第五章酶分子修饰
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酶工程 第五章
第—节 金属离子置换修饰
用于酶分子修饰的金属离子，往往是二价金属离子。例如 Ca 2 , Mg 2 , Mn2 , Zn2 , Co 2 , Cu 2 , Fe2 等等。金属离子置换修饰法只适用于本来 在结构中含有金属离子的酶。 在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸 (EDTA)等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯 合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分于筛层析等方法， 可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到 酶液中，酶蛋白与金属离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换 后的酶将会出现不同的特性。有些修饰酶活性比原来酶的活性降低， 甚至完全无活性；有些修饰酶的活性比原酶活性提高；有些修饰酶的 稳定性比原酶增加等。所以只要选择到适宜的金属离子作修饰剂，去 置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。
第二节
大分子结合修饰
一、通过修饰提高酶活力
酶的催化能力受诸多因素的影响。本质上是由其特定 的空间结构，特别是由其活性中心的特定构象所决定的。 水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可使酶的 空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物 结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。 例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可 使该酶的活力提高到原有的活力的2.25倍；用右旋糖酐修 饰胰凝乳蛋白酶，当每分子酶与11分子右旋糖酐结合时， 修饰酶的活力达到原有的活力的5.1倍；每分子胰蛋白酶 用11分子的右旋糖肝修饰后，酶活力可提高30％等。
第二节 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某 些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分 子结合修饰法。简称为大分子结合法。 通常使用的水溶性大分子修饰剂有：有旋糖酐、聚乙 二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。这些大 分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分 子以共价键结合。对酶分子进行修饰。例如：右旋糖酐先 经高碘酸(HIO4)活化，然后与酶分于的氨基共价结合。
酶分子修饰
Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe2+等。金属离子置
换修饰只适用于本来在结构中含金属离子的酶。
6
一、金属离子置换修饰的方法
1、酶的分离纯化：将需修饰的酶进行分离纯化，获
得具有一定纯度的酶液。
2、除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定
量的金属螯合剂，与酶分子中的金属离子形成螯合物，
乙醛等进行分子内交联修饰；还可以利用水溶性大分子
与酶的侧链基团共价结合进行大分子结合修饰。
22
2）核酸类酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基
上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶
碱基上的氨基和羟基。
通过侧连基团的修饰，提高R酶的稳定性，扩展其催
化功能，提高酶的催化效率。
23
一、氨基修饰
第五章 酶分子修饰
定义：通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，
从而改变酶的某些特性和功能的过程。
天然酶在应用中的限制因素：
1）酶的活性、作用专一性和作用最适条件常不能
适应生产工艺的要求；
2）酶是蛋白质，容易变性失效，一般经不起高温、
强酸、强碱、有机溶剂以及时间等的考验；
3）注入人体内，作为异体蛋白，有难于吸收、易
17
❖
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无
毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活
化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6
min
1
右旋糖酐-SOD
7
h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
换修饰只适用于本来在结构中含金属离子的酶。
6
一、金属离子置换修饰的方法
1、酶的分离纯化：将需修饰的酶进行分离纯化，获
得具有一定纯度的酶液。
2、除去原有的金属离子：在纯化的酶液中加入一定
量的金属螯合剂，与酶分子中的金属离子形成螯合物，
乙醛等进行分子内交联修饰；还可以利用水溶性大分子
与酶的侧链基团共价结合进行大分子结合修饰。
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2）核酸类酶的侧连基团：指组成RNA的核苷酸残基
上的功能团。主要是核糖2’-位置上的羟基和嘌呤、嘧啶
碱基上的氨基和羟基。
通过侧连基团的修饰，提高R酶的稳定性，扩展其催
化功能，提高酶的催化效率。
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一、氨基修饰
第五章 酶分子修饰
定义：通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，
从而改变酶的某些特性和功能的过程。
天然酶在应用中的限制因素：
1）酶的活性、作用专一性和作用最适条件常不能
适应生产工艺的要求；
2）酶是蛋白质，容易变性失效，一般经不起高温、
强酸、强碱、有机溶剂以及时间等的考验；
3）注入人体内，作为异体蛋白，有难于吸收、易
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❖
