动物细胞培养(通用)
动物细胞培养(“细胞”相关文档)共10张
传代培养的绍鸭成纤维细胞形态（DAPI染色）
正常细胞
凋亡细胞
分裂中期细胞
• 汇合后挑取少许细胞，染色，观察拍照。
倒置显微镜下观察拍照。 原代培养的绍鸭成纤维细胞，相差显微镜照片 5cm摆放后倒置培养瓶，加少量营养液，保持湿润，37 ℃培养，2hr后翻转培养瓶，添营养液继续培养。 02 %EDTA ）消化2-3分钟，倾去大部分消化液，留少量消化液浸润细胞。 单层细胞用Hank’s 液洗涤后，加入维持液，用于原代细胞维持。 细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 加适量营养液吹打分散，补加营养液后，1：2分装培养。 02 %EDTA ）消化2-3分钟，倾去大部分消化液，留少量消化液浸润细胞。 定期观察细胞贴壁生长状况，如颜色变黄，说明细胞生长，3-5天后更换培养液。 倒置显微镜下观察拍照。 原代培养 ：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶称为传代或传代培养。 双蒸水、Hank’s液、0. 单层细胞用Hank’s 液洗涤后，加入维持液，用于原代细胞维持。 实验九 动物细胞培养 维持液： DMEM培养基（含5%小牛血清、1万单位/ml青、链霉素）。 酒精棉球消毒鸭蛋，剥出鸭胚，去头、翅、爪和内脏， 加Hank’s 液，剪碎为0.
湿润，37 ℃培养，2hr后翻转培养瓶，添营养液继续培养。 • 3. 定期观察细胞贴壁生长状况，如颜色变黄，说明细胞生长，3-5天后更换培养
液。 • 4 .倒置显微镜下观察拍照。
• 5.单层细胞用Hank’s 液洗涤后，加入维持液，用于原代细胞维持。
五、传代培养
• 当培养细胞接近汇合成片时，倾去培养液。
1万单位/ml青、链霉素）。 • 维持液： DMEM培养基（含5%小牛血清、
动物细胞培养
动物细胞培养简介动物细胞培养是一种在体外控制环境下培养和繁殖动物细胞的技术，广泛应用于生物医学研究、药物筛选、疾病治疗等领域。
动物细胞培养是通过提供适当的养分和生长条件，使细胞可以在无体内环境的情况下生长和繁殖。
培养基选择动物细胞培养的首要任务是提供合适的培养基，以满足细胞的生长和繁殖需求。
培养基通常由基础培养液和补充物组成。
基础培养液提供细胞生长所需的基本营养物质，如糖、氨基酸、维生素等。
补充物则包括生长因子、激素、抗生素等，以促进细胞生长和抑制细菌的污染。
常用的培养基有DMEM（Dulbecco最小培养基）、RPMI （Roswell Park红斯威尔纸培养基）、MEM（最小必需培养基）等。
选择适合特定细胞类型和研究目的的培养基对细胞的生长和研究结果至关重要。
细胞分离和传代在动物细胞培养过程中，细胞通常需要经过分离和传代的步骤，以保持细胞的健康状态并扩散细胞数量。
细胞分离细胞分离是将细胞从组织中分离出来的过程。
常用的细胞分离方法包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法、机械剪切法等。
分离得到的细胞可以直接用于培养，也可以进行进一步的传代。
细胞传代细胞传代是将已培养细胞进行分离并移植到新的培养皿中的过程，以维持细胞的持续生长。
传代可以通过机械分离、胶原酶等酶处理或稀释离心等方法进行。
传代过程中需要注意的是细胞的密度和周期，以避免细胞过度生长或死亡。
培养条件在动物细胞培养过程中，提供适当的培养条件对细胞的生长和繁殖至关重要。
温度和湿度动物细胞通常在37℃下生长，因此培养箱和孵育器需要保持恒定的温度。
同时，湿度的控制也是必要的，以避免细胞脱水。
CO2和pH值大多数动物细胞需要CO2的存在来维持酸碱平衡。
因此，在培养过程中，需要添加适量的CO2到培养箱中，以维持合适的pH值。
一般来说，细胞培养需要在5% CO2下进行，pH范围为7.2-7.4。
搅拌和通气为了促进细胞的生长和分裂，培养基需要定期搅拌以保持养分的均匀分布。
动物细胞培养基本方法
该操作方式在动物细胞培养和药品生产 中被广泛采用，它的优点是操作简便，生 产效率高，可长期进行生产，反复收获产 品，而且可使细胞密度和产品产量一直保 持在较高的水平。
动物细胞培养基本方法
3、灌流式操作 当细胞和培养基一起加入反应器后，在细
胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件 培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。
常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰酶 －柠檬酸盐、胰酶－EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、 木瓜蛋白酶等。
动物细胞培养基本方法
二 细胞计数 1 血球计数板计数 2 自动细胞计数器计数 3 结晶紫染色细胞核计数法 4 MTT染色计数法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
1、培养过程需检测的物化参数 直接在线检出 取样离线检测 检测后计算
2、主要参数的检测和控制方法
动物细胞培养基本方法
2、主要参数的检测和控制方法
①温度 ②pH a在培养初期，偏碱，控制进二氧化碳量 b当细胞密度提高后控制NaHCO3的量 ③溶氧 ④搅拌 ⑤进出液流量
动物细胞培养基本方法
第七节 动物细胞制药的前 景与展望
动物细胞培养基本方法
动物细胞培养基本方法
