(完整word版)重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定
重组质粒的转化及阳性克隆的筛选
(二)阳性克隆的鉴定与筛选
将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后, 在连接产物中既有载体和目的基因的连接,也有载体 的自连和目的基因的自连,更多的是未发生连接反应 的载体和目的DNA片断.这就需要我们对阳性克隆进 行鉴定和筛选,将含有外源DNA的宿主细胞和不含外 源DNA的宿主细胞分开,将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开.
阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA, RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行.可以 利用载体本身的一些特性,如抗生素抗性基因, 包装容量等对重组子筛选.可以直接分析重组 子中的质粒DNA,分析其插入片段的有无,大 小和酶切图谱,也可直接通过测序分析重组子 中的插入片断.有时可以通过间接分析和目的 基因相连的基因或蛋白的表达来检测目的基因 的表达,比如将目的基因和报告基因同时整合 到宿主中,如果报告基因表达,则说明目的基 因也可能正确表达.
四,操作步骤
(一)重组质粒的转化 1,从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其 解冻,解冻后立即置冰上. 2, 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超 过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3,42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速 置于冰上冷却3-5分钟. 4,向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后 37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5,将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平 板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
五,注意事项
1,麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素 时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带 插入片段的重组质粒转化子为白色菌落.该产品筛选 效果同蓝白斑筛选,且价格低廉.但需及时挑取白色 菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色, 影响挑选. 2,X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代 半乳糖苷为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表 达. 3,在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体 DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质 粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱 3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显.
实验17-重组体筛选与鉴定
一 载体表型选择法
一、抗药性标记及其插入失活选择法
1. 原理：
pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。
（1）四环素： 抑制细菌生长，但不杀死细菌。
（2）氨苄青霉素抗性基因： 产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为 青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KIAampicillin）（蓝灰色）褪色。
四 核酸杂交检测法
一、原理：
1. 核酸杂交
重组克隆与探针杂交。
2. 检测用的探针
与外源DNA插入片断互补的序列。
3. 识别标记
（1）放射性同位素 32P 或 125I 。
（2）非放射性标记 荧光素
二、核酸杂交检测方法
1. Southern blotting
用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 从宿主细胞中提取DNA（或质粒 载体），再用探针杂交。
一、直接电泳检测法
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。
或用合适的内切酶切下插入片断，再用 其它酶切这个片断，电泳后比较结果是 否符合预计的结果。
重组体筛选与鉴定
重组质粒的转化
转化（transformation)：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研 究领域的基本实验技术。
转化方法
1、化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl） 制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA 分子导入受体细胞；
质粒转化步骤
质粒转化步骤引言质粒转化是分子生物学实验中常用的一项技术，用于将目标基因导入到宿主细胞中，实现外源基因的表达。
质粒转化步骤通常包括质粒构建、细胞准备、转化和筛选等环节。
本文将详细介绍质粒转化的步骤和操作注意事项。
质粒构建质粒构建是质粒转化的第一步，主要是将目标基因插入到质粒载体上，构建成适合转化的质粒。
下面是质粒构建的基本步骤：1.购买或从他人提供质粒载体：质粒载体通常是一种环状DNA分子，能够自我复制并带有一些重要的功能元件，例如起始子、选择性标记和载体复制起始位点等。
2.选取适当的限制性内切酶：根据质粒载体上的限制性内切酶位点和目标基因序列的限制性内切酶位点，选取适当的限制性内切酶。
限制性内切酶可以切割DNA分子，得到具有互补末端的DNA片段。
3.定位和切割目标基因：使用选取的限制性内切酶切割目标基因的DNA序列，生成具有互补末端的DNA片段。
4.切割质粒载体：使用相同的限制性内切酶切割质粒载体的DNA序列，生成具有互补末端的质粒片段。
5.连接目标基因和质粒载体：将切割好的目标基因和质粒片段进行连接，形成新的质粒。
6.进行质粒转化前的验证：将构建好的质粒产物进行测序验证，确保构建的质粒没有错位和错配等问题。
细胞准备质粒转化的第二个步骤是准备宿主细胞，为质粒的转化和筛选做好准备。
常用的宿主细胞有大肠杆菌（E. coli）和酵母菌等。
细胞准备的步骤如下：1.培养条件的准备：准备适当的培养基和培养条件，确保宿主细胞的正常生长。
2.复苗制备：从冻存的宿主细胞中提取适量的细胞进行复苗培养，以恢复其生长活性。
3.培养宿主细胞：将复苗培养物接种到含有适当抗生素的培养基中，经过一定时间的培养，使细胞进入指数生长期。