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无
毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活
化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6
min
1
右旋糖酐-SOD
7
h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
酶工程 第五章酶分子修饰 第四节酶蛋白侧链基团修饰
酶蛋白侧链基团修饰一般采用化学手段，故属于化学 修饰法。所采用的各种小分子化合物称为侧链基团修饰剂。 不同的侧链基团所使用的修饰剂各不相同，可根据需要加 以选择。现将几种常用的小分子侧链基因修饰剂介绍如下：
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
《酶分子的修饰》课件
糖基化修饰通常发生在酶的特定氨基酸残基上，形成N-连 接或O-连接的糖链。糖基化修饰在多种生物学过程中发挥 重要作用，如蛋白质分选和分泌。
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
《酶分子的修饰》 PPT课件
酶的甲基化修饰
甲基化修饰是指将甲基基团加到酶分子上的过程，通常由甲基转移酶催化。甲基 化修饰可以改变酶的活性、稳定性、定位和与其他分子的相互作用。
甲基化修饰常见于DNA、RNA和蛋白质中。在蛋白质甲基化过程中，甲基转移 酶将甲基基团加到蛋白质特定氨基酸残基上，影响蛋白质功能和稳定性。
酶分子修饰与疾病发生发展
酶分子修饰与多种疾病的发生 和发展密切相关，如肿瘤、神 经退行性疾病、心血管疾病等
。
酶分子修饰可以影响细胞代 谢、细胞周期、细胞凋亡等 生物学过程，从而影响疾病
的发展进程。
深入了解酶分子修饰在疾病发 生发展中的作用，有助于发现 新的治疗靶点，为疾病治疗提
供新的策略和方法。
酶分子修饰与药物研发
酶分子修饰是药物研发的重要靶点之一，通过调节酶的活性可以设计出具有特定治 疗作用的药物。
酶分子修饰在药物研发中具有广阔的应用前景，如开发新药、优化现有药物的治疗 效果等。
药物研发过程中需要深入研究酶分子修饰的机制和作用，以确保药物的安全性和有 效性。
04 酶分子修饰的研究方法
蛋白质组学技术
蛋白质谱分析
肿瘤治疗
利用酶分子修饰技术，可 以设计出针对肿瘤细胞特 异性的治疗策略，实现肿 瘤的精准治疗。
免疫调节
酶分子修饰可以用于调节 免疫细胞的活性，为免疫 相关疾病的治疗提供新的 思路。
酶分子修饰在农业生产中的应用
抗虫抗病
通过酶分子修饰技术，可以培育 出具有抗虫抗病性能的农作物新 品种，提高农作物的产量和品质 。
《酶分子的修饰》 PPT课件
5第五章 酶分子修饰
二、大分子结合修饰的作用
通过修饰提高酶活力
酶催化剂能力本质上是由其特定的空间结构特别 是其活性中心的特定构象所决定
水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后可使酶 的空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有 利于和底物结合并形成准确的催化部位，使酶活 力提高。 1分子核糖核酸酶与6.5分子右旋糖酐结合，活力 提高2.25倍。
第九节 酶分子修饰的应用
一、在酶学研究方面的应用
１、酶的活性中心研究 ２、酶空间结构研究 ３、酶作用机制研究 （１）亲和标记法 （２）差示标记法 （３）氨基酸置换法 （４）核苷酸置换法
二、在医药方面的应用
１、降低或者消除酶抗原性 ２、增强医药用酶的稳定性
三、在工业方面的应用
１、提高工业用酶的活力 ２、增强工业用酶的稳定性 ３、改变酶的动力学特性
反应式
2、氰酸盐使氨基甲氨酰化，离子小， 易接近要修饰的基团。 3、磷酸吡哆醛（PLP） 4、多肽链N-末端残基的化学修饰：用于蛋 白质序列分析。有2，4—二硝基氟苯 （DNFB）法（sanger试剂）、丹磺酰氯 （DNS）法、苯异硫氰酸酯（PITC）法。
Байду номын сангаас
羧基的化学修饰
碳二亚胺修饰酶的羧基已成为最普遍的标准方法， 条件温和。
蛋白质工程的主要步骤 1、新蛋白质工程结构的设计 2、突变基因的核苷酸序列的确定 3、突变基因的获得
4、新蛋白质的产生
实验操作大致步骤
(1)先测定酶的一级结构
(2)用X射线衍射分析测定其三维结构 (3a)根据结构信息选择突变部位,即选定哪一个氨基 酸残基要被取代;选4~6个氨基酸残基的寡肽序列,其 间含待取代的氨基酸残基 (3b)用化学法合成由12~18个碱基组成并为所选寡肽的氨 基酸序列编码的核苷酸序列,作为定位诱变的引物 (4)找到(构建)单股质粒,含有为所要蛋白质编码的基因, 作为定点突变的模板
第五章酶分子的化学修饰：
第五章酶分⼦的化学修饰：第五章酶分⼦的化学修饰：⾃然界本⾝就存在着酶分⼦改造修饰过程,如酶原激活、可逆共价调节等。
⾮共价修饰：添加剂；⽢油、多糖、聚⼄⼆醇等多羟基化合物表⾯活性剂，⽜乳过氧化物酶活⼒在3-4天完全丧失，添加表⾯活性剂B2，维持获利10天上；蛋⽩质间的⾮共价连接α-淀粉酶70℃半衰期5民，抗体保护，16h.从⼴义上说，凡通过化学基团的引⼊或除去．⽽使蛋⽩质共价结构发⽣改变，都可称为酶的化学修饰。
从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的⽅式使⼀种蛋⽩质同某些化学试剂起特异反应，从⽽引起单个氨基酸残基或其功能基团发⽣共价的化学改变。
50年代，化学修饰⽤于研究蛋⽩质结构和功能的关系。
为了考察蛋⽩质中氨基酸残基的各种不同状态和确定哪些残基处于活性部位并为蛋⽩质的特定功能所必需。
20世纪70年代末以来,有关⽤合成⾼分⼦如聚⼄⼆醇(ＰＥＧ)及其衍⽣物进⾏蛋⽩质化学修饰，⽬的是⽤于⽣物医学和⽣物技术⽅⾯。
意义：1．基础酶学的研究；活性部位的研究氨基酸顺序分析中，胰酶对精氨酸和赖氨酸具有⾼度特异性,故常⽤此酶⽔解蛋⽩质,以制备肽碎⽚.为防⽌精氨酸和赖氨酸相互⼲扰的问题,可利⽤选择性化学修饰剂修饰赖氨酸和精氨酸,使⽔解局限在其中⼀个残基的肽键上；测定酶分⼦中某种氨基酸的数量。
探索酶的作⽤机理和催化反应历程2．提⾼⽣物活性(包括某些在修饰后对效应物的反应性能改变)；3．增强在不良环境中的稳定性；4．针对特异性反应降低⽣物识别能⼒．解除免疫原性；5．产⽣新的催化能⼒。
第⼀节酶分⼦的修饰⽅法⼀、酶的表⾯修饰（⼀）⼩分⼦修饰：利⽤⼩分⼦化合物对酶的侧链基团进⾏化学反应在蛋⽩质结构与稳定性的关系的研究中发现蛋⽩质结构对稳定性⽽⾔并⾮最合适的，蛋⽩质表⾯的⼀半基团由⾮极性氨基酸组成,蛋⽩球体的⾮极性表⾯原⼦簇与⽔接触不利于酶的稳定.因此,利⽤⼩分⼦化合物使蛋⽩球表⾯亲⽔化以提⾼酶的稳定性。
