慢病毒转染手册
慢病毒转染
慢病毒转染
1、实验前一天，以每毫升3-5×10 4个目的细胞接种96孔培养板中的12孔，体积为90ul。
（不使用边上的孔，保持细胞状态良好）
2、感染预实验共分为四组，每组三个不同的MOI：1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml
3、实验开始，配备1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml，如病毒滴度为1×108TU/ml，取5ul病毒液稀释到45ul的ENi.S.中，在进行一次10被稀释即可。
4、取2ul10mg/mlpolybrene稀释到400ul，备用。
5、将10ul三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。
6、再设定需要添加polybrene的孔中加入10ulpolybrene稀释液。
7、混匀后继续培养，8-12小时候观察细胞生长状态，并更换为新鲜培养基。
8、感染3-4天后，观察荧光表达情况。
9、通过细胞感染效果，确认目的细胞的感染条件和感染参数。
选取效果最优的一组实验条件按相同的实验方法进行正式转染实验。
慢病毒转染步骤
转染法步骤：
1分至适宜浓度的细胞到六孔板中，次日细胞应30%~50%融合
2.第二天，吸掉板中的生长培养基并加入新的含聚凝胺的培养基，加入适当数量的病毒于细胞中（见“决定慢病毒效价”部分），每孔溶液终体积为3ml
注意：考虑到细胞在自旋过程中不一定能完全被培养基覆盖，不推崇减少六孔板中的溶液终体积。
调整孔中聚凝胺的终浓度为8mg/ml.通过涡旋六孔板轻轻地混合培养基，病毒以及聚凝胺。
3.为减少自旋-转染过程中悬浮物质的形成以及孔与孔之间液体接触的情况发生，用无菌微孔密封膜封闭六孔板（直接盖在板上），封闭好后，再在密封膜上加上一层未经灭菌的密封箔，最后盖上六孔板盖。
4.在标准的组织培养离心机中，37°C，2250rpm（1200g）条件下自旋-转染细胞60min.
5.一自旋-转染后就移走密封膜和密封箔，将孔中原有的培养基换为新鲜的生长培养基（每孔2ml就足够）
6.转染24h后，吸掉孔中的培养基并每孔加入新鲜的含有嘌呤霉素的2ml生长培养基。
注意：嘌呤霉素的浓度应被每个细胞株充分利用，一般规定在1-5μg/mL
7.进一步的培养时间主要取决于细胞株的类型以及转染后的实验分析。
通常，嘌呤霉素筛选细胞需要大约48h。
下面推荐的是结合给定的细胞株和分析实验来得到的嘌呤霉素筛选
时间
>转染后实验分析嘌呤霉素筛选细胞时间> mRNA knockdown (qPCR) 2+ days
> Protein knockdown (Western) 3+ days
> Phenotypic assay 表型分析3+ days
8.检测目的感染细胞的表面分子。
小RNA转染,慢病毒转染
三、RNAi转染真核细胞1、lipo2000（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1）将覆盖率为30-50%（低密度转染细胞可以使转染和分析之间的间隙更长）的细胞提前用only饥饿3h，转染前换新鲜培养液。
（2）取质粒100pmol稀释到250μl的only体系中，同样取lipo2000试剂5μl稀释到250μl的only体系中，室温静置lipo2000稀释液5min（注意避免不要使lipo2000直接接触塑料且静止时间不要超过5min）。
（3）5min后将质粒稀释液加入到lipo2000稀释液中，颠倒混匀后室温静置20min （注意不要超过20min）。
（4）将孵育好的混合物缓慢匀速加入6孔板中，且最好边加边晃动板子，避免lipo2000局部毒性对细胞造成损伤。
（5）加完后放入37℃培养箱内培养，转染6h后更换新鲜培养液。
（6）24h显微镜下观察细胞状态及时处理（如荧光强弱、传入10cmdish内等），如需药筛48h后即可加药，筛选稳定克隆。
2、Fugene（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1）取覆盖率为80-90%细胞更换新鲜培养液。
（2）将3 μg的DNA稀释到150 μl的only中（2）取fugene 9μl加入到上述DNA稀释体系中，室温孵育12min。
（3）将孵育好的混合物缓慢加入6孔板内，边加边晃动。
（4）24h后观察细胞状态换液，48h后可以进行药筛筛选克隆。
四、慢病毒转染1、实验前的准备（1）质粒的准备：目的质粒；包装质粒1.0和包装质粒2.0提质粒时注意用去内毒素的试剂盒提取质粒，根据自己的用量提取质粒，并测浓度。
（2）293T细胞的准备293T细胞是一种易于转染的工具细胞，可作为病毒包装的细胞，在10cm的dish中铺好293T 细胞，并待铺到80%时，就可以转染了。
（3）转染试剂的准备转染293T时，用普通的转染试剂（本组用lipo2000和Fugene），本组的转染试剂转染10cm的dish时约需50μl，因此实验前应确认转染试剂是否充足。
慢病毒使用手册
慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。
与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。
本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。
一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。
慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。
另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。
二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。
构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。
基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。
包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。
包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。
将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。
经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。