4.细胞处理：在指数生长期，将培养物离心，去除上清液，获得宿主细胞的沉淀。
5.细胞复苏：将宿主细胞沉淀重新悬浮于含有适当培养基的液体中，并在适当的条件下进行复苏培养。
转化和筛选质粒转化的第三个步骤是将质粒导入到宿主细胞中，并通过适当的筛选方法选出含有目标基因的转化子。
(完整word版)重组质粒实验报告
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。
学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
(完整word版)质粒的转化(热激法)
实验四质粒的转化质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。
可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。
实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。
实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。
同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
热激法转化实验步骤：1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；2．取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3．每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；4．热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；6．复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；7．布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；8．培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程
重组质粒构建流程
1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增)
2.回收
回收（碱裂解法提取质粒DNA)
6．重组质粒克隆的鉴定
1）通过PCR方法鉴定：以重组质粒为模板，PCR产物的特异性引物或载体的通用引物进行PCR扩增后电泳鉴定。
2）酶切鉴定：双酶切鉴定时只要出现质粒条带和你的插入片段的目的条带就行了
7. 质粒DNA的含量及纯度鉴定
8.浓度测定仪及琼脂糖凝胶检测
实验8 重组质粒的转化及筛选
实验八、重组质粒的转化及筛选转化（transformation）：是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
热激转化将大肠杆菌感受态细胞与待转化的DNA样品小心混合均匀，置于冰上约10min，使DNA充分粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA样品。
将已转化处理的细胞置于无选择压力的培养基中保温一段时间，然后涂布于有选择压力的平板培养基上，获得重组子。
实验材料DNA材料：连接产物、质粒pQE30-EGFP；感受态细胞：大肠杆菌DH5α；培养基：LB抗生素：AMP（氨苄青霉素），在培养基冷却到60℃以下添加，添加量为1/1000。
已灭菌的EP管操作步骤1.从冰箱取出的感受态细胞放置冰上融化，分别取100µl转移到2支已灭菌的1.5ml离心管中，分别加入质粒1µl、连接产物10µl，温和混匀，冰上放置5~10min；2.热激处理：将EP管置于42℃恒温水浴锅中，保温90秒，不要摇动，然后迅速转移到碎冰块中，冷却1~2分钟。
3.往EP管中加入500µl新鲜LB培养液（37℃预热），37℃，培养30min~60min（注：转纯质粒可省略，转连接产物需进行）。
4.取100~150µL细胞（可离心，重悬）涂布于含有抗生素的LB平板上，室温放置3~5分钟。
5.37℃培养12~16h（过夜）；然后把培养箱温度调至30℃培养3~4h，观看EGFP基因表达情况。
转化实验流程感受态细菌100µl 质粒1 µl冰浴中10′混匀420C水浴90′冰浴1-2 ′ 加入500 l LB370C培养30′涂板培养过夜勿动热激＋用CaCl法制备的感受态细胞，可使每微克超2螺旋质粒DNA产生5 106-2 107个转化菌落。
在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定
转化及转化子的鉴定11243224 周雨一、感受态细胞的制备1、材料：E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制,eppendorf 管。
2、设备：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
3、试剂：LB固体和液体培养基，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，麦康凯培养基(Maconkey Agar)，0.05mol/L CaCl2溶液，含15%甘油的0.05mol/L CaCl2。
4、受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
5、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
二、转化1、DNA和感受态细胞都置于37度恒温水浴锅中激活，然后将DNA转移到感受态细胞悬液中，反复吹打，使其均匀接触（由于细菌可以从环境中直接吸收DNA）；2、运用热胀冷缩的原理，将混悬液放在冰水浴中半个小时到40分钟（最短时间），使得DNA 与细胞表面受体结合；3、轻轻的将混悬液置于37到45度的水浴锅45秒；4、平稳快速的转入冰水浴中2分钟；5、取出，加入900ul 的37℃预热的LB培养基，混匀；6、放入37度的培养箱1小时，让菌苏醒，恢复生长；7、取适当离心（3000至4000r/min，1min，弃部分上清液200微升）的管中细胞均匀地接种在选择培养基（LB培养基+某种抗生素）；8、提前一天进行抗生素平板，培养基灭菌，之后，加入抗生素（青霉素），分布均匀，冷却至60度以下，适当摇瓶，摇着冷却，混匀后，涂平板，冷却凝固，再放入冰箱充分凝固，再在37度培养箱1 小时，烘干水，离心，3000-4000 r/min 1 min ，去上清；9、挑选部分的菌落，至少5个（随机）单菌落，进行扩大培养，以便于鉴定；10、将菌作为PCR模板进行扩增（菌落PCR)；11、进行菌种保藏，在液体培养基上；12、再将菌种送到公司测序，如果是碱基突变、引起氨基酸变化等，就需要重新开始做。
重组质粒的构建转化筛选和鉴定 (2)
DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定摘要本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。
所用的酶有Hin d Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。
由于Hin d Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。