酶分⼦表⾯的功能基：羧基、氨基、巯基、羟基、咪唑基等⼄酰咪唑、卤代⼄酸、N-⼄基马来酰亚胺、碳化⼆亚胺、焦碳酸⼆⼄酯、四硝基甲烷、N-卤代琥珀酰亚胺等酶分⼦表⾯的亲⽔化提⾼稳定性。
第五章 酶分子的化学修饰
（三）酶侧链基团的性质与反应性质
1、对巯基的化学修饰： 对巯基的化学修饰： 常用的修饰试剂有烷化剂、 常用的修饰试剂有烷化剂、汞试剂 Ellman试剂等 试剂等。 和Ellman试剂等。 氨基的化学修饰： 2、氨基的化学修饰： 常用的修饰试剂有乙酸酐、 常用的修饰试剂有乙酸酐、2，4，6三硝基苯磺酸、 二硝基氟苯、 三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、烷基 化试剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯 化试剂、丹磺酰氯(DNS)和苯异硫氰酸酯 (DNS) PITC） （ PITC）等。
pH与离子强度 pH决定了酶分子 与离子强度： （一）pH与离子强度：pH决定了酶分子 中反应基团的解离状态，酶的解离状态 中反应基团的解离状态， 不同，其反应性能也不同；另一方面， 不同，其反应性能也不同；另一方面， 有些修饰试剂在不同pH下 有些修饰试剂在不同 下，与同一种基 团反应可以形成不同的产物。 团反应可以形成不同的产物。离子强度 对修饰反应也有重要影响。 对修饰反应也有重要影响。
酶化学修饰的应用领域
在基础酶学研究上
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定 酶蛋白的结构变化与运动 酶蛋白部分区域的构象状态 酶的作用机理与催化反应历程 酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态 酶的固定化技术 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上 克服酶在体内的不稳定性 消除或降低酶的抗原性 有助于酶分子到达并集中于病灶细胞 在工业上的应用 酶稳定性提高， 酶稳定性提高，使生产成本降低 反应条件的改善和酶寿命的延长导致生产工 艺的技术革新和改进。 艺的技术革新和改进。
（二）酶的小分子修饰作用 主要是利用一些小分子修饰试剂， 主要是利用一些小分子修饰试剂， 通过共价结合来修饰酶的一些基 团（如-COO-、-NH3+、-SH、 、 、 -OH、咪唑基等），提高酶的稳定 ），提高酶的稳定 、咪唑基等）， 性。常用的小分子修饰试剂有乙 糖基和甲基等。 基、糖基和甲基等。
酶分子修饰
7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝） 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基
O H2N CH CH2 OH O
C
谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)
•几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应
试剂特点： 烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团
（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨基（ Lys ， Arg ），巯基（ Cys ），羧基（ Asp 、 Glu ）， 甲硫基（Met），咪唑基（His）。
1）提高酶的生物活性（酶活力）。
2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。
3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。
4）产生新的催化能力。
第三节 酶化学修饰的原理
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性” 结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间 障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶 的活性部位。
氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（
Trp）、咪唑基，酚基等。
还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
4) 芳香环取代反应
•试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
O H2N CH CH2 OH O
C
谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)
•几种重要的修饰反应： 烷基化反应 酰化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应
1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应
试剂特点： 烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团
（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨基（ Lys ， Arg ），巯基（ Cys ），羧基（ Asp 、 Glu ）， 甲硫基（Met），咪唑基（His）。
1）提高酶的生物活性（酶活力）。
2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。
3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。
4）产生新的催化能力。
第三节 酶化学修饰的原理
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶 形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性” 结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间 障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶 的活性部位。
氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺
可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（
Trp）、咪唑基，酚基等。
还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。
可被还原的侧链基团：二硫键。
连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
4) 芳香环取代反应
•试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
酶分子修饰
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上 敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂 后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
同理，其他有机溶媒，去垢剂等也由于会 破坏维持酶天然构象的平衡力和改变微环 境而导致酶失活。
4、消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
酶经过化学修饰后，除了能减少由于内部平衡力 被破坏而引起的酶分子伸展打开外，还由于大分 子修饰剂本身就是多聚电荷体，所以有可能在酶 分子表面形成一层“缓冲外壳”。在一定程度上 抵御外界环境的电荷、极性变化，维持酶活性部 位的微环境相对稳定，使酶能在更广泛的条件下 发挥作用。
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
根据蛋白水解酶是一大分子物质，并只是在充分接近多肽 链上敏感键和敏感基团后才能产生作用的原理，酶化学修 饰期望交联于酶上的大分子修饰剂能产生空间障碍来阻挡 蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭 破坏。 另外，酶分子上许多敏感基团（如赖氨酸的ε-氨基等）参 与修饰反应，交联上修饰剂后，也减少了酶分子遭受蛋白 水解酶攻击破坏的可能性。
化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种 化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子 上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化 学反应，对酶分子结构进行改造。
化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。 只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保 持酶活性的基础上，能够在较大范围内改 变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良 特性，甚至创造出新的活性。
酶分子的基本结构是蛋白质，这一特性就决定了 当某种酶在作用于底物使之转变为产物的同时， 其本身也可能成为另一种酶（如蛋白水解酶）的 底物。对于蛋白水解酶来讲，一般是作用于某些 特定敏感键后，导致蛋白多肽链断裂。
第五章 酶分子修饰
现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术。定点突变 （site directed mutagenesis ）是20世纪80年代发展起来的一种 基因操作技术。是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变 从而获得突变基因的操作技术。
酶分子的定点突变
1、新酶分子结构的设计 2、突变基因碱基序列的确定 3、引物设计进行基因定点突变 4、酶基因克隆表达 5、变异特性分析
举例：
1.纤维素酶经高压处理后，最适温度有所降低， 在30℃-40℃条件下，酶活比天然酶提高了 10%。
2.盐酸胍使胰蛋白酶的原有空间构象破坏，透 析出去变性剂后，再在不同温度下，使酶重 新构建新的空间构象。结果表明，50℃条件 下重新构建的酶的稳定性比天然酶提高5倍。
是目前应用最广的酶分子修饰方法。
1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶 的空间结构发生某些精细的改变，从而改变 酶的特性与功能的方法。
2. 修饰剂：
聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、 肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。
修饰方法：修饰前活化（P139），然后在一
定条件下与酶分子共价结合。
二、酶化学修饰的目的
（一）研究酶的结构与功能的关系。
（二）人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应 用范围。
1. 修饰酶的热稳定性
2. 修饰酶的抗原性
3. 修饰酶对各类失活因子的抵抗力
4.修饰酶在体内的半衰期
5.最适pH
第二节
酶化学修饰的种类及应用
一、酶的表面化学修饰
（一）大分子修饰（大分子结合修饰）
常用金属离子
（往往是二价离子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，
酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生
01
十一次课
02
2
1
酶分子侧链基团修饰
酶侧链基团的修饰方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、酚基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰及分子内交联修饰等
功能基团主要有氨基、羧基、巯基．咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基
3
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸
侧链基团
修饰剂
Lys
氨基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
02
分离
03
需要通过不同的方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
04
金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。 金属离子置换修饰的方法：酶的纯化、去除原有的金属离子、加入置换离子 金属离子置换修饰的作用：
