3T3L1细胞诱导分化.pptx
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让细胞长满以后，接触抑制 2 天（是细胞退出生长周期），加入含有 IBMX（一般使用浓度 0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是 1umol/L）和 insulin（胰岛素，一般使用浓 度 1-10ug/ml）的培基 2 天，再换成只含胰岛素的培基 2 天，然后每两天换液（普通培基）。 这 是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较 多，分化率很低。一般说不能超过 20 代，最好在 10 代以内。 诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。
诱导剂的配制 IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤): 分子量：222.2（Sigma:I5879）-20 度保存
用二甲基亚砜 DMSO 配制 111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液 终浓度为 0.5mmol/L,即每 100ml 培养液加 100ul 储存液。 DEX： 分子量：392.5（Sigma:D4902）-20 度保存 用无水乙醇配制 1mg/ml(2.5mmol/L)储存液 终浓度为 1umol/L,即每 100ml 培养液加 40ul 储存液。可用 2 年。 Insulin：分子量：6000 ,4 度保存 原液为诺和灵 R：400IU/10ml 终浓度为 10ug/ml,即每 100ml 培养液加 600ul 原液。4 度保存 3T3-L1 前脂肪细胞株的诱导分化 1) 将 3T3-L1 前脂肪细胞接种于培养板，用含 10%小牛血清的高糖 DMEM 培 液在 37℃、5％CO2 培养; 2) 待细胞长满至 80-90%，融合 2 天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是 长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为 0.5mmol/L IBMX（储存液浓 度 0.5mmol/L）、终浓度为 1umol/L(储存液浓度为 1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为 10ug/ml 的胰岛素的 10%小牛血清高糖 DMEM 培养 48h；（诱导 剂临用时再加到培液中混匀） 3) 48h 后换含终浓度为 10ug/ml 的胰岛素的 10%小牛血清高糖 DMEM 培养液 再培养 48h，48h 后再换 10%小牛血清高糖 DMEM 继续培养，2 天后换培 养液一次，诱导分化 8～12 天 3T3-L1 细胞 90%多呈成熟脂肪细胞表型，可 用于实验。
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诱导操作注意事项： 1、 一共需诱导 3 次，每次诱导的时间点最好固定，保证诱导剂作用够 48h，若
时间冲突诱导的时间只可延长，不可短于 48h。 2、 诱导操作需注意：以 6 孔板为例，每孔 3ml 培液，一个 6 孔板需 18ml 培液，
则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是：IBMX18u（l储存液），DEX7.2ul 储存液， 胰岛素 108u（l储存液）。第一遍诱导时用 200ul 的移液枪先每孔加 200ul 配制 好 的诱导液，沿孔壁边缘来回横着划慢慢注下培液，动作一定要慢，不然细 胞会飘起来，俗称卷边。每孔加 5 遍 200ul 培液，合计 1ml，第二、三遍则每 孔 1000ul 加培液，方法同上，操作要慢、轻。 3、 第 2 次诱导时，诱导剂的配制为：18ml 培液，加胰岛素 108ul（储存液），混 匀，操作步骤同前。第一次和第二次诱导很重要，动作一定要慢。第 3 次诱 导诱导仅需换 10%高糖DMEM 培液，但操作步骤同前，一般结果好的话第三 次诱导之前细胞内可见少量小脂滴，培液变黄，因为细胞里有脂滴了所以培 液看起来就黄了。 4、 第三次诱导以后，可见细胞内脂滴变大，但此时仍有细胞内的脂滴刚诱导出 来，需要两天后再次换液，此时换液则可每次 1ml 的培液换，一般换液 2 天 后几乎所有细胞内均可见脂滴，且脂滴较大，可用于加药处理。 细胞是否诱导成功细来自百度文库代数很重要，我们这边一般是 13 代以后的细胞就很难诱 导出来了，代数越靠后，细胞状态越不好，越容易卷边。
