噬菌体展示技术操作步骤
噬菌体展示技术的原理及应用
8、 DNA结合蛋白：
锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结 构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别 和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用 于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指 的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸 序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞 系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干 扰病毒感染插入的片段是从 某些组织或细胞中抽提的mRNA 的互补DNA 片 段,它用来筛选与受体特异性结合的片段。一般可 利用M13 噬菌体或其他表 达一部分真核蛋白,而M13 噬菌体和其他E. coli噬 菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明,没有一 个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论 如何,噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质 之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展 示提供了一个应用免疫学方法进行酶：
例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等
6、底物与抑制剂：
主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7、信息传递研究:
利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如 凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促生素、 αbungarotoxin， 和一些大蛋白分子中的折叠区域， 如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离 到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的 多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的 高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体 信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛 选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
一、发展简史
Dulbecco等提出了在病毒表面展示外源抗原 决定簇和肽的概念。 1985年Smith — 首次利用基因工程技术将 EcoRⅠ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与 pⅢ基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增 生，表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面，并提出通过构建随机 肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选 溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一 个广泛应用的时代。
详细叙述噬菌体展示技术的原理与操作流程
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噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究
噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究一、概述在生物医学领域中，脑靶向递药系统一直是研究的热点和难点。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效进入大脑，从而限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。
开发新型的脑靶向递药技术，对于提高药物在脑部的浓度和疗效，降低副作用具有重要意义。
噬菌体展示技术以其独特的优势在药物研发和生物医学领域得到广泛应用。
该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。
利用噬菌体展示技术，我们可以筛选到与特定靶标具有高亲和力的多肽或蛋白，为药物研发和疾病治疗提供新的候选分子。
本研究旨在利用噬菌体展示技术筛选具有脑靶向功能的多肽，并将其修饰到纳米粒表面，构建新型的脑靶向递药系统。
通过优化筛选条件和方式，我们成功获得了多个具有脑靶向功能的多肽序列，并通过实验验证了其脑靶向性。
我们还将这些多肽以共价连接的方式修饰到聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物（PEGPLGA）纳米粒表面，以提高药物的稳定性和脑部递送效率。
本研究不仅为脑靶向递药系统的开发提供了新的思路和方法，还为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的候选药物和递送策略。