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6 min
1
右旋糖酐-SOD
7 h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
14 h
140
Ficoll(高分子量)–SOD
2
引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。
01
仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
02
有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。
03
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：
氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。
十一次课
02
2
1
酶分子侧链基团修饰
酶侧链基团的修饰方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、酚基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰及分子内交联修饰等
功能基团主要有氨基、羧基、巯基．咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基
3
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸
侧链基团
修饰剂
Lys
氨基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
02
分离
03
需要通过不同的方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
04
金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。 金属离子置换修饰的方法：酶的纯化、去除原有的金属离子、加入置换离子 金属离子置换修饰的作用：
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6 min
1
右旋糖酐-SOD
7 h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
14 h
140
Ficoll(高分子量)–SOD
2
引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。
01
仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
02
有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。
03
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：
氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。
酶工程 第五章酶分子修饰 第五节氨基酸置换修饰
第五节 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰除了在酶工程方面应用之外，还可用 来修饰其他功能蛋白质或多肽分子。例如：β-干扰素原 来稳定性差。这是由于其分子中含有3个半胱氨酸，其中2 个半胱氨酸的巯基连结形成二硫键，而另一个在第17位的 半肮氨酸(Cys-17)的巯基是游离的。当β-干扰素分子的 游离巯基与另—个β-干扰素的游离巯基相结合形成二硫 键时，β-干扰素就失去其活性。若将这个半胱氨酸(Cys17)用丝氨酸置换，就使β-干扰素不会生成二聚干扰素， 从而大大提高其稳定性。经修饰后的β-干扰素在低温条 件下保存半年，仍可保持其活性不变，这就为β-干扰素 的临床使用创造了条件。
第五节 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰可以用化学方法进行。例如：Bender 和Koshland成功地用化学方法将枯草杆菌蛋白酶活性中心 的丝氨酸转换为半胱氨酸，经修饰后，该酶对蛋白质和肽 的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的 活性。但是化学方法进行氨基酸置换，难度较大，受到诸 多限制。
80年代兴起和发展起来的蛋白质工程，为氨基酸置换 修饰提供了行之有效的可靠手段。
蛋白质工程又被称为第二代遗传工程。是指通过改造 与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新 的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具 有新的特性的蛋白质的技术过程。
第五节 氨基酸置换修饰
蛋白质工程主要步骤如下： 1.新蛋白质结构的设计 根据已知的蛋白质或酶的化学结构、空间结构及其特 性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序。确定 欲置换的氨基酸及位置。 2.突变基因的核苷酸序列的确定 根据欲得到蛋白质的氨基酸序列，确定其对应的m RNA上的核苷酸序列，再根据互补原则，从mRNA核苷酸序 列确定其所对应的突变基因上的核苷酸序列。依据欲置换 的氨基酸确定需要置换的核苷酸及其位置。
酶工程 第五章酶分子修饰 第六节物理修饰
酶工程
第五章 酶分子修饰
第六节 物理修饰
通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改 变，而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰。
物理修饰的特点在于不改变酶的组分和基因，酶分子 中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键 发生某些变化和重排。例如：羧肽酶γ经高压处理后，底 物特异性发生改变，有利于催化肽的合成反应，而水解反 应的能力降低；用高压方法处理纤维素酶以后，该酶的最 适温度有所降低，在30～40℃的条件下，高压修饰酶比天 然酶的活力提高10％。
第六节 物理修饰
