酸乳的制作和乳酸菌的分离

倍比稀释图解
→
1.取移液管 2.吸酸乳原液
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3.注入第一支试管
↓
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6.注入第二支试管 5.吸取1ml10-1稀释液
←
4.吹吸混匀,成10-1稀释液
4.涂布
取6块乳糖牛肉膏蛋 白胨平板，每2块一 组，分别在皿底边 缘以10-4、10-5、 10-6做标记。
取出一支1ml移液管，吸取0.2ml相应浓度的菌 悬液，左手将皿盖在火焰旁打开一缝，然后将 菌液滴在平板中央。
实验器材
仪器：试管、温箱、培养皿、涂布棒、 移液管、石棉网、三角架、煤气 灯、记号笔等 材料：乳糖牛肉膏蛋白胨培养基、 市售酸乳样品（含保加利亚乳杆 菌和嗜热链球菌两种活性菌）
实验步骤
1.熔化培养基
将事先制备于三角瓶中已灭菌的培养基置于电炉上加热 使其熔化，加热时必须不时摇动三角瓶，以免受热不均 而引起瓶底爆裂。待培养基完全熔化后，置一旁冷却至 55－60 ℃。
实验5 酸乳的制作和乳酸菌的分离
本次实验内容包括:
酸乳的制作 平板菌落计数法 平板划线分离与斜面接种技术
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第一部分:酸乳的制作
酸乳的营养价值
酸乳能在肠道内抑制有害微生物的生长，经常饮用酸乳，其中含有的活性 乳酸菌在肠道内繁殖，产生的乳酸能抑制其他有害微生物的生长，避免人体产 生毒素，保证人体健康。 乳酸菌在人体肠道的发酵过程中亦促进了酒精发酵，酒精发酵的产物能使 人体消化腺机能增强，促进食欲，并能增加肠蠕动和机体的物质代谢。 有些乳酸链球菌能分泌一种抗菌素，抑制乳房炎、白喉、肺炎、结核等病 原体，此外，某些乳酸菌还能形成对炎症有特殊作用的B族维生素。
3.倍比稀释
Plate 0.2-ml samples
事先准备6支洁净的试管，每支试管内装入9ml 生理盐水，加塞灭菌后待用。实验前，在6支 试管壁上依次用10-1-10-6做标记。
倍比稀释的过程
在火焰旁，取出一支1ml已灭菌的移液管， 吸取1ml酸乳原液沿管壁加入第一支试管中， 然后取出第二支1ml移液管将此悬液吹吸混 匀，此即成原液浓度1/10的稀释液。用第二 支移液管从此悬液中吸取1ml加入第二支试 管中，取出第三支移液管吹吸混匀，制成原 液浓度1/100的稀释液。以此类推，将酸乳 稀释到原始浓度的1/106(百万分之一)。
斜面接种图解
4.培养和观察
将斜面试管置37°温室中培养2d。以直线划线的斜面 为准，观察并描述接种2d后菌落生长的形态。
实验报告
1.保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的形态 2.斜面接种的形态、培养特征
思考题
你所做的划线法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请 分析原因。 如何确定平板上某个单菌落是否为纯培养？请写出实验的 主要步骤。 如果要分离得到极端嗜盐细菌，在哪里取样为宜？试说明 理由。 如果一项研究内容需要从自然界中筛选到能产高温蛋白的 菌株，你将如何完成？请写出简明试验方案。 用斜面检测微生物的培养特征接种时，为什么不要划多条 线或蛇形，而只要划一直线？ 接种环接种前后灼烧的目的是什么？为什么在接种前一定 要将其冷却？如何判断灼烧过的接种环已冷却？
2.加样
在火焰旁打开玻璃杯口的铝箔，倒入200ml左右 的鲜乳，并加入12 g白砂糖，重新封口。
3.消毒
置于90℃恒温水浴锅中消毒10min， 在加热时需不时用灭菌的玻棒搅动 鲜乳，使糖充分溶解。消毒完成后， 将鲜乳从水浴锅中取出，使之冷却 至室温。
玻棒的灭菌方法：将玻棒蘸取少量酒精， 然后迅速通过火焰。
6.计数
将培养后的平板取出，挑选菌落数在30～300之 间的平板，从培养皿底部数出菌落数，并根据其 稀释度推出样品中的活菌数量。 每毫升中菌落形成单位（cfu/ml） ＝同一稀释度的平均菌落数×稀释倍数×5
实验结果
10－4 10－5
1 2 3 平均 1
10－6
2 3 平均
稀释度
cfu数/平板
每毫升中的cfu数
倒平板： 每组倒平板 10块。 在无菌培养 皿底部注明 分离菌名、 稀释度、组 别、班级。
2.倒平板
当培养基冷却至60 ℃左右时，在火焰旁打开灭 菌培养皿的包装，准备倒平板。
倒平板的方法如下:
揭下瓶口的铝箔，右手持三角瓶于火焰旁边，瓶口要保持对着火 焰，左手将皿盖打开，迅速倒入培养基，以液体刚好盖满平皿底 部为宜（20ml左右的培养基制成的9cm平板厚度约4mm），合上 皿盖后，置于水平桌面上略加转动，等待其凝固。
1 2
3 平均
思考题
为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才倒平板？ 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什 么？ 试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺 点及应用。 当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在 一起时，你认为问题出在哪里？ 用倒平板法和涂布计数法，其平板上长出的菌落有何 不同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？
吸取菌悬液
滴加菌液
右手持金属涂棒，将其在酒精中蘸一下后接触火焰，待火焰熄 灭后即完成涂棒的灭菌。涂布前，先将涂棒在皿盖内侧的冷凝 水中冷却，然后将平板中央的菌悬液分散开，最后，将涂棒紧 贴于平皿边缘，左手以同方向转动平皿，使菌液均匀地分散在 培养基上。