通过进一步的研究和优化，我们相信这种新型的脑靶向递药系统将在未来为更多的患者带来福音。
1. 介绍脑靶向药物递送的重要性与挑战脑靶向药物递送是神经科学领域的一个关键研究方向，对于治疗脑部疾病具有重要意义。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效穿透并进入脑组织，这使得脑内疾病的治疗面临着巨大的挑战。
开发高效的脑靶向药物递送系统成为当前研究的热点和难点。
脑靶向药物递送的重要性主要体现在以下几个方面：对于脑部疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、脑肿瘤等，有效的药物递送能够显著提高治疗效果，改善患者的生存质量。
脑靶向递送系统能够实现药物的精准定位，减少对其他组织器官的副作用。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术1985年，Smith G P第一次将外源基因插入丝状噬菌体f1的基因Ⅲ，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而创建了噬菌体展示技术。
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，即在噬菌体表面展示特定蛋白质，而在噬菌体核心DNA中则含有该蛋白的结构基因。
另外，这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来，可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。
近年来，随着噬菌体展示技术的日益完善，该技术在众多基础和应用研究领域产生的影响已日渐明显。
1 噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。
肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。
所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。
2 噬菌体展示系统2.1 单链丝状噬菌体展示系统（1）PⅢ展示系统。
丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。
每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和CT 3个功能区域，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。
其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端。
PⅢ有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。
噬菌体展示
测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI (噬菌体数/细菌数)值远低于1时（即细菌过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。
正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。
低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。
1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5）。
2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。
保存于45℃备用。
3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。
每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
6. 每管加入10 μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。
7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。
适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
8. 待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。
9. 检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。
然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 μl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。
根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。
在这些情况下，可先将噬菌体库在液相中与靶分子进行预结合，然后将噬菌体-靶分子复合物亲和捕获于链霉亲和素包被的表面（见15页）或其他亲和介质上（见16页）。
《噬菌体展示技术》课件
《噬菌体展示技术》
14
噬菌体抗体库淘选示意图 直接包被法
• 噬菌体抗体库与靶分子相互作用
• 洗涤去未结合的或非特异性结合的噬菌体
• 将特异性结合的噬菌体洗脱下来，并扩增， 用扩增产物进行下一轮筛选
• 三轮淘选后，克隆测序
《噬菌体展示技术》
15
噬菌体抗体库淘选示意图 液相法
第一步：生物素化抗体与磁珠结合 Bind to Streptavidin coated magnetic bead
菌不被裂解，但生长速度减 慢，并且分泌大量噬菌体颗 粒。
《噬菌体展示技术》
5
M13噬菌体的生命周期
1. PIII蛋白结合于E.Coli 的F纤 毛