三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。
1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。
通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。
2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。
外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。
慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。
3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。
通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。
此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南操作指南：慢使用1、简介1.1 背景介绍1.2 慢的定义1.3 慢的应用领域2、仪器与材料2.1 实验室安全设备2.2 实验室试剂和材料2.3 慢载体和质粒3、慢的生产3.1 慢生产细胞系的选择3.2 质粒构建与筛选3.3 慢包装细胞的构建与筛选3.4 慢的生产与扩增4、慢的感染4.1 细胞培养与准备4.2 慢感染的条件优化4.3 慢感染的时间和浓度控制5、慢的转染5.1 细胞转染前的处理5.2 转染的操作条件5.3 考虑的转染效率和细胞毒性问题6、实验细胞系的维护6.1 细胞的培养和传代6.2 细胞的冻存与恢复6.3 实验细胞系的检测和验证7、实验数据记录与分析7.1 实验数据的记录和整理7.2 数据分析方法与软件使用7.3 结果的展示和解释8、安全注意事项8.1 实验操作安全措施8.2 废液处理及废弃物管理8.3 慢实验室传播的预防措施9、附件9.1 相关实验记录表格9.2 质粒和慢载体序列信息法律名词及注释：1、载体：在基因工程中，指用来携带或传递目标基因的DNA或RNA分子。
2、质粒：指自主复制的独立DNA分子，可被插入或移除目标基因，用于基因克隆、表达和操控等实验。
3、细胞培养：通过体外培养细胞的技术，提供实验所需的可控环境和条件。
4、转染：将外源DNA或RNA导入细胞内，使其表达或转录的过程。
5、传代：将细胞从一个培养器转移到另一个培养器，以维持细胞系的生长。
6、冻存：将细胞以特定的方法冷冻保存，以备将来使用。
7、废液处理：对实验过程中产生的含有有害或感染性物质的废液进行妥善处理，避免对环境和人体造成危害。
8、废弃物管理：对实验中产生的废弃物进行分类、包装和处理，符合相关法规和标准。
本文档涉及附件：1、慢生产记录表2、慢感染实验记录表3、细胞培养和传代记录表4、实验数据分析表格本文所涉及的法律名词及注释：载体、质粒、细胞培养、转染、传代、冻存、废液处理、废弃物管理。
慢病毒转染增强剂说明书
慢病毒转染增强剂说明书慢病毒转染增强剂说明书产品描述:Polybre ne （聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA专染实验以增强脂质体的转染效率。
Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。
Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂）, 常用来生产非特异性凝集的红细胞。
另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。
PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。
注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试［1］。
基本属性：另U 名：1,5-dimethyl-1,5-diaza un decamethyle ne polymethobromideCAS No.: 28728-55-4纯度：》94% （titration）溶解方法：溶于水，溶解能力高达10% 0.9%Nacl溶液配制1mg/mL的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。
保存与稳定性：粉末2-8 C保存，避免潮湿。
1mg/mL储存液2-8 C, 至少一年保持稳定。
操作步骤(仅作参考)：实验1逆转录病毒感染(Retroviral Infection )(1)重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基(5%血清) 加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。
孵育24h后，吸去培养液并用0.45卩m滤器过滤。
(2)待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5X 105/盘。
(3)病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。
用含polybrene 的2ml病毒上清(或将病毒原液稀释到2ml)感染细胞，polybrene 的终浓度为5卩g-10卩g/ml。
lentivirus generation 慢病毒转染手册
Generation o f L entivirusReagents•293T: ATCC•Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001•FBS: Invitrogen cat# 16000-044•DMEM: Invitrogen cat# 11965-118•Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155•L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156•Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050•Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024•Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058293T/fibroblast media (500 mls):DMEM (450 ml)10% FBS (50 ml)Pen/strep (5ml)L-glutamine (5ml)NEAA (5 ml)Reagent setupLentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectorsA. Production of Virus1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cellsreach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection.2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorftube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.Second generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMD2.G 5 ugpsPAX2 5 ugThird generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMDL g/pRRE 5 ugpRSV-Rev 2.5 ugpMD2.G 2.5 ug3. Add transfection mixture dropwise to cells; incubate 4 hrs to overnight (16 hours) andreplace with fresh medium.4. Collect virus-containing medium 48 hours after transfection and replace with freshmedium. Collect virus every 12 hours for up to 3 times total. Keep all viral media at 4Cuntil all collections are done. Pass viral media through a 0.45uM low protein-binding filter.At this point, the viral supernatant can be used to infect cells, frozen at -80C orconcentrated.Concentration using Amicon Ultra Centrifugal Filters:Transfer viral supernatnat to Amicon Filter and spin filter in tabletop centrifuge at 3000 rpm for 10-20 min at 4C. Concentrated virus can be aliquoted and stored at -80C. Thaw analiquot on ice before use; do not refreeze.Concentration by ultracentrifugation:1. Transfer viral supernatant to 33ml Beckman ultracentrifugation tubes and spin for 2hrs at 24,000 rpm using SW32Ti or SW28Ti.2. Pour off supernatant carefully and resuspend viral pellet using 100-ul pipette tip withappropriate amount of DMEM to concentrate virus 100x. It may take 30 min toovernight at 4C for the pellet to completely dissolve.3. Store virus in aliquots at -80C. Thaw an aliquot on ice before each use; do notrefreeze.。
慢病毒专用转染试剂说明书
慢病毒专用转染试剂LentiFit TM使用说明书产品简介：LentiFit TM脂质体转染试剂是一种高效的阳离子脂质体转染试剂。
与其他脂质体转染试剂相比，汉恒生物独立研发的LentiFit TM脂质体转染试剂具有转染效率高，重复性好，操作简单，无明显细胞毒性，抗血清干扰等优点。
对于大多数细胞，用LentiFit TM转染后72小时内不更换培养液无明显细胞毒性。
同时，血清的存在不影响LentiFit TM的转染效率，这样可以减小无血清对细胞的损伤。
基于以上优点，LentiFit TM常用做慢病毒包装的转染试剂。
包装清单以及储存条件：试剂名货号储存条件规格有效期LentiFit TM转染试剂Let10004℃保存 1 mL12个月使用方法：1.细胞培养：以1个10 cm培养皿转染293T细胞为例，转染前一天接种细胞(20-24小时)，接种细胞约3.5×106，接种体积10 mL，确保第二天转染时细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。
2.在进行转染步骤前，把10 cm培养皿中的培养液更换成新鲜细胞培养液，培养液的体积为5 mL，放回培养箱中继续培养，并准备转染体系（步骤3-6）。
3. 把LentiFit TM脂质体转染试剂轻轻混匀。
4. 对于待转染的10 cm培养皿中的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入24 µg质粒（目的质粒和辅助质粒的比例根据不同包装系统进行调整）到500 µL DMEM溶液，用枪轻轻吹打混匀。
5. 取另一只洁净无菌离心管，加入500 µL DMEM溶液，再加入40 µL LentiFit TM，用枪轻轻吹打混匀,室温放置5分钟。
6. 将步骤4与5中的质粒溶液与LentiFit TM溶液混合，用枪轻轻吹打混匀。
不可V ortex 或离心。
室温孵育20分钟。
有可能出现絮状沉淀物，属正常现象，不会影响转染效率。
7. 将转染复合物逐滴加入到培养皿中，轻轻“8”字形摇晃混匀后，放回培养箱继续培养。
汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版
2. 感染细胞最佳 MOI 的测定 MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒
数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。 对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293 细胞，MOI=1～3 时，80%以上的细胞均表 达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