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因为 3T3-L1 加入诱导剂以后，收缩得很厉害，比较脆弱，很容易就飘起来。所以加诱导剂 的时候，手法要特别轻，最好用枪头加，不要用移液管，因为移液管 家的时候很难控制流 速，力度大。用枪头加诱导剂的时候，一定要贴壁加，让液体慢慢留下，这样对细胞的冲击 小。我正在做诱导分化，感觉细胞飘起来一小部分的 话，还是能用，没有什么大的影响， 如果范围比较大的话最好重新诱导。 你的诱导剂的浓度与一般人用的浓度不太一样。IBMX 大家一般都是用 0.5mmol/L，胰岛素 一般都是 1-10ug/ml，dex 有用 0.25，1，10umol/L 的。另外，不知道你买的胰岛素是水溶性 的吗？因为一般 的胰岛素是不溶于水的，但是在酸性环境中溶于水，所以配液时需要加一 点稀盐酸使胰岛素溶解。其他两种诱导剂你的配液方法没有问题。 镜下观察细胞接 触抑制什么形态？这有什么可说的吗，不就是长满了吗，互相接触在一起 了，如果你的细胞出现叠丛现象了，那么就是接触抑制过度了，那细胞就更容易飘起来了。 这就需要你自己把握好时机，因为要使接触抑制时间不够的话，细胞没有退出生长周期，诱 导剂就不会起作用；如果接触抑制过度的话，细胞很容易就飘起来。你自 己需要自己摸索 一定要在细胞状态好的情况下诱导分化，3T3-L1 长得非常快，如果长满以后不换液，会有大 批细胞死亡，判断细胞好坏的标准是 cell confluent 后，培养基中很少有漂浮的死亡细胞。 所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大，最好在 10*4 数量级，这样让细胞长 3 天后 铺满，再换液，再让细胞长 2-3 天，这时的细胞会退出生长周期，进入growth arrest 状态。 2，IBMX 的溶解方法有多种，不同文献有不同方法，DMSO，乙醇，浓盐酸，KOH 溶液都可， 针对你所说的出现结晶问题建议你用 1M KOH 试试，即 0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH， 3，胰岛素浓度大一点只会促进分化，不会有抑制作用，因为 Preadiopocyte 细胞膜上胰岛素 受体很少，所以需加超过生理浓度的 insulin，以其激活细胞膜上的 IGF1 受体，通过 IGF1 通 路来诱导分化。
首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX 是 SIGMA 的，浓度我用 0.5m mol/l,配的时候用 DMSO 浓缩 1000 倍，DEX 我用的是 Solarbio 分装的 100MG 的也用 DMSO 溶，Ins 我用的人用胰岛素，医院买 的），最主要的是要细胞代数 20 代以内，换诱 导液 2 时不用 1ML 的移液枪加用 200ul 的慢慢加.
3T3-L1 细胞的诱导分化，在前两天的融合期的时候，确定你用的是 DMEM 高糖+小牛血清， 在细胞高度融合以后才能开始进行第一阶段的诱导（MDI 诱 导，DMEM 高糖+胎牛血清）， 第一阶段后，细胞中可以观察到细胞已经开始变圆，第二阶段的诱导（insulin 诱导，DMEM 高糖+胎牛血清），细胞中 就可以观察到脂肪滴，进入第三个阶段的诱导的时候，脂肪滴的 聚集更加明显。诱导剂如地塞米松是需要乙醇溶解的，IBMX 是在一定浓度的KOH 溶解 的， insulin 是在一定浓度的 HCL 中溶解的，诱导分化的程度也和细胞有关，同为 3T3-L1 细胞， 但是每种细胞的分化能力有很大的差异，在没有进入 分化诱导的时候，一定不能用胎牛血 清来养细胞！在分化期有少量的细胞出现死亡是正常的！两天进行一次换液，因此一定要小 心被污染！祝各位实验顺利！共同学 习！
诱导剂的配制 IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤): 分子量：222.2（Sigma:I5879）-20 度保存
用二甲基亚砜 DMSO 配制 111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液 终浓度为 0.5mmol/L,即每 100ml 培养液加 100ul 储存液。 DEX： 分子量：392.5（Sigma:D4902）-20 度保存 用无水乙醇配制 1mg/ml(2.5mmol/L)储存液 终浓度为 1umol/L,即每 100ml 培养液加 40ul 储存液。可用 2 年。 Insulin：分子量：6000 ,4 度保存 原液为诺和灵 R：400IU/10ml 终浓度为 10ug/ml,即每 100ml 培养液加 600ul 原液。4 度保存 3T3-L1 前脂肪细胞株的诱导分化 1) 将 3T3-L1 前脂肪细胞接种于培养板，用含 10%小牛血清的高糖 DMEM 培 液在 37℃、5％CO2 培养; 2) 待细胞长满至 80-90%，融合 2 天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是 长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为 0.5mmol/L IBMX（储存液浓 度 0.5mmol/L）、终浓度为 1umol/L(储存液浓度为 1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为 10ug/ml 的胰岛素的 10%小牛血清高糖 DMEM 培养 48h；（诱导 剂临用时再加到培液中混匀） 3) 48h 后换含终浓度为 10ug/ml 的胰岛素的 10%小牛血清高糖 DMEM 培养液 再培养 48h，48h 后再换 10%小牛血清高糖 DMEM 继续培养，2 天后换培 养液一次，诱导分化 8～12 天 3T3-L1 细胞 90%多呈成熟脂肪细胞表型，可 用于实验。