关键字酶切连接转化重组子琼脂糖凝胶电泳引言重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
本实验的供体是λDNA，受体是E.coli DH5α,载体是PUC19。
DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。
这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。
目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类，分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类：Ⅰ类酶的识别部位和切点不同，切断部位不定；Ⅲ类酶的识别部位和切点不同，但切断特定部位；Ⅱ类酶切断识别部位或其附近的特定部位，酶切后的双链DNA的末端是粘性末端，某些限制酶产生平末端。
因此，应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是Ⅱ类酶。
酶切又分为单酶切和双酶切，单酶切就是只用一个限制性内切酶去切质粒,使环状的质粒被切割为一条或多条线状DNA,单酶切操作简单，但是后期筛选工作复杂；双酶切用两个限制性内切酶,质粒上就产生了两个缺口,环状质粒变成两段线状DNA了片段，双酶切前期酶切操作复杂，但是重组效率高。
本实验所选用的限制酶是Hin d Ⅲ，选用方法是单酶切法。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
质粒的构建、转化、筛选和鉴定
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl感受态细胞的方法。
25.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
重组质粒的连接、转化及筛选
重组质粒的连接、转化及筛选概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。
如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。
但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。
通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。
也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。
带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
实验17-重组体筛选与鉴定
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程 检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。
2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇 培养至OD600值达到0.5-0.6之间
3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟
4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30 分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷 CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬
试剂：
1.LB固体和液体培养基。
2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。
4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。
5. 待转化质粒。
分子生物学重组质粒的制备
实验一感受态细胞的制备一、实验材料大肠杆菌DH5a 、LB培养基、0.1M CaCl2,50ml大Ep管，冰，80%甘油。
二、操作步骤氯化钙法1.将单个菌落或液体菌种（1:50）接种于20mL LB培养液的试管中，37℃振荡（200r/min）培养过夜。
2.取过夜2ml菌体加入100mLLB培养液37℃振荡培养至光密度（OD600）值在0.4-0.5之间。
（约需1h-2h）.3.预冷0.1M CaCl2，和2个50ml大Ep管。
4.将细菌培养物分别倒入预先冰浴的无菌50mL大Ep管中，冰浴30min.5.于4℃下离心10min,（4000r/min）,弃去上清夜，放于冰浴中。
6.加10mL冰冷的0.1mol/L MgCl2溶液混匀，冰浴30min。
7.4℃下离心10min,（4000r/min）,弃去上清夜（吸尽），放于冰浴中。
8.加入2ml 0.1 mol/L CaCl2轻混。
9.分装于1.5ml离心管中，(每支200uL)，－80℃储存备用。
1)转化用：200ul/Ep2）保存：180ul+20ul甘油（80%）注意：1.为了获得高感受态细胞，应选用处于生长对数期的细胞，OD600值不应高于0.6，并且在整个试验过程中均需将细胞置于冰上。
2.细胞在冰冻后即获得了感受性，在－80℃几小时后感受性达到最高值，几个月不会改变。
实验二质粒DNA的小量提取一、试剂及溶液LB培养基、葡萄糖（1）用于碱法提取质粒DNA的溶液a.溶液Ⅰ（GET）缓冲液(50ml)：葡萄糖0.49g，0.5M的EDTA(pH8.0)1ml，1M的Tris-HCl(pH8.0)1.25ml。
b. 溶液Ⅱ（变性液）：(现用现配)c. （50ml）]：60mL的5M的KAc，11.5mL冰醋酸，28.5mL H2O. PH4.8。
(2)缓冲液TBE缓冲液(10Χ)：称取Tris 108g，硼酸55g，5M EDTA（Ph8.0）40ml，用H2O定容到1000mL。
5重组表达质粒的构建——重组质粒的筛选鉴定
重组表达质粒的构建——重组质粒的筛选鉴定
外源片段插入质粒载体之后,必须经过筛选鉴定才能确认外源基因插入是否与当初设计的方案一致。
常用的筛选方法有蓝白斑筛选、酶切、PCR鉴定等,最终通过测序确认；表达载体的构建，必须保证插入序列完全正确（不能有碱基丢失、多余、突变）。
1）酶切鉴定
根据事先构建方案的设计信息，选取两个特定位点对重组质粒进行酶切，如果切断序列电泳条带谱与预期一致，说明构建成功。
制定酶切方案一定要充分考虑所选酶切位点位置/个数以及切断后所产生片段的情况，不同片段大小是否可以通过电泳分开；如果选用不确定插入方向的克隆策略，通过载体酶切位点和插入序列内部酶切位点结合使用，双酶切结果分析确定核酸序列是否插入以及插入方向。
2）PCR鉴定
PCR鉴定是用特异性引物扩增含目的片段的基因，比较合理的设计方案是：选取载体上的一个引物和插入序列的一个引物（下图B），扩增出的片段大小应该是载体引物到结合位点的长度加上外源片段，很多人喜欢直接用外源片段上的两个引物扩增(下图C)，这种方法会有很多的假阳性，因为在连接转化过程中可能会有很多的外源片段残留在待测样品中；也有研究者选用载体上跨插入位点的两个引物(下图A)，这种方法对于定向克隆是完全可以的。
基因重组克隆到载体质粒上之后，必须测序验证序列正确性，酶切鉴定和PCR鉴定只能判断片段是否插入，不能确认是否有碱基突变、碱基丢失或是碱基增加。