3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养
将悬浮培养和贴壁培养相结合的方法。 ①微载体培养：细胞贴附在载体表面。创造大
的贴附面积，供细胞贴附生长增殖；载体体 积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细 胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培 养的一切优点。 载体：葡聚糖、聚苯乙烯、胶原等。
动物细胞培养基本方法
另一种是先将细胞和培养基加入反应器， 待细胞生长至一定密度后，向反应器内加 入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后， 将反应物取出。
动物细胞培养
动物细胞培养
动物细胞培养是一种重要的生物技术手段，广泛应用于医药、生物学研究、食
品工业等领域。
通过细胞培养，可以获取大量同质的细胞群体，为疾病治疗、新药研发提供重要的支持。
动物细胞培养的原理
动物细胞培养是将动物组织或细胞在人工培养基中进行维持、增殖、传代等过程。
培养基通常包括营养物质、生长因子、激素等成分，提供细胞生长所需的营养和环境。
动物细胞培养的步骤
1.细胞来源：从动物体内收集组织样本，获得原代细胞。
2.细胞分离：通过消化酶等手段将组织分离成单个细胞。
3.传代培养：将分离的细胞在培养基中培养，定期传代以增殖细胞数
量。
4.检测与分析：对培养的细胞进行检测、分析，确保其健康状态。
动物细胞培养的应用
1.生物医学研究：细胞培养在癌症、遗传疾病等方面的研究中发挥重
要作用。
2.药物研发：通过细胞培养可以进行药物筛选、毒性测试等工作。
3.食品工业：利用细胞培养技术可以生产细胞培养肉等食品。
动物细胞培养的发展
随着生物技术的不断发展，动物细胞培养技术也在不断创新和提升。
新的培养
基配方、生长因子的发现以及工程技术的应用，使得动物细胞培养在医学和生物学领域有着广阔的应用前景。
动物细胞培养作为一种重要的生物技术手段，将继续在各个领域发挥重要作用，为人类健康和科学研究进步做出贡献。
动物细胞培养130913PPT课件
（2）适宜的温度和PH值
36.5+（-）0.5度, 7.2-7.4
保证细胞顺利的 生长增殖
（3）必要的气体条件
O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）
维持培养液的PH
CO2 培养箱-模拟人体环境
• 维持二 氧化碳 水平（510％）
• 湿度
• 温度 （37℃）
大面积皮肤烧 伤或烫伤？
（三）动物细胞培养
1、概念： 从动物机体中取出相关组织，将它分散成单 个细胞，然后在适宜的培养基中，让这些细胞生 长和繁殖。
2、原理： 细胞增殖 （有丝分裂）
3、过程：
Q2 选什么组织？
动物胚胎或幼龄动物的组织、器 官，它们的细胞分化程度低，增 殖能力强，分裂旺盛，容易培养。
变化，带有癌变的特点，可能在培养条件下无限 制的传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
写在最后
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
（1）大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、 干扰素、单克隆抗体）
资料1：
干扰素是动物细胞分泌产生的蛋白质，具有抗病毒 等多种生物学活性。 β干扰素是人的成纤维细胞产 生的，一个成纤维细胞产生的β干扰素量非常低。 现要获得大量的β干扰素。如何解决？
（2）培养的动物细胞可以用于检测有毒物质， 判断某种物质的毒性
信息2：
2005年4月，美国一家非官方癌症研究中心发布信 息说，“高露洁”牙膏中含有的抗菌化学物质三 氯生可能是致癌物质。公众对此表示怀疑。如何 检验该药物的毒性？
(通用版)高二生物专题04动物细胞工程暑假作业(含解析)
专题04 动物细胞工程【基础回顾】1.动物细胞培养——动物细胞工程技术的基础(1)动物细胞的培养过程(2)培养条件①无菌、无毒的环境：对和所有培养用具进行无菌处理，添加，定期更换培养液以清除。
②营养：除正常的有机和无机营养外，加入等一些天然成分。
③适宜的温度和pH：温度为℃(哺乳动物)，pH为。
④气体环境：含95%空气加的混合气体，其中后者的作用是。
(3)应用：生物制品的生产、检测有毒物质、医学研究。
2.动物体细胞核移植技术和克隆动物(1)动物体细胞核移植技术的过程(2)原理：。
(3)结果：。
(4)应用：①加速家畜进程，促进优良畜群繁育。
②保护。
③生产医用蛋白。
④作为异种移植的供体。
⑤用于组织器官的移植。
3.动物细胞融合和单克隆抗体的制备(1)动物细胞融合①原理：。
②融合方法：聚乙二醇(PEG)、、电激等。
③意义：突破了的局限，使成为可能，也为制造开辟了新途径。
(2)单克隆抗体①制备过程②优点：特异性强、，可大量制备。
③用途：作为；用于治疗疾病和。
【想一想】例1.如图为动物细胞培养过程中细胞增殖情况的变化曲线，图中B、E两点表示经筛选、分装后继续培养。
下列判断错误的是A．B点之前的培养称为原代培养，之后的培养称为传代培养B．接触抑制现象主要发生在AB段和DE段C．分瓶后的每个培养瓶中的细胞群称为一个克隆D．E点后的细胞大多数具有异倍体核型，从而可连续传代例2.核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径(如图)。
正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。