2. 细菌的Tol蛋白复合体解聚噬 菌体的外壳蛋白，ssDNA转 运至胞浆
3. 病毒ssDNA进入细菌的胞浆 合成dsDNA
4. 以dsDNA为模版合成所有的 病毒蛋白，且通过滚环复制
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基因，没有其他噬菌体
基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
• 有供筛选的抗生素标记基因。
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和病毒包装所需要的所有 蛋白和酶。
《噬菌体展示技术》
噬菌体展示系统
Phage on display
《噬菌体展示技术》
1
噬菌体展示系统 Phage on display
•噬菌体展示原理 –噬菌体展示定义、分类
–简介噬菌体及淘选过程
•噬菌体展示应用 •淘选过程中常见问题及解决方案
《噬菌体展示技术》
2
什么是噬菌体表面展示技术
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术第一篇：噬菌体展示技术介绍噬菌体作为一种针对细菌的病毒，与我们生活息息相关。
除了作为抗生素的发现者，噬菌体还可以被利用于噬菌体展示技术。
这种技术利用噬菌体表面展示的蛋白质，实现对目标蛋白质的快速筛选和鉴定。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、优缺点，以及在生命科学研究和工业生产中的应用。
一、原理噬菌体展示技术是将目的蛋白或肽插入噬菌体表面的一种方法。
噬菌体表面组分主要有三种：1）编码质粒的pIII蛋白质；2）编码细胞毒素E的pVIII蛋白质；3）编码专一结合的pV蛋白质。
它们在噬菌体的组成和结构上有不同的作用。
其中，pIII和pVIII蛋白质被广泛地应用于蛋白质展示，pV 蛋白质则被用于病毒特异性分离。
噬菌体展示技术的基本步骤为：首先，在噬菌体pIII或pVIII蛋白质基因的外侧区域中插入目的蛋白的DNA序列；然后使用这些噬菌体感染大肠杆菌。
噬菌体在感染过程中就会将目的蛋白展示在其表面。
最后，可使用具有亲和力的配体或抗体选择目的蛋白并纯化。
二、优缺点噬菌体展示技术的优点主要集中在以下几个方面：1）大容量：噬菌体可以在感染过程中表达众多的外表面蛋白，其中每个蛋白均可成为一个展示物，针对多种噬菌体展示技术。
2）直接鉴定：在已知多肽的情况下，可以使用特定的抗体直接鉴定噬菌体表面的展示蛋白。
3）高灵敏度：噬菌体展示技术对目标蛋白的识别灵敏，并且可以使用大量病毒颗粒进行检测。
4）高效率：噬菌体展示技术可将展示蛋白直接表达在噬菌体的表面，无需进行分离提纯，从而加快了蛋白纯化过程。
噬菌体展示技术的缺点主要有以下几方面：1）分子大小限制：目前仅适用于直径小于1/3噬菌体直径的蛋白分子。
2）生物安全：组装成噬菌体后，展示蛋白无法及时得到更新，可能会导致噬菌体的生物安全风险。
3）抗原性：由于目的蛋白常常被表达在噬菌体的表面，因此它们可能会被视为异物而引起免疫反应。
三、应用由于噬菌体表面蛋白质的展示，噬菌体展示技术已经被广泛应用于生物医学研究和工业生产中。
噬菌体展示技术的原理和方法
噬菌体展示技术的原理和方法噬菌体展示技术是一种利用噬菌体表面展示特定肽段或蛋白的技术。
这项技术自20世纪80年代问世以来，已在许多领域显示出广阔的应用前景，包括药物研发、疫苗设计、蛋白质相互作用研究等。
本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理和方法，并探讨其优缺点和发展趋势。
噬菌体展示技术利用的是噬菌体的特性，噬菌体是一种病毒，专门感染细菌等微生物。
它们由蛋白质外壳和内部遗传物质组成，其中蛋白质外壳又由多个蛋白亚基组成。
噬菌体展示技术利用噬菌体表面展示特定的肽段或蛋白，这些肽段或蛋白可以来自天然蛋白质，也可以是人工合成的。
展示在噬菌体表面的这些肽段或蛋白能够与特异性受体结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示技术的关键之一是选择合适的展示载体。
载体通常是一种丝状噬菌体，其基因组可以容纳较小的外源基因片段。
常用的载体包括M filamentous phage等。
这些载体具有一些共同的特性，如对外源蛋白质的容纳能力较强，能在体内和体外环境中稳定存在等。
在噬菌体展示技术中，需要筛选出能感染特定细菌的噬菌体。
这些噬菌体可以是自生的，也可以是通过基因工程改造得到的。
在筛选过程中，可以利用不同细菌的特性，如受体类型、细胞壁结构等，来选择合适的噬菌体。
还需要考虑噬菌体的毒性、繁殖能力等因素。
在噬菌体展示过程中，需要反复感染以积累足够数量的展示肽段或蛋白。
这个过程中，通常需要使用超滤或凝胶过滤等手段对噬菌体进行纯化，以确保得到的展示肽段或蛋白的纯度和浓度。
反复感染的过程不仅可以增加展示肽段或蛋白的数量，还能帮助排除展示过程中可能产生的突变。
克隆选择是噬菌体展示技术的另一个关键步骤。
这个过程中，通过将展示肽段或蛋白与特定配体结合，筛选出能够与配体结合的克隆。
这些克隆可以进一步扩增和纯化，从而获得高亲和力和高特异性的克隆。
噬菌体展示技术的优点在于其能够将蛋白质或多肽特异性与噬菌体的生物学特性相结合，从而实现表面展示的功能。
噬菌体展示原理范文
噬菌体展示原理范文噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，它可以将其DNA注入细菌细胞，并在其中复制自己的基因组，并最终使细菌溶解释放新的噬菌体颗粒。
噬菌体展示技术通过利用噬菌体对细菌的感染能力，将外源蛋白质的编码序列插入噬菌体基因组中并表达出来，以展示并提取出外源蛋白质。
首先，构建噬菌体基因组库。
基因组库通常是指噬菌体感染宿主细菌的基因组文库。
该步骤将感兴趣的基因组或cDNA文库插入噬菌体基因组中，这样就可以将感兴趣的蛋白质编码序列与噬菌体基因组连接起来。