四、慢病毒包装和浓缩 （一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进 行质粒的大量去内毒素抽提。 （二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25% 胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞 于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪 用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打 可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将 所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢 弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为 37~42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套， 防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养 基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长 情况。
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
悬浮细胞慢病毒转染步骤及方法
实验材料与方法
一、细胞培养人红白血病细胞Kasumi-1，常规培养使用含10% FBS(GIBCO)的RPMI 1640 培养基（Hyclone）（含1.5 mg/L-Glutamine，100 U/mL Penicillin，100 μg/mL Streptomycin) 中，37ºC 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
二、病毒侵染实验材料及试剂
DMEM培养基+ 10% FBSRPMI 1640培养基+10% FBSD-Hank’s Solution96孔板（Corning）24孔板（Corning）Lentivirus-病毒液（GenePharma，1×108 TU/mL）步骤1. 稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基）400 μL + 终浓度5 μg/mL Polybrene，将慢病毒原液按1:20、1:10、1:5 加入到稀释液中；
2. 24-well，按4×105 cells/well（根据细胞种类调整），1000 RPM 3min，取细胞沉淀。
将Step 1 中各份病毒稀释液分别与每份细胞沉淀重悬，同时建立对照（blank、negative），37°C 5% CO2中培养；
3. 12~24h 后离心移去细胞侵染后的病毒液，加入0.5 mL 完全培液，37°C 5% CO2过夜
4. 根据细胞状态和类型，如果必要分出1/3~1/5，加入0.5 mL完全培养，继续培养24~48h；荧光倒置显微镜下观察结果。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒转染操作
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
慢病毒转染增强剂说明书
慢病毒转染增强剂说明书产品描述:Polybre ne （聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA专染实验以增强脂质体的转染效率。
Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。
Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂）, 常用来生产非特异性凝集的红细胞。
另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。
PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。
注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试［1］。
基本属性：另U 名：1,5-dimethyl-1,5-diaza un decamethyle ne polymethobromideCAS No.: 28728-55-4纯度：》94% （titration）溶解方法：溶于水，溶解能力高达10% 0.9%Nacl溶液配制1mg/mL的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。
保存与稳定性：粉末2-8 C保存，避免潮湿。
1mg/mL储存液2-8 C, 至少一年保持稳定。
操作步骤(仅作参考)：实验1逆转录病毒感染(Retroviral Infection )(1)重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基(5%血清) 加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。
孵育24h后，吸去培养液并用0.45卩m滤器过滤。
(2)待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5X 105/盘。
(3)病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。
用含polybrene 的2ml病毒上清 (或将病毒原液稀释到2ml)感染细胞，polybrene 的终浓度为5卩g-10卩g/ml。
37° C孵育3-6h。
慢病毒包装及质粒转染手册
使用Fugene进行慢病毒包埋步骤
注意：所有操作必须在BSL-2实验室环境进行
第一节：制作慢病毒存储液
293FT细胞的培养：细胞每周按照1:4 - 1:6的比例传代3次，保持其融合度在50%以下
第1天293FT铺板
以30%融合度左右进行10cm皿铺板，37°C, 5% CO 2条件下培养24小时
第2天转染
本实验中pcmv△R8.91:PLP-VSVG :DNA=2:2:2, Total DNA:PEI=1:3
2. 试管2：对每管的转染试剂，加入570ul Opti-MEM,将30ul Fugene加入试管正中
心，避免接触任何管壁，轻轻振荡（不能使用移液器），室温下孵育5min.