现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。
关于筛选原理的叙述，正确的是A．免疫的B细胞及其互相融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖B．骨髓瘤细胞及其互相融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖C．杂交瘤细胞因为可以进行上述两个途径所以能在HAT培养基上大量增殖D．HAT培养基上筛选出的所有杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度的目标抗体例3.下图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程，有关叙述不正确的是A．图中实验小鼠注射的甲是能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原B．利用聚乙二醇、灭活的病毒和电激等方法均可诱导细胞融合获得乙C．用特定的选择培养基对乙筛选，融合细胞均能增殖，未融合细胞均不能增殖D．丙需进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选后可获得大量能分泌所需抗体的丁【练一练】1.抗体的制备经历了细胞学层面和分子学层面两个合成途径的研究。
动物细胞培养方法
动物细胞培养方法
动物细胞培养是一种常用的实验手段，广泛应用于细胞生物学、药物研发、生物医学研究等领域。
以下是一般性的动物细胞培养方法：
1.细胞系的选择：选择合适的动物细胞系是动物细胞培养的第一步。
细胞系的选择要考虑细胞类型、来源、生长特性和用途等因素。
2.细胞培养基的准备：准备适用于所选细胞系的培养基。
培养基包括基本培养基和补充物，如生长因子、抗生素等。
不同的细胞系需要不同的培养基。
3.细胞的解冻：从冷冻保存的细胞库中取出细胞，进行解冻。
解冻过程要尽可能快速，以减少细胞对冷冻损伤的敏感性。
4.细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要将其传代，以维持细胞的生长状态。
传代过程包括细胞的分离、计数和重新接种。
5.细胞培养条件的控制：控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常细胞培养箱会提供稳定的培养环境。
6.细胞的观察和检测：定期观察细胞的形态、生长状态，并进行必要的细胞检测，如细胞计数、细胞周期分析等。
7.防止细胞污染：严格遵循无菌操作规程，防止培养物受到细菌、真菌、支原体等的污染。
使用无菌操作室和经过无菌处理的实验器材。
8.制备细胞冻存物：定期制备细胞冻存物，以备将来使用。
冻存物的制备需要使用适当的冻存液和合适的冷冻保存温度。
9.特殊操作：针对具体实验需求，可能需要进行细胞转染、感染、药物处理等特殊操作。
在进行动物细胞培养时，实验者需具备丰富的培养经验和相关技能，同时需按照实验室的标准操作规程进行操作，以确保实验的准确
性和可重复性。
动物细胞工程的主要技术(细胞培养)
有关概念
细胞贴壁： 培养液中分散的动物细胞，置于适宜的条件下， 能够分裂，这些细胞贴附在培养瓶上，成为细胞贴 壁生长。 细胞的接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就 会停止分裂增殖的现象。
相关问题
1.为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官和组织 做动物细胞培养材料？ 胚胎组织或幼龄动物的组织或器官分裂、增殖旺盛 2.为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？ 分散成单个细胞便于物质交换，使营养物质吸 收及代谢废物排出更容易，利于细胞生长蛋白质， 易被胰蛋白酶催化分解，从而使细胞分离开。
相关问题
4.培养的细胞为何贴壁生长？ 大多数组织细胞不适应悬浮生长，它们必须在固定 的表面生长和分裂 5.动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培 养成生物个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发 育成新的动物个体
二 动物体细胞克隆技术
1.概念：是将动物的一个细胞的细胞核移 入一个已经去掉细胞核的卵细胞中，使其 重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的 胚胎始终发育为动物个体。
有关概念
细胞株：传代培养的细胞一般传至10代左右 细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞 存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生 长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变， 使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细 胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别： 细胞株传代在 40~50代内，遗传物质没有改变；细胞系无限传 代下去，遗传物质改变。
专题2
细胞工程
概念