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诱导操作注意事项： 1、 一共需诱导 3 次，每次诱导的时间点最好固定，保证诱导剂作用够 48h，若
时间冲突诱导的时间只可延长，不可短于 48h。 2、 诱导操作需注意：以 6 孔板为例，每孔 3ml 培液，一个 6 孔板需 18ml 培液，
则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是：IBMX18u（l储存液），DEX7.2ul 储存液， 胰岛素 108u（l储存液）。第一遍诱导时用 200ul 的移液枪先每孔加 200ul 配制 好 的诱导液，沿孔壁边缘来回横着划慢慢注下培液，动作一定要慢，不然细 胞会飘起来，俗称卷边。每孔加 5 遍 200ul 培液，合计 1ml，第二、三遍则每 孔 1000ul 加培液，方法同上，操作要慢、轻。 3、 第 2 次诱导时，诱导剂的配制为：18ml 培液，加胰岛素 108ul（储存液），混 匀，操作步骤同前。第一次和第二次诱导很重要，动作一定要慢。第 3 次诱 导诱导仅需换 10%高糖DMEM 培液，但操作步骤同前，一般结果好的话第三 次诱导之前细胞内可见少量小脂滴，培液变黄，因为细胞里有脂滴了所以培 液看起来就黄了。 4、 第三次诱导以后，可见细胞内脂滴变大，但此时仍有细胞内的脂滴刚诱导出 来，需要两天后再次换液，此时换液则可每次 1ml 的培液换，一般换液 2 天 后几乎所有细胞内均可见脂滴，且脂滴较大，可用于加药处理。 细胞是否诱导成功细来自百度文库代数很重要，我们这边一般是 13 代以后的细胞就很难诱 导出来了，代数越靠后，细胞状态越不好，越容易卷边。
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因为 3T3-L1 加入诱导剂以后，收缩得很厉害，比较脆弱，很容易就飘起来。所以加诱导剂 的时候，手法要特别轻，最好用枪头加，不要用移液管，因为移液管 家的时候很难控制流 速，力度大。用枪头加诱导剂的时候，一定要贴壁加，让液体慢慢留下，这样对细胞的冲击 小。我正在做诱导分化，感觉细胞飘起来一小部分的 话，还是能用，没有什么大的影响， 如果范围比较大的话最好重新诱导。 你的诱导剂的浓度与一般人用的浓度不太一样。IBMX 大家一般都是用 0.5mmol/L，胰岛素 一般都是 1-10ug/ml，dex 有用 0.25，1，10umol/L 的。另外，不知道你买的胰岛素是水溶性 的吗？因为一般 的胰岛素是不溶于水的，但是在酸性环境中溶于水，所以配液时需要加一 点稀盐酸使胰岛素溶解。其他两种诱导剂你的配液方法没有问题。 镜下观察细胞接 触抑制什么形态？这有什么可说的吗，不就是长满了吗，互相接触在一起 了，如果你的细胞出现叠丛现象了，那么就是接触抑制过度了，那细胞就更容易飘起来了。 这就需要你自己把握好时机，因为要使接触抑制时间不够的话，细胞没有退出生长周期，诱 导剂就不会起作用；如果接触抑制过度的话，细胞很容易就飘起来。你自 己需要自己摸索 一定要在细胞状态好的情况下诱导分化，3T3-L1 长得非常快，如果长满以后不换液，会有大 批细胞死亡，判断细胞好坏的标准是 cell confluent 后，培养基中很少有漂浮的死亡细胞。 所以诱导前传代的细胞在接种时数量不要太大，最好在 10*4 数量级，这样让细胞长 3 天后 铺满，再换液，再让细胞长 2-3 天，这时的细胞会退出生长周期，进入growth arrest 状态。 2，IBMX 的溶解方法有多种，不同文献有不同方法，DMSO，乙醇，浓盐酸，KOH 溶液都可， 针对你所说的出现结晶问题建议你用 1M KOH 试试，即 0.0115 gIBMX + 940 ul ddh H2O + 60 ul KOH， 3，胰岛素浓度大一点只会促进分化，不会有抑制作用，因为 Preadiopocyte 细胞膜上胰岛素 受体很少，所以需加超过生理浓度的 insulin，以其激活细胞膜上的 IGF1 受体，通过 IGF1 通 路来诱导分化。
首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX 是 SIGMA 的，浓度我用 0.5m mol/l,配的时候用 DMSO 浓缩 1000 倍，DEX 我用的是 Solarbio 分装的 100MG 的也用 DMSO 溶，Ins 我用的人用胰岛素，医院买 的），最主要的是要细胞代数 20 代以内，换诱 导液 2 时不用 1ML 的移液枪加用 200ul 的慢慢加.
3T3-L1 细胞的诱导分化，在前两天的融合期的时候，确定你用的是 DMEM 高糖+小牛血清， 在细胞高度融合以后才能开始进行第一阶段的诱导（MDI 诱 导，DMEM 高糖+胎牛血清）， 第一阶段后，细胞中可以观察到细胞已经开始变圆，第二阶段的诱导（insulin 诱导，DMEM 高糖+胎牛血清），细胞中 就可以观察到脂肪滴，进入第三个阶段的诱导的时候，脂肪滴的 聚集更加明显。诱导剂如地塞米松是需要乙醇溶解的，IBMX 是在一定浓度的KOH 溶解 的， insulin 是在一定浓度的 HCL 中溶解的，诱导分化的程度也和细胞有关，同为 3T3-L1 细胞， 但是每种细胞的分化能力有很大的差异，在没有进入 分化诱导的时候，一定不能用胎牛血 清来养细胞！在分化期有少量的细胞出现死亡是正常的！两天进行一次换液，因此一定要小 心被污染！祝各位实验顺利！共同学 习！