3. 将加入Opti-MEM- Fugene混合液加入试管1(DNA)，轻轻震荡混匀。
4．短暂离心使管壁液体流下。
5.室温下孵育15分钟
6. 15分钟后，将Optimem/DNA/Fugene加入细胞，摇动培养皿混匀。
7. 37°C, 5% CO 2培养过夜（12-16小时）
第3天换液
第4天。
慢病毒转染PROTOCOL
慢病毒转染PROTOCOL第一天病毒感染前24 小时将细胞置于12 孔板。
加入 1 ml 适当的完全培养基（含有血清和抗生素）孵育过夜。
在传染当天细胞应该达到约50％平铺（Day 2）。
注意：也可用其它型号培养板转导。
这样需要根据孔径或培养板调节细胞量。
第二天准备完全培养基和Polybrene? (sc-134220) 混合物，Polybrene 终浓度为：5 μg/ml。
移去培养基并添加1 ml Polybrene/培养基混合物于每孔中（适用于12 孔板）。
注意：Polybrene 是一种聚阳离子，可以中和电荷以促进假病毒外壳与细胞膜的作用。
Polybrene 最佳浓度因不同细胞株而异并应根据经验而定（通常范围为2-10 μg/ml）。
过长时间暴露于Polybrene （> 12 小时）可对某些细胞产生毒性作用。
在室温下溶化慢病毒颗粒，使用前轻轻混匀。
培养液中加入shRNA 慢病毒颗粒以感染细胞。
轻轻振动培养板使其混匀并孵育过夜。
病毒颗粒使用量因细胞株的特点而有较大不同。
注意：溶化的shRNA 慢病毒颗粒置于冰上。
反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。
注意：当你是第一次转导shRNA 慢病毒结构进入细胞，我们建议你用几个不同剂量的shRNA 慢病毒颗粒。
此外，我们建议你用一孔shRNA 慢病毒颗粒转导的细胞作对照（sc-108080）。
注意：用copGFP 对照慢病毒颗粒：sc-108084 观察转导效率。
第三天移去培养液并添加1 ml 完全培养基（不含Polybrene）。
孵育细胞过夜。
第四天欲选择稳定表达shRNA 的克隆，根据细胞类型不同将其分成1:3 到1:5 并继续在完全培养基中孵育24-48 小时。
第五－六天及以后用Puromycin dihydrochloriede (sc-108071) 筛选稳定表达shRNA 的克隆。
Puromycin 筛选法：用足够剂量的Puromycin 杀死非转导的细胞。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册：1 慢病毒使用操作2 慢病毒安全使用规范3 悬浮细胞感染方法概要4 相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ)5 细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C． Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
慢病毒转染
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA 启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基,培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技(上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料(一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒.1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM （含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0。
25％的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时,去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中.3、细胞计数，将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释）,即为实际 n万/mL 细胞浓度.4、细胞离心,1000rpm，5min。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。
本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。
一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。
慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。
这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。
二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。
2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。
三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。
2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。
3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。
4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。
5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。
6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。
四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。
2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。
3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。
4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。
5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。
6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。
如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。
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慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。
慢病毒载体慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。
慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。
慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。
慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。
为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
慢病毒载体与其它常见病毒载体的特征比较目前常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。
逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。
与其它逆转录病毒相比，慢病毒（LV）具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。
慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工具。
慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象。
[1]系统的目的与意义● 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
● 进行稳转细胞株的筛选；● 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；解决的问题● 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。
● 进行稳转细胞株的筛选；● 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液；在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
细胞相关的实验实验目的对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
实验流程1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA 的重组载体；2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒；3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T 细胞，进行病毒包装和生产，收集病毒液；4. 浓缩、纯化病毒液；5. 用高质量的病毒液感染细胞；6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果；7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。
病毒液足够用于一般的动物活体实验。
慢病毒使用操作手册1慢病毒使用操作2慢病毒安全使用规范3悬浮细胞感染方法概要4相关专业术语5细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1慢病毒的储存与稀释:1.1.1病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C．Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
1.2.2.2以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。
第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。
亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积，以期获得最佳的感染效率。
第二天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验a使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基b吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不用换液）c在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液d混匀后放于二氧化碳培养箱（37℃、5%CO2）孵育过夜注：感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大，所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的混合液直接加入培养器皿中慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高MOI 值可以提高病毒的感染效率，但是当MOI高于20时，我们建议客户在培养基中加入ploybrene（8 μg/ml 左右）来提高病毒的感染效率。
A．第三天，更换培养液：一般在24小时候后将含有慢病毒的培养液更换成正常培养液；在感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而影响细胞生长状态，可以最短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建议在8-12小时更换为宜）。
第一次换液后，如果慢病毒对细胞没有明显毒性作用，按照正常培养条件培养换液。
B．第六天，感染效率检测：在倒置荧光显微镜观察荧光，估计慢病毒感染目的细胞的效率；如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Gene的，可以通过Real-time RT-PCR检测目的基因的表达来拍评估感染效率。
注意：Invabio提供的病毒载体上带有GFP 绿色荧光蛋白，用户可以在病毒感染96小时后用倒置荧光显微镜观察GFP 绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感染情况。
如果慢病毒载体携带其他Marker Gene如RFP\BFP可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时间较长，建议感染后96小时后观测荧光表达。
感染后的细胞可以连续培养一周，通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。