动 物 细 胞 工 程 常用 技术
应用细胞学的方法，按照人们的 需要和预定的设计，有目的、有 计划地保存、改变动物细胞和创 造新的动物细胞，进而培育成新 的物种或者品种的一门科学技术。 动物细胞培养（基础） 动物细胞融合 单克隆抗体 动物体细胞克隆技术
动物细胞培养
概念动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。
2简介动物细胞培养液的成分体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。
将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。
由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。
[1]动物细胞培养液的特点液体培养基、通常含动物血清。
动物细胞培养的条件1.无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。
此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。
2.营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等）3.血清和血浆(提供细胞生长必须的营养成份)4.温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4）5.气体环境（95%的空气+5%CO动物细胞培养2的混合气体）其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定基本过程取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。
将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。
悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。
当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。
此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。
再配成一定浓度的细胞悬浮液。
另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。
当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。
动物细胞培养
4.干细胞的应用 （1）应用原理：有着自我更新能力及分化潜能的干细胞，与组织、 器官的发育、再生和修复等密切相关。 （2）应用实例： 造血干细胞：治疗白血病及一些恶性肿瘤放疗或化疗后引起的 造血系统、免疫系统功能障碍等疾病
加培养液
细胞悬液
转入
培养瓶内培养 （原代培养）
（ 细胞贴壁长成单层细胞,有接触抑制现象）
1.取动物组织 （1）取材:一般取材于动物胚胎或幼龄动物的组织、器官。 （2）取材原因: 细胞分化程度低，增殖能力强，容易培养
2.制成细胞悬液
（1）将组织分散成单个细胞
①方法: 机械法 用胰蛋白酶、胶原蛋白酶等处理一段时间
细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能 力强，有丝分裂旺盛，老龄动物的细胞则相反。所以，一般来 说，幼龄动物的细胞比老龄动物的细胞易于培养。同样，分化 程度越低的细胞，增殖能力越强，所以更容易培养。
2.动物细胞培养和植物组织培养有什么相同和不同之处？
思考-讨论:
（1）培养前为什么分散成单个细胞？
②原因: Ⅰ.从动物体取出的成块组织中，细胞与细胞靠在一起，彼 此限制了生长和增殖； Ⅱ.能使细胞与培养液充分接触，更易进行物质交换。
（2）用培养液将细胞制成细胞悬液。
去掉组织
（一）
动 物
动物胚胎或 幼龄动物的 组织、器官
间蛋白 胰蛋白酶
单个细胞
剪碎
加培养液
细胞 悬浮液
细
分化程度低， 增殖能力强
胞
①成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖 ②利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。
2023届高考生物二轮复习专题9 考点2 植物细胞工程和动物细胞工程-讲义(通用版)
考点二植物细胞工程和动物细胞工程1．植物组织培养的过程——原理：植物细胞的全能性(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性3．针对二类目标(试管苗、细胞产物)的培养流程4．动物细胞培养(以贴壁细胞为例)——原理：细胞增殖(1)动物细胞培养过程①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
②保障无菌、无毒的措施：对培养液和培养用具进行灭菌处理及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。
③区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。
(2)干细胞5．单克隆抗体的制备——原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖(1)3种细胞特点不同：①B淋巴细胞：能分泌抗体，不能大量增殖。