涂棒灭菌
冷却涂棒
均匀涂布
5.培养
涂布后，静置5～10min，使菌液完全吸附到培 养基内，将培养皿倒置于37℃温箱内培养48h。
b.分区划线
用接种环以无菌操作挑取酸乳一环，先在平板培养基 的一边作第一次平行划线3～4条，再转动平皿约70° 角，并将接种环上剩余物烧掉。待冷却后，通过第一 次划线的末端引出作第二次平行划线，再以同样的方 法通过第二次划线部分划线作第三次划线和通过第三 次划线部分划线作第四次划线。划线完毕后，盖上培 养皿皿盖，倒置于温室培养。
第二部分：平板菌落计数法
实验目的
掌握微生物实验中的几项基本操作技术： 倒平板、倍比稀释、平板涂布和菌落计数。 了解平板菌落计数法在微生物活体计数中 的意义。
实验原理
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的 微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布 到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉 眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单 细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可 换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不宜 完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能 来自样品中的2～3或更多个细胞。因此平板菌落计数的 结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果， 现在已倾向使用菌落形成单位（cfu ：colony-forming units），而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
实验器材
菌种： 市售酸乳样品（含保加利亚乳杆 菌和嗜热链球菌两种活性菌） 培养基： 乳糖牛肉膏蛋白胨培养基 实验仪器：温箱、接种环、培养皿、煤气灯、 显微镜、试管等
实验步骤
1.平板划线分离
a.连续划线
b.分区划线 其他划线分离方法
划线方法
接种工具
a.连续划线
右手持接种环，在火焰上灭菌，待稍冷却后挑取一环 酸乳样品，左手拿皿底，右手控制接种环以一定倾角 与培养基接触，连续地在培养基上来回划线，从培养 基的一端到另一端。在末端处划线时可将平皿作一定 角度的倾斜，使接种环接触到培养基。
2.挑单菌落、镜检
培养2d后，通常在连续划线平皿的末端和分区划线最 后一区的末端可见单菌落。用接种环在无菌条件下挑 取单菌落在载玻片上的一滴生理盐水中分散均匀，经 固定、染色、水洗、干燥后用油镜镜检，验证是否只 有一种形态特征的微生物。
3.斜面接种
斜面接种方法如下：先在火焰旁挑取单菌落，然后 左手持斜面试管，右手拔出试管帽后迅速烧灼管口。 试管帽夹于右手手心，将已挑菌的接种环伸入斜面 试管，用环在斜面上自试管底部向上端轻轻地划一 直线。若用于菌种培养，划线为自试管底部向上的 “锯齿形”，使更多细菌在斜面上生长。接种环退出 试管后，再用火焰烧灼管口并在火焰旁将试管塞塞 上。之后，烧掉接种环上的剩余物。
因此，酸乳不仅是一种具有很 高吸收率和消化率的乳制品， 而且还是一种对某些疾病具有 治疗效果的乳制品。
自制酸乳的原理
市售的酸乳中含有活性的保加利亚乳杆菌与嗜 热链球菌，从中取样后在无菌条件下接种到鲜 乳中，在42℃的条件下培养4小时，依靠上述 两种微生物的协同发酵作用发生一系列生化反 应，冷藏过夜后即成酸乳。
4.接种
在火焰旁，用移液管吸取鲜乳体积1/10左右的酸乳接种，吹吸 混匀后用铝箔封口。
5.发酵与冷藏
将已接种的鲜乳放入42℃温箱中发酵培养4h，转入10 ℃ 冰箱冷藏过夜后，即成可食用的酸乳。
思考题
在90℃消毒完成后，为什么要等冷却至室温后才能将 酸乳接种入鲜乳中？ 鲜乳经过接种，在42 ℃发酵4h之后能否直接饮用？在 10 ℃的冰箱中冷藏过夜的目的是什么？
第三部分： 平板划线分离法与斜面接种
实验目的
学习通过平板划线分离得到单菌落的 方法。 观察几种微生物在斜面上的生长特征。 熟练掌握平板划线分离技术等微生物 实验基本操作。
实验原理
自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少 量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究 各种微生物的特性，首先需使该微生物处于纯培养 状态。也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某 一种或株，他们有着共同的来源，是同一细胞的后 代。
课外阅读材料：酸乳的发酵过程
实验器材
仪器：玻璃杯，铝箔，10ml移液管，高 压蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，恒温培养 箱，冰箱 材料：鲜乳200ml，酸乳、白砂糖各少 许
实验步骤
1.准备工作：
实验前，准备一个洁净的玻璃 杯与一支10ml移液管，玻璃杯 盖上铝箔，移液管加过滤嘴后 装入金属桶中，对其进行灭菌 处理。
为了获得单菌落，实验室常用的方法是平板划线分离 法。平板划线分离法可分为连续划线和分区划线，但 两种方法的主导思想都是将样品由浓变稀，从多组分 的混合样品最后得到较纯的单菌落。 将平板划线分离得到的单菌落接种到斜面上，可进一 步观察其生长特征。微生物在斜面培养基上生长，可 以呈丝线状、刺毛状、念珠状、舒展状、树枝状、或 假根状。培养特征可以作为微生物分类鉴定的指征之 一，并能为识别纯培养是否被污染作为参考。