实验报告构建重组质粒(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。
2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。
通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。
三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。
（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。
2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。
（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。
3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。
5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。
（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。
2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。
3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。
表达质粒重组和转化的主要技术流程
表达质粒重组和转化的主要技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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实验17-重组体筛选与鉴定
无环丝氨酸培养基
（2源DNA，导致氨苄 青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素 指示液选择。
二 根据插入基因的表型选择
利用插入的外源基因的表达产物特性进行直 接选择。（只在特定条件下）。
一、原理：
1.弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受 体菌株的突变型缺陷。
五 免疫化学检测法
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受 态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下 进行。
克隆的筛选与鉴定
在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复 性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNADNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环 形结构。
缺点：需要电镜！
2. Northern blotting
用DNA（或RNA） 探针检测RNA样 品。
主要检测插入片 断是否被转录。
从宿主细胞中提 取RNA，再用探 针杂交。
试剂：
1.LB固体和液体培养基。
2.含特定抗生素的LB固体培养基。
3.100mM CaCl2溶液。
4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。
实验六DNA的连接重组质粒转化筛选
2．pBS重组质粒的筛选原理
由-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）的存在下被 IPTG（异丙基硫代--D-半乳糖苷）诱导形成兰色菌落。 当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码 框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去-互补 能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导 培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上，-互补产生的Lac+细菌由于含半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸， 使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后， 失去-互补能力，因而不产生-半乳糖苷酶，无法分解培 养基中的乳糖，菌落呈白色。因此可将重组质粒与自身环 化的载体DNA分开。此为-互补现象筛选。
2、 细胞转化
A. 将-70℃下保存的感受态细胞（200l），室温下解冻后放 置于冰上。 B. 将pBS质粒DNA溶液（不超过50ng），体积不超过10l， 轻轻摇匀，冰上放置30min 。 C. 42 ℃水浴中热击90秒或37℃水浴中5min, 热击后迅速置于 冰上冷却3-5min. D. 向管中加入1 ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37 ℃ 下震荡培养1小时使细胞恢复正常生长状态，并表达质粒 编码的抗生素抗性基因（Ampr）. E. 取上述菌液100l涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上 放置半小时，等菌液完全干后倒置平皿37℃下培养16-24 小时，出现明显而未相互重叠的单菌落。 F. 培养后，将平皿于４℃下放置数小时，使显色完全。 G. 对照 1：以蒸馏水代替pBS质粒DNA，其它同上。 H. 对照 2：以蒸馏水代替pBS质粒DNA，在步骤E 中，取5l 涂 I. 布于不含Amp的筛选平：
转化子总数 =菌落数X稀释倍数X转化反应总体积/涂 布体积 转化频率= 转化子总数/质粒DNA量 感受态细胞总数=对照2菌落数X稀释倍数X菌液总体 积/涂板菌液体积 感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数
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重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。
5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。
（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。
另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。
可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。
）连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切酶和DNA连接酶催化完成的。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。
连接反应时，载体DNA和外源DNA 的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。
反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，用常用的连接时间为12-16h。