②骨髓瘤细胞：能大量增殖，不能分泌抗体。
③杂交瘤细胞：既能分泌抗体，又能大量增殖。
(2)2次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。
②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
6．动物体细胞核移植技术——原理：动物细胞核的全能性(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。
②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。
③外界环境可能引起不可遗传的变异。
(2)克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
1．(2017·海南，31)甲、乙两名同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。
回答下列问题：(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是_________________________________________________________________。
动物细胞培养
便于去核。
◆为什么不是取供体 细胞核进行核移植操 作，而是直接将供体 细胞整个注入去核卵
母细胞中？
保证供核不被破坏， 使所得个体的性状
更符合供体。
◆激活 方法：
◆激活 目的：
◆促融方法： 电刺激
构建重组胚胎
◆不是，克隆动物绝大部分 DNA来自供体细胞核，但核 外还有少部分DNA（如线粒 体DNA）来自受体卵母细胞
◆体细胞核移植方法生产 的克隆动物是对体◆细胚胞胎供移 体动物进行了100植%的至复代制孕
吗？为什么？受体内
妊娠、分娩 ◆遗传物质 基本相同
体细体胞细核胞移核植移的植原的理过：程动
物细胞核具有全能性 受精
供体细胞 （供核）
细胞
体细胞
卵
培养
注入
细胞 重组
卵巢卵母细 胞（MⅡ中期：
供质）
去
去核卵 融合 细胞
核
母细胞
生出与供体奶 牛遗传物质基 本相同的犊牛
代孕 胚胎 构建重 母体 移植 组胚胎
共分成两大阶段：核移植和胚胎移植
B母绵羊
A母绵羊
卵细胞
多
乳腺细胞
莉
羊
细胞质 细胞核
的 细胞核移植
融合后的卵细胞
培
卵裂
育
早期胚胎 娠 分娩
多莉羊
1.写出a b所代 黑面绵羊去 表细胞工程名称 核卵母细胞
白面绵羊乳 腺细胞核
：a表示核：移植 b表示：胚胎移植
a
重组细胞 电脉冲刺激
2.实施细胞工程时， 所需受体细胞大多采 用卵母细胞的原因：
体积大，易操作。含有
早期重组胚胎
b
动物细胞培养技术
(微载体) , 使细胞在微载体表面附着和生长, 并通过不
断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体 为细胞提供了极大的附着表面, 1 g 微载体其比表面积
可达6 000 cm2 , 从而可实现细胞的高密度培养。
微载体的直径在60～250μm , 由天然葡聚糖、凝胶 或各种合成的聚合物组成, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。 由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的 粘附特性, 在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质, 因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。采用微载体培养 具有以下优点: ①比表面积大, 单位体积培养液的细胞产 率高; ②采用均匀悬浮养, 无营养物或产物梯度; ③可用 简单显微镜观察微载体表面的生长情况; ④细胞收获过 程相对简单, 劳动强度小; ⑤培养基利用率高, 占地面积 小; ⑥放大容易, 国外已有公司以1 000 L 规模培养人的 二倍体细胞来生产β- 干扰素。但其缺点是搅拌桨及微珠 间的碰撞易损伤细胞; 接种密度高; 微载体吸附力弱, 不 适合培养悬浮型细胞。
胶囊化培养的优点是: ①可防止细胞在培养过程中受 到物理损伤; ②活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜, 从 而提高细胞密度和产物含量, 并方便分离纯化处理。缺 点是: ①微囊制作复杂, 成功率不高; ②微囊内死亡的细 胞会污染正常产物; ③收集产物必须破壁, 不能实现生产 连续化。
2. 固定化方法的选择
其中。血纤维蛋白可以促进细胞贴壁, 因此两种类型的细胞都适
于培养。而且基质高度多孔, 允许大分子物质的自由扩散。但机 械强度差, 对剪切力很敏感。
1. 3
中空纤维
中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态, 利
用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢
动物细胞培养常用方法
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。
而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。
细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。