酶分子空间构象的改变还可在某些变性剂的作用下， 先使酶原有空间构象破坏，然后在不同的条件下，使酶分 子重新构建新的构象。例如：先用盐酸胍等变性剂使胰Байду номын сангаас 白酶的原有构象破坏，通过透析除去变性剂后，在不同温 度下，使酶重新折叠形成新的构象。结果表明，50℃条件 下重新构建构象的胰蛋白酶的稳定性比在20℃下重建构象 的酶提高5倍。天然胰蛋白酶的稳定性与20℃条件下重建 构象的酶的稳定性基本相同。
第五章酶分子的修饰
140
Ficoll(高分子量)-SOD 24 h
240
聚乙二醇-SOD
35 h
350
3、改变酶的抗原性
通过大分子结合修饰，使酶分子的结构发生变化， 降低或消除酶的抗原性，可以保持酶的催化功能。
如：精氨酸酶经PEG结合修饰后，其抗原性显 著降低。
色氨酸酶经PEG修饰后可完全消除其抗原性。 L-天门冬酰胺酶经PEG结合修饰其抗原性完 全消除。
第二节 大分子结合修饰
一、定义：利用水溶性的大分子与酶蛋白的 侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发 生改变，从而改变酶的特性与功能的方法。
目前应用最广泛的酶分子修饰方法
二. 修饰剂：
要求：具有较大的分子量、良好的生物相容性 和水溶性。这样，经修饰的酶，其半衰期较长， 活力回收较高。 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、 肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。
[ HO—CH2—CH2—O—CH2—CH2—OH ]n
聚乙二醇
(1)PEG分子量为1000一10000的修饰效果较好， 用甲氧基PEG效果更好。
(2)溶解度高，溶于水，也溶于有机溶剂，没有抗 原性，也没有毒性，生物相容性好。
三、修饰：修饰前活化，然后在一定条件下 与酶分子共价结合。
1、修饰剂的活化 以PEG为例，PEG的羟基被活化，与酶的N端 氨基结合（Lys残基的侧链氨基）
来源：Cys
修饰反应:烷基化 修饰剂：碘乙酸(IAA)
碘乙酰胺(IAM)
• E-SH + R-X －> E-SR +HX
N-乙基马来酰亚胺（NEM）（常用的专一修饰巯基 试剂）
•E－SH ＋
四、咪唑基的化学修饰
05第五章 酶分子的修饰
氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基和吲哚基。
O H2N CH CH2 OH O
C O C O OH O CH CH2 C H2N OH CH CH2 CH2 CH2 OH C OH NH2 O O
C
OH
OH
H2N
CH
C
OH CH CH2
O C OH COOH
CH2 H2N CH2
H2N
CH CH2
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第五章 酶的分子修饰
食品与生物工程学院
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Go Go Go
1、什么是酶分子修饰 2、酶分子的修饰方法 3、酶修饰后的性质变化
Go
4、酶分子修饰应用
HCl 胃蛋白酶原 pH1.5～2
（从N端失去44个氨基酸残基） 胃蛋白酶
自身激活
食品与生物工程学院
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食品与生物工程学院
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⑵ 胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
食品与生物工程学院
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⑷ 大分子修饰的作用
①提高酶的催化效率 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力 提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原 有酶活力的5.1倍 ②增强酶的稳定性 ③降低或消除酶蛋白的抗原性 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的 抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而
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第五章酶分子修饰
•几种重要的修饰反应类型： •烷基化反应 •酰化反应 •氧化还原反应 •芳香环取代反应
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第五章酶分子修饰
1. 化学修饰反应的类型
1) 烷基化反应
试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团
（如－NH2，-SH等）发生烷基化。
可作用基团：
氨 基 （ Lys ， Arg ） ， 巯 基 （ Cys ） ， 羧 基 （ Asp 、 Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。
•连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。
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第五章酶分子修饰
• 4) 芳香环取代反应
• 试剂：卤（碘）化，硝化试剂。
• 碘代：
• I2＋
+ HI
• 硝化：
• (NO2)4C + +•(（N四O2硝)3基CH甲烷）
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第五章酶分子修饰
• 2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
•2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维 持酶活性部位微环境相对稳定。
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第五章酶分子修饰
• 第四节 酶化学修饰的设计
• 一、充分认识酶分子的特性 包括酶的——
• 1. 活性部位情况 • 2. 稳定条件及反应最佳条件 • 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
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第五章酶分子修饰