2.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。
能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。
人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。
能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。
经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。
在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。
进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。
将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。
本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。
3.重组子的筛选鉴定重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。
并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。
再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。
因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。
本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。
质粒PUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。
没有导入质粒PUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。
质粒PUC19进入E.coli DH 5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。
在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。
不含质粒的E.coli DH 5α，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PUC19乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。
因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA 提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。
也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物，进行那个PCR扩增，检测个噢偶见的质粒是否是所期望的重组质粒。
4.PCR技术PCR（Polymerase chain reaction）即聚合酶链式反应，其原理类似于DNA的体内复制，又叫做“体外基因扩增”。
反应体系包括：模板DNA、寡核苷酸引物、Mg2+，4种脱氧核糖核酸（dNTP）、DNA聚合酶和合适的缓冲体系。
反应基本程序包括DNA变性、引物复性及引物延伸三个基本过程。
这三个反应构成一个循环，反复进行。
每一轮循环扩增的产物可作为下一轮扩增反应的模板。
理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍，反复30次，特异DNA序列片段以指数方式可扩增105~106。
通过此技术可以使非常微量的DNA产生大量的PCR产物，因此这个技术是一项在体外大量生产目的基因的技术。
现在普遍通用的是一种从水生嗜热杆菌中提取的Taq DNA聚合酶，而且大大提高了扩增片段的特异性、灵敏性和扩增效率。
反应中用的引物有两段，一条称为上游引物或者正向引物，一条称为下游引物或者反向引物。
引物的设计十分重要，在设计时应遵循以下原则：长度一般为18到24个碱基；G+C的百分含量在40%~60%；单条引物内部避免含有二级结构，避免形成引物二聚体；最好以1到2个G或C碱基开始或结束；引物的5’端可以被修饰，但是3’端绝对不能进行任何修饰，而且引物的3’端要避开密码子的第三位。
模板的浓度不能太大，dNTP的浓度为2.5mmol/L，金属离子的浓度为1.5mmol/L，缓冲液为pH为7.2~8.0的Tris—HCl溶液。
实验材料：1.菌株：E.coli DH 5α2.培养基： LB培养基、麦康凯培养基（加入氨苄青霉素）3.试剂材料：酶切反应：（DNA PUC19 质粒，酶切10×buffer，Hind Ⅲ,重蒸水，λ DNA。
）连接反应：（酶切后的DNA PUC19 质粒和λ DNA，连接10×buffer，T4 连接酶，重蒸水。
）感受态细胞的制备：（0.1M CaCl2 ）转化：（连接液和感受态细胞，0.1M CaCl2，冰块。
）重组菌的挑选、检验：试剂盒（含有Rnase A的溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，HB buffer,DNA washing buffer，elution buffer）,酶切后的DNA PUC19 质粒，试剂盒抽提的DNA，酶切10×buffer，Hind Ⅲ,重蒸水，琼脂糖，TAE缓冲液。
上样缓冲液，EB 染液。
PCR检测： 10×PCR buffer,dNTP,模板，引物1，引物2，水，Taq DNA聚合酶，琼脂糖，TAE、溴化乙锭（EB）4. 仪器器材：20、200、1000ul 的枪和枪尖，1.5 ml的Ep管，恒温培养箱，水浴锅，平板，三角瓶，试管，接种环，牙签，酒精灯，火柴，冰箱，离心机，电泳槽，紫外仪，PCR扩增仪试验流程载体与外源片段的酶切→连接→感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与电泳检测→PCR检测注意事项：1.本实验属于微量操作，用量极少的步骤必须严格注意吸取量的准确性并确保样品全部加入反应体系中。
2.实验中所用塑料器材都必须是新的，并且经过高温灭菌，操作时打开使用，操作过程中要注意环境干净，戴手套操作，尽量减少走动，缩短Ep管开盖的时间。
3.不论是酶切还是连接反应，加样的顺序应该是，先加重蒸水，其次是缓冲液和DNA，最后加酶。
且前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在加入前从-20℃的冰箱取出，酶管放置冰上，取酶液时吸头应从表面吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液。
取出的酶液应立即加入反应混合液的液面以下，并充分混匀。
4.Ep管的盖子应盖紧，防止水浴过程中水汽进入管内，并做好标记以防样品混淆。
5.转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染，整个操作过程应在无菌条件下进行。
6.电泳时使用的缓冲液最好是现配现用，以免影响电泳效果。
7.制备凝胶时，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。