根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。
如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。
M期完成遗传物质的分配。
因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。
二.培养细胞生命期（life span of culture cells）很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。
索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。
培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。
人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。
如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。
只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。
正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。
三.培养细胞一代生存期培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。
每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。
传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。
动物细胞培养
典型过程培养
动物细胞培养
低温下CO2溶解度增加，引起 溶解度增加，引起pH 温度 低温下 变化。 变化。 黏度 培养基的黏度主要受血清含量 的影响。 的影响。在搅拌条件下黏度大则细胞受 损伤小。 损伤小。加入羧甲基纤维素或聚己烯基 吡咯烷增加培养基黏度
典型过程培养
动物细胞培养
细胞培养基的基本组成 1、水 、 细胞培养用的各种液体都要用水来配置， 细胞培养用的各种液体都要用水来配置，对水 的纯度要求很高。 的纯度要求很高。通常细胞培养用水的污染物 标准可参考医药上注射用水标准， 标准可参考医药上注射用水标准，单原则上应 高于注射用水标准。 高于注射用水标准。 2、能源和碳源 、 主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。 主要是糖和糖酵解的产物和谷氨酰胺。细胞能 用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。 用的糖主要是六碳糖，特别是葡萄糖。葡萄糖 很容易被大多数细胞转化为乳酸。 很容易被大多数细胞转化为乳酸。昆虫细胞更 偏爱蔗糖。 偏爱蔗糖。在多数培养基中谷氨酰胺作为主要 的能源和碳源。 的能源和碳源。使用谷氨酰胺最大的问题是它 的自发降解，降解量与时间、温度、 的自发降解，降解量与时间、温度、血清和磷 酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。 酸浓度有关，降解产物为氨，对细胞有毒性。
典型过程培养
动物细胞培养
转化细胞由于有无限寿命， 转化细胞由于有无限寿命，在培养中更 易生长，被广泛用于生成生物制品， 易生长，被广泛用于生成生物制品，如 重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是， 重组蛋白药物、病毒疫苗等。但是，人 们对她们的安全性仍然非常关心， 们对她们的安全性仍然非常关心，对可 能造成的生物危害性进行严格的检测和 控制。 控制。
典型过程培养
动物细胞培养
一、动物细胞培养的特性 动物细胞培养是指在合适的培养条件下， 动物细胞培养是指在合适的培养条件下， 动物细胞离体生长和增殖， 动物细胞离体生长和增殖，并保持其特性 和功能的技术，这些细胞不再形成组织。 和功能的技术，这些细胞不再形成组织。
动物细胞培养
（2）消化分离法
组织消化法是在把组织剪切成较小体积的基础上，应用 生化和化学手段进一步分散组织的方法。 1）胰蛋白酶（Trypsin ）消化法 胰蛋白酶适于消化细胞间质较小的软组织，如胚胎组织、 羊膜、上皮组织、肝、肾等软组织，对传代细胞也非常好。 2）胶原酶（Collagenase）消化法： 胶原酶是一种由细菌中提取出的酶，对胶原有很强的消化 作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。上皮 细胞本身对胶原酶有一定耐性，但胶原酶对细胞间质有好的 消化作用，可使上皮细胞与胶原成分脱离而不受伤害，效果 甚好。
移液器
离心机
酶标仪
微孔板震荡器
液氮罐
（二）动物细胞的体外培养一般条件
1、恒定的温度: 37 ℃
2、pH：最适为7.2～7.4
3、气体：需要O2、CO2 （95%空气、5% CO2） 4、营养：要求高，需要氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌 呤、嘧啶、激素和生长因子等。
（1）血清：
主要为牛（胎牛、新生牛、小牛）、马、鸡、兔、羊、
每代细胞（群体）要经过四个生长阶段：