•二、 修饰剂的选择 要考虑——
• 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大 的分子量）
• 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有 较多的反应活性基团）
• 3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件
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第五章酶分子修饰
•三、反应条件的选择 要注意——
• 1. 酶与修饰剂的分子比例 • 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 • 3. 反应温度及时间
•（高度专一的对酚羟基修饰）
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第五章酶分子修饰
•8）吲哚基的化学修饰
• 来源：Trp • 修饰反应：氧化反应 • 修饰剂： N-溴代琥珀酰亚胺（NBS)
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第五章酶分子修饰
• 各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 侧链基团
修饰剂
Lys Asp、Glu
氨基 羧基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙 酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
酰基化反应
•
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第五章酶分子修饰
3) 氧化和还原反应
试剂特点：具有氧化性或还原性。 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 还原剂：巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇）等。 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基
（Trp）、咪唑基，酚基等。 可被还原的侧链基团：二硫键。
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第五章酶分子修饰
• 若某基团被修饰后：
• 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团
• 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团
• 但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结
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第五章酶分子修饰
•活性中心基团的鉴定标准
•①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 •②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。
结构。
• 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂
• 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间
障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶
的活性部位。
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第五章酶分子修饰
• 三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解 酶
• 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
• 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接 近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。
• 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少 了受蛋白水解酶破坏的可能性。
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第五章酶分子修饰
•四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
•1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
• 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除
• “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合
• （一）研究酶的结构与功能的关系。
• （二）人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应
•
用范围。
•
•
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第五章酶分子修饰
•1. 修饰酶的热稳定性
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第五章酶分子修饰
• 2. 修饰酶的抗原性
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第五章酶分子修饰
•3. 修饰酶对各类失活因子的抵抗力
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第五章酶分子修饰
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第五章酶分子修饰
• 差别标记：
•化学修饰
•底物或抑制剂存在
活性基团不与修饰剂作用
•含同位素标记
•去除底物或抑制剂
原来被保护的基团带同位素标记
• 的同样试
剂
• 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。PP Nhomakorabea文档演模板
