
基中进行培养。 IPTG诱导质粒的lacz’基因产生 α-肽，同时诱导细菌产生半乳糖苷酶的羧基端片 段。两种片段形成有功能的半乳糖苷酶，从而使x －gal水解，产生蓝色物质，使非重组菌落呈现蓝 色。
（2）有选择性标记 Ampr、Tetr、Kanr等。
（3）多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。
（4）分子量小，可容纳较大的外源基因片段。
（5）拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。 （6）具有对受体细胞的可转移性。 （7）具有较好的安全性，不能任意转移。
载体 的种类
基因工程中常用的载体有5类：
3.碱裂解法
第二节 噬菌体或病毒DNA
Bacteriophage(phage) 是比细菌还小得多的微生 物，噬菌体侵犯细菌，可以 认为它是细菌里的“寄生 虫”。 组成：蛋白质、核酸. 结构：蛋白质外壳、尾巴 尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
2、沸水浴法
（1） 加溶菌酶破细胞壁 （2）将菌体悬浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液 中，溶解细胞膜。 （3）放入沸水浴中煮40秒， 使蛋白质变性 。 （4）离心， 变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来， 质粒DNA仍留在上清液中。 （5）异丙醇沉淀，乙醇洗涤。 制备的质粒不纯，收率低，制备规模小，但快 速，特别适用小量提取质粒。
只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体 不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子（1-3拷贝），如pSC101。
2、可转移性：在天然条件下，很多天然
质粒都可通过细菌接合作用从一种宿主细
胞内转移到另外一种宿主内，这种转移依
赖于质粒上的mob基因产物。
Conjugative
第三章 基因工程载体
vectors
1. 载体 （Vectors）
定义：在基因工程操作中，把能携带外
源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
多克隆位点(multiple cloning site)
MCS
复制起始点
ori
pUC
Ampr
遗传标记
2. 基因工程对载体的要求
（1）在宿主细胞内能独立复制，ori。
Amp
r
Tc
1)限制酶切 2)DNA重组 无DNA插入 有DNA插入
Amp
r
Tc r
转化
不含质粒载体
Amp r Tc r
无菌落
Amp Tc
r
外源DNA s
Amp r Tc s
筛选重组子 含有空质粒载体 阳性菌落
含有重组质粒载体
提取DNA 电泳
Amp＋Tetr
Amp Tc s
重 组 DNA
Amp
② 分子小，克隆能力大
不亲和群（incompatibility group)：
指具有亲缘关系，但彼此之间是互不相容的质粒。
基因工程中，作为受体的细胞最好不含内源质粒。
4、携带特殊的遗传标记：野生型的质粒DNA上往 往携带一个或多个遗传标记基因，这使寄主生
物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性：抗生素、重金属、毒性阴离子等 物质合成: 细菌毒素、有机碱
五、质粒的分离纯化P60
1.CsCl密度梯度离心法原理
原理 1.EB能够嵌入DNA的碱基对之间，不同构型DNA 分子结合EB的量不同，从而密度不同。
2.完整的超螺旋质粒没有自由末端,解链比较困 难，结合EB的量少，密度较大.线形的DNA和 开环的质粒DNA由于松弛，可以 结合较多的EB 分子，则密度小.
2.质粒构建原则
1、选择合适的出发质粒: Ori、选择标记、MCS 2、正确获得构建质粒载体的元件：酶切、PCR
3、组装合适的选择标记基因 4、选择合适的启动子 5、提高外源DNA的容量 6、需要灭活出发质粒上的某些编码基因 7、达到预期目的前提下，构建过程应力求简单
3. 质粒载体的类型
（1）高拷贝数的质粒载体
适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的基因。
减少蛋白质产物对寄主细胞的毒害。
（3）失控的质粒载体
一些低拷贝基因是温度敏感型，如pBEU1、pBEU2 温度低（<37 oC），拷贝数很少； 温度增加（>40 oC），拷贝数很快增加到>1000个。
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因 内部。外源DNA片段插入会导致选择记号基因 （如tetr、ampr、cmr等）失活。
胞某些抵御外界环境因素不利影响的能力，如抗生
素抗性、对重金属离子的抗性、分泌细菌毒素等。
分子量在1-500kb之间广泛存在于细菌。
二、质粒（plasmid）的基本特征
1、自主复制性 ：质粒DNA携带复制起始区 （ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此 能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。
当外源基因插到质粒的多克隆位点后，使lacz’
失活，不能表达α-肽，破坏了互补作用，细胞内无 有活性半乳糖苷酶，使带有重组质粒的细菌将产生 白色菌落。
PUC载体的优点：
a 具有更小的相对分子质量和更高的拷贝数， 平均每个细胞可达500-700个拷贝 b 具有MCS片段，可把具有两种不同粘性 末端的外源DNA片段直接克隆到pUC类载 体上。 c 可以用组织化学方法检测重组体.
（2）克隆位点
具有MCS（多克隆位点）区段：位于lacZ’基因的 5’端。10个连续的单一限制酶切位点，但它不破坏 该基 因功能。
菌落蓝白选择的原理：
IPTG：异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，乳糖
类似物，又称为安慰诱导物，可代替乳糖诱 导乳糖操纵子结构基因的表达，即可诱导 lacz’所编码的半乳糖苷酶氨基末端片段 （α－肽）的合成。
（6） 表达型质粒载体
使克隆在特定位点的外源基因置于大肠杆 菌的转录-翻译信号控制下，并能在细胞中正 常转录并转译成相应蛋白质的载体。
含有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终
止子，以便外源基因在受体细胞内的高效表达。
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
大肠杆菌表达型质粒载体的结构
四、经典的大肠杆菌质粒载体 1. pSC101
Amp 、Cm、 Kan、 Tet、Sm
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
显性质粒dominant plasmid、 隐蔽质粒concealed palsmid
三、质粒载体的构建
1、 质粒构建基本策略
1.加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于选 择转化体
2.增加或减少合适的酶切位点，便于重组 3.缩短长度，提高导入效率，增加装载量 4.改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 5.根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件
pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19
（1）元件来源
a .ori来自pBR322质粒的复制起点 b. 标记基因（ampr）:pBR322的Ampr基因 c. lacz’基因：大肠杆菌lac操纵子DNA区段，编码 β-半乳糖苷酶-肽链，是LacZ氨基端的一个片段. 载体用于可编码半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主 细胞。