1、潜伏期（latent phase）： 接种——悬浮——贴附——不马上分裂（潜伏）。 潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用培养基 性质有关。 2、对数生长期（logarthmic growth phase）： 分裂旺盛、分裂相增多（其数量标志分裂的旺盛 程度）。 细胞分裂指数（mitotic index, MI）: MI=(分裂相个数∕1000个细胞) ×100% 。
动物细胞体外培养
Animal cells cultured in vitro
一、基本概念
动物体内取出组织，分离出单细胞，在体外 模拟机体内的生理条件，建立无菌、适温和一 定的营养条件，使之生长和生存，并维持其结 构和功能的技术，称动物细胞体外培养。 是动物细胞工程的重要技术基础：细胞融合、 组织工程、胚胎工程、干细胞工程、动物克隆、
动物细胞培养(三佰)PPT
细胞分裂是指活细胞增殖及其数 量由一个复制最初的DNA分子， 使遗传信息传递给下一代，是保 证物种稳定的基础。
细胞培养的环境因素
01
02
03
温度
维持一定的温度是细胞培 养的基本要求，因为温度 变化会影响细胞的生长和 代谢。
湿度
培养箱内的湿度应维持在 95%左右，以保证细胞的 正常代谢。
气体环境
细胞系建立与保存
筛选与鉴定
01
从原代细胞或传代细胞中筛选具有特定生物学特性的细胞系，
并进行鉴定。
细胞系建立
02
将筛选出的具有特定特性的细胞系进行培养，建立稳定的细胞
系。
细胞系保存
03
将建立的细胞系进行低温冷冻保存，确保细胞的遗传稳定性和
生物学特性。
细胞克隆技术
细胞克隆
在培养过程中，将单个细胞从群体中分离出来，并在培养瓶中形 成单克隆细胞群。
详细描述
异常的形态和功能可能是由于培养条件不适、基因突变等因 素引起的。为解决这一问题，需要密切观察细胞形态和功能 变化，调整培养条件，并采用适当的检测方法。
细胞传代过程中的变异问题
总结词
在动物细胞培养过程中，传代过程中可能会出现细胞变异问题，影响实验结果。
详细描述
变异可能是由于基因突变、染色体畸变等因素引起的。为解决这一问题，需要采用适当的检测方法，如基因突变 检测、染色体分析等，以确保细胞的稳定性和可靠性。同时，也需要优化传代方法，减少对细胞的损伤和变异的 可能性。
动物细胞培养(三佰)
• 引言 • 动物细胞培养的基本原理 • 动物细胞培养的过程 • 动物细胞培养的挑战与解决方案 • 动物细胞培养培养的定义
动物细胞培养是指在体外人工模拟体 内环境，将动物细胞种植在适宜的培 养基中，使其保持生长和繁殖的技术。
04动物细胞培养-HXY共98页文档
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质 常突起，呈活跃游走或变形运动，方向 不规则。此型细胞不稳定，有时难以和 其他细胞相区别。
4、多形型细胞：
有一些细胞，如神经细胞难以确定 其规律和稳定的形态，可统归于此类。
（二）悬浮型细胞：
见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病 细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这 类细胞容易大量繁殖。
来源：血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好，细胞圆形、单个或小细胞 团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消 化)，易于收获，可获得稳定状态 缺点：纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离
• 4.1.2 培养细胞的生长特点
• 1.贴附
• 贴壁→伸展
• 影响因素：
–钙离子 –机械、物理因素 –生物因素
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• （2）胚胎提取液：鸡胚、牛胚提取液，能促进 细胞生长。来源有限。不常用。
• （3）水解乳白蛋白：是乳白蛋白经蛋白酶和肽 酶水解后的产物，含丰富氨基酸。用Hanks液配 制成0.5%溶液，与合成培养基按比例混合使用。 多用于细胞系和原代细胞的培养。
• （4）胶原：胶原是从动物真皮或大鼠尾腱中提 取的，具改善细胞表面特性促使其附着生长的作 用。
–潜伏期
–指数生长期
–停止期
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1．潜伏期
游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞 变为圆球形
吸附:贴附底物,一般24小时内贴 壁
潜伏:可有运动活动,基本无增 殖, 少见分裂相
2．指数生长期：
细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。
细胞活力最旺盛的阶段，培养物中细胞数量 呈指数增长,细胞群体均一，是理想的实验用 细胞
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细胞污染处理
病毒：由于病毒寄生生存，爆发后尽快 和正常细胞隔离，灭菌后丢弃处理，相 对来说容易处理，但是对操作者威胁较 大。
细胞污染处理
真菌（霉菌和酵母菌）：目前没有好的 抑制方法，包括现在常用的两性霉素， 一旦污染容易反复爆发，因为孢子很难 杀灭。
细胞污染处理
支原体：支原体污染后，因为它们不会 使细胞死亡可以与细胞长期共存，培养 基一般不发生浑浊，细胞无明显变化， 外观上给人以正常感觉，实则细胞已经 受到多方面潜在影响，如引起细胞变形， 影响DNA合成，抑制细胞生长等。污染 细胞应灭菌后丢弃处理.