第五章酶分子修饰
•2)专一性化学修饰（基团专一性修饰）
• 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一 氨基酸残基的侧链基团。
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第五章酶分子修饰
•3.蛋白质工程：（定点诱变法）
• 将酶相应的cDNA定点突变，突 变的cDNA只表达一个或几个氨基酸 被置换的酶蛋白，测定其活性可知被 置换的氨基酸是否为活力所必需。
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第五章酶分子修饰
• 第二节 酶化学修饰及修饰目的
• 一、酶化学修饰
1.限制酶大规模应用的原因：
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第五章酶分子修饰
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第五章酶分子修饰
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第五章酶分子修饰
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第五章酶分子修饰
•Active site
•The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.
1)细胞外稳定性差；
2)酶活性不够高；
3)具有抗原性。 •
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第五章酶分子修饰
2. 改变酶特性有两种主要的方法：
1)通过分子修饰的方法来改变已分离出 来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
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第五章酶分子修饰
• 二、酶化学修饰的目的
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第五章酶分子修饰
• 第五节 酶化学修饰的种类及应用
• 一、酶的表面化学修饰
• （一）大分子修饰（大分子结合修饰） • 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 • 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶
的空间结构发生某些精细的改变，从而改变 酶的特性与功能的方法。
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第五章酶分子修饰
第五章酶分子修饰
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2020/12/11
第五章酶分子修饰
•第一节 酶的活性中心（active site）
•
•一、活性中心的概念 由必需基团构成的与酶催化活性有关的 特定区域.
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第五章酶分子修饰
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第五章酶分子修饰
二、活性中心的共性
• (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 • (2)活性部位是一个三维实体。 • (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 • (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契 • 合）。 • (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水 • 作用等次级键结合。
修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。
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第五章酶分子修饰
烷基化反应
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第五章酶分子修饰
2) 酰基化反应
试剂特点：
含有
结构，作用于侧链基团上的亲核
基团，使之酰基化。
可作用基团：
氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟
基（Tyr）
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第五章酶分子修饰
•3)亲和标记（位点专一性修饰）
• 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计 合成的含有活泼反应基团的底物类似物。
•作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加 以修饰标记。
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第五章酶分子修饰
•化学修饰的专一 性
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第五章酶分子修饰
•亲和修饰剂：
• ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 • 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 • 残基亲和力小。 • ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 • 中心的基团形成稳定的共价键。
水溶性碳化二亚胺
Arg
胍基 苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮
Cys
巯基 碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺
二硫键 巯基乙醇、DTT
His 咪唑基 焦碳酸二乙酯、碘乙酸
Tyr 酚羟基 碘、四硝基甲烷
Trp 吲哚基 N-溴代琥珀酰亚胺
• 常用焦碳酸二乙酯（diethyl paracarbonate）
•
+CO2
•
+
•修饰酶 （240nm)