连接之后，将这些重组噬菌体复制一定次数，使之数量扩增。
其次，插入融合蛋白质。
此步骤将融合蛋白质的编码序列与噬菌体基因组连接起来。
融合蛋白质通常包括两个部分：噬菌体表面显示蛋白（例如噬菌体pIII、pVIII或pIX）和外源蛋白质。
融合蛋白质的外源蛋白质通常是我们感兴趣的蛋白质（例如抗原、抗体、酶等），可以通过PCR或克隆技术得到编码序列。
连接之后，将这些重组噬菌体复制一定次数，使之数量扩增。
最后，展示和鉴定筛选。
展示步骤是为了将外源蛋白质展示在噬菌体的表面，通常利用噬菌体pIII或pVIII进行展示。
这些重组噬菌体在细胞表面显示融合蛋白质，这就意味着外源蛋白质也被一起展示了出来。
通过对表面展示的融合蛋白质进行筛选，可以鉴定出具有我们需要的外源蛋白质的克隆。
常用的筛选方法包括ELISA、免疫染色和流式细胞术等。
总之，噬菌体展示技术通过将外源蛋白质的编码序列插入噬菌体基因组并表达出来，实现了对外源蛋白质的展示和筛选。
它为我们研究蛋白质提供了一种有效的方法，并在药物开发和生物工程等领域具有重要的应用价值。
噬菌体展示技术
内容
1 2 3
• 噬菌体展示技术简介
• 噬菌体展示技术的过程 • 噬菌体展示技术的应用 • 噬菌体展示技术的展望
4
1
• 噬菌体展示技术简介
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编 码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外 壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框 正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的 情况下，使外源蛋白或多肽与外壳蛋白 融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重 新组装而展示在噬菌体表面。
不可否认，目前噬菌体展示技术尚存在某些不 足，需要改进，如外源性多肽的折叠、库容量 的限制、筛选过程中阳性克隆的丢失及假阳性 克隆的获得等。但随着该技术的不断发展，越 来越多的具有良好生物活性的化合物会被发现 并得以鉴定，为新药的开发不断注入新的活力。 可以预测，功能基因组学、蛋白组学和噬菌体 展示技术三者的融合会不断为药学生物技术创 造新的概念,提供新的策略。基于机器人技术的 高通量筛选系统及其他对策的发展，期待噬菌 体展示技术能在寄生虫病诊断、致病机制研究、 疫苗开发、药物研制领域中开创一片新天地。
coated microtitre wells
Wash to remove unbound phage particles.
Elute bound phage
2.3 Amplify eluted phage
感选
3
• 噬菌体展示技术的应用
3.1 3.2 3.3 3.4 噬菌体抗体库技术 测定抗体的抗原决定簇 筛选酶抑制剂 构建cDNA3.2 测定抗体的 抗原决定簇
3.3 一步确认 确认插入片段种类
4
• 噬菌体展示技术的展望
随着噬菌体展示技术的不断成熟和完善，它 在生物学领域和医学领域取得的成就日益突出 ，尤其是为新药的开发拓宽了道路。运用噬菌 体展示技术筛选功能性的多肽，由此作为多种 人体生长因子的活性模拟表位，或作为受体新 型配体，已经成为当今世界医药领域最热门的 课题之一。通过噬菌体展示技术体外筛选具有 治疗活性的人源的scFv ，则以其分子量小、穿 透力强、易于大量生产等特点展示了极好的应 用前景，从而进一步加快了生物药学的发展进 程。
噬菌体展示实验步骤及总结
噬菌体展示实验步骤及总结噬菌体展示技术（Phage Display）是一种利用噬菌体（phage）作为载体表达、展示外源蛋白质或肽段的技术。
该技术可以通过体外筛选方式寻找与特定生物分子相互作用的肽段或蛋白质，并在医学、农业、环境科学等多个领域应用广泛。
本文将介绍噬菌体展示实验的步骤及总结。
一、噬菌体展示实验步骤1.分离噬菌体基因组首先需要从所需噬菌体中提取其基因组DNA，进行适当的酶切、纯化、修饰和扩增等操作，以获得高质量的DNA样品。
2.插入外源DNA将需要展示的外源肽段或蛋白质基因克隆到噬菌体基因组中的特定区域（通常是其Capsid蛋白的的N末端），使其与噬菌体基因组融合。
插入操作可采用PCR扩增、克隆或基因合成等方法进行。
3.包装噬菌体将重组噬菌体基因组与一定的病毒包装反应液混合，经过一定的反应时间，使其封装成噬菌体颗粒。
包装操作可在细菌宿主中进行，也可采用体外装配法，将噬菌体基因组与其他组件（例如，在非细菌宿主中回收的Capsid蛋白）进行反应，实现噬菌体的包装。
4.筛选目标配体将噬菌体颗粒通过筛选池，如固体支持物、细胞表面或溶液相应用目标体分别进行生物学或化学实验等。
通过筛选，得到与目标体有特异性、较高亲合力的噬菌体颗粒。
随后将噬菌体提取、扩增等操作，得到一系列具体的孤儿噬菌体（orphan phage）或配体噬菌体。
5.注意事项在实验过程中需注意的一些问题：（1）噬菌体的主要结构是头部和尾部，根据实验需要可对其进行不同的修饰（例如添加标签、调整展示方向等），以增加其展示效率和特异性等。
（2）外源蛋白的表达量、保持稳定性通常受到噬菌体载体、连接方式、插入位置、转化水平等因素的影响，实验中需对其进行合理设计。
（3）噬菌体筛选应选择样品的适当浓度、筛选反应时间等，以保证准确、高效地获得目标配体。
二、噬菌体展示实验总结噬菌体展示技术是一种非常有前景的生物技术，逐渐成为体外筛选的重要手段之一。
噬菌体展示技术及其应用.ppt
噬菌体展示的基本原理