其他:
密封, 防止上冻, 时间尽量短
细胞污染及处理
微生物: 细菌、真菌（霉菌和酵菌）、 病毒、 支原体 化学物质 细胞交叉污染
细胞状态观测与检测
时刻观察细胞形态,密度 观察培养基颜色，透明度 培养温度，CO2浓度 无菌检测 病毒检测 内毒素检测 支原体检测
细胞污染途径
抗生素:5-10倍常用量 霉菌:25ug/ml制霉菌素 或 10ug/ml 酮 康唑 加温 支原体: 410C ,5-10h 动物体内接种
细胞污染处理
细菌：细菌污染后，培养基1-2 天就会 变色，应迅速将污染细胞与其它细胞系 隔离，灭菌后丢弃， 还要用实验室消毒 剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA 过 滤器。
空气 器材 操作 血清 组织样本
细胞污染的影响
培养基浑浊 细胞生长缓慢 细胞活性较低 细胞病变或死亡
污染细胞抢救
抗生素:5-10倍常用量 霉菌:25ug/ml制霉菌素 或 10ug/ml 酮 康唑 加温 支原体: 410C ,5-10h 动物体内接种
污染细胞抢救
合成培养基
液体 干粉
血清
FBS FCS 新生牛血清 人自体 AB 灭活：560c，30min
细胞计数
计数板： 充分混匀,
计上不计下， 计左不计右， 每个象限不少于50个细胞， 多次计数取平均值。
细胞的运输
细胞株:
最好370C, 瓶内留有空气, 防震防压, 时间尽量短
合成培养基
合成培养基: 根据细胞生长的需要按一定配方制成的 粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生 素、碳水化合物、无机离子和其他辅助 物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细 胞外液相似。
合成培养基
合成培养基（化学成分清楚） 合成培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基， 组分稳定，可大量供应。合成培养基发展至今已有几 十种，大部分已商品化。由于细胞种类和培养条件不 同，适宜的合成培养基也不同，在动物细胞培养中最 常用培养基7－8种，如BME、MEM、DMEM、IMEM、 HAM F12、PRMI1640、M199等。 由于天然培养基的一些成分仍然不清楚，不能用 已知的化学成分代替，因此必需在合成培养基中添加5 ％~10％的小牛血清。在杂交瘤培养中，要求更严格， 添加浓度更高，一般为10％～20％的胎牛血清。血清 的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和 检测会组成一定的不便。
四、培养基的分类
无血清培养基 无血清培养基（serum free medium, SFM）是全部用已知成分组 配的不加血清的合成培养基，通常在含有细胞所需营养和贴壁因 子的基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，保证细胞良好生 长，是最适合于制药生产的培养基。它提高了培养的质量，避免 了使用血清带来的麻烦：血清中某些细胞毒性成分，血清中存在 病毒、真菌、支原体等微生物污染的危险，血清中蛋白对产物蛋 白测定的干扰。产品纯化容易，组分稳定，可大量配制。已有各 种无血清培养基上市。 一些合成培养液可以作为无血清培养液的基础，如CMRL 1060、TC199、IMDM、McCoy 5a、Ham’s F10和F12。已有其他 商品化的无血清培养液，如淋巴细胞无血清培养基、内皮细胞无 血清培养基、杂交瘤细胞无血清培养基、巨噬细胞无血清培养基 等。 无血清培养基通常添加生长附加成分，如激素与生长因子、 低分子营养成分和转铁蛋白等，主要包括胰岛素、孕酮、硒酸钠、 腐胺、转铁蛋白。对于大规模生产用的无血清培养基，往往成分 不完全清楚，但简单而且低成本。
谢谢!
细胞传代
消化液：胰蛋白酶（含或不含EDTA）， 吹打 传代比例:视生长情况，防止细胞生长过 密
细胞冻存和复苏
冻存液：DMSO 冻存条件：-80；液氮 原则：缓冻速溶
细胞生长条件
无污染 无毒 营养: 细胞培养的培养基必须供给活细胞所需要的全 部盐类、氨基酸、脂肪、糖类、维生素,生长因子等。 温度:35-37 0c 渗透压:人:290mmol/L Ph: 7.2～7.4 CO2:5%
培养瓶的选择
透气盖 不透气盖 瓶底包被的基质 吹打时避免碰到瓶底细胞生长一侧
培养基
天然培养基 合成培养基 无血清培养基
天然培养基
天然培养基（小牛血清、胚胎液）: 是最早期人们采用的细胞培养基，直接取自于动物组 织提取液或体液作为培养基，如血浆凝块、血清、淋 巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，但成分复杂，而 且不稳定，来源也受到限制，不宜大量培养和生产使 用。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然培养基，富 含氨基酸。 血清是天然培养基中最有效和最常用的培养基，有些 成分功能明确，另外一些成分功能不明确。血清的来 源有胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、 羊血清及人血清，最广泛应用的为胎牛血清和新生牛 血清。血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及 传代细胞培养。
动物细胞培养相关知识
哺乳细胞种类
原代培养： 传代培养：细胞系和细胞株 细胞系（cell line） ：初代培养物开始第 一次传代培养后的细胞 细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克 隆形成法从原代培养物或细胞系中获得 具有特殊性质或标志物的培养物称为细 胞株
细胞种类
贴壁细胞：贴壁,伸展,接触抑制,密度限 制 悬浮细胞: 血液白细胞