在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源 基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒 蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可 保持分子，采用适当的淘洗方法（亲 和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤）多 肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码 基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌 体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现 型）和编码基因（基因型）之间完美地结合 起来，为生物科学提供高效而实用的研究手 段。
1990年Scott等首次将随机序列肽与丝 状噬菌体表面蛋白g 融合展示在噬菌体表面, 建立了噬菌体展示随机肽库。
Scott J K, Smit h GP. Searching for peptide ligands wit h an epitope library. Science , 1990 ,249 :386.
1985年Smith首次通过基因工程的手段,将 外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表 达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示 在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术。
Smith GP. Filamentous fusion phage : novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface . Science ,1985 ,228 :1315 - 1317.
Lytic phages specifically kill pathogenic bacteria as an alternative to antibiotics
Example of a successful phage therapy treatment.
接受过噬菌体治疗的病人对细菌和病 毒感染的抵抗力增强, 噬菌体能上调感染 病人的免疫应答。噬菌体治疗能改变血清 α肿瘤坏死因子(TNF-α) 水平, 体外加入 噬菌体能提高血细胞培养物中的TNF-α和 白细胞介素6水平。IL-6 涉及Th2 型应答, 对诱导B细胞分化成抗体形成细胞特别重要。 总之, 这些结果表明噬菌体能作为细胞和 体液免疫的天然佐剂。
噬菌体展示技术
In phage display, a heterologous peptide or protein is displayed on the surface of the phage through transcriptional fusion with a coat-protein gene ,producing novel phage particles that have a variety of potential uses. Foreign proteins can usually be displayed on more than one phage coat protein and in varying amounts. Generally, the smaller the foreign protein or peptide the more copies can be displayed, although this also depends on the phage used, the coat protein and the antigen displayed.
噬菌体展示技术(Phage Display techniques,PDT)起源于1985年,是一 种用于筛选和改造功能性多肽,蛋白质 强有力的生物技术,广泛应用于蛋白组 学,基因克隆等多个分子生物学领域.
目前噬菌体展示技术的研究进展非 常迅速,在抗原决定簇的定位,蛋白质 相互作用位点的确定,特异调节分子的 分离和人工抗体和疫苗的制备,诊断技 术,酶抑制剂的研究开发,多肽药物的 研制等生物技术研究的不同领域得到了 应用,并对这些领域产生了深远的影响.
1985年Smith首次通过基因工程的手段,将 外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表 达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示 在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术.
噬菌体表面展示技术
6.DNA结合蛋白： 锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物， 这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白 区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌 体展示技术也可以用于创造一个大的、具有 识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用 这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设 计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小 鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒 的基因，或干扰病毒感染生活周期。
其中丝状噬菌体展示PⅢ系统单价展示，可以 筛选高亲和力配体，PⅧ系统拷贝数高，利于疫苗 的研制，但丝状噬菌体分泌释放，不易展示大分子 蛋白； λ噬菌体展示和T4噬菌体展示系统容量大， 拷贝数高，但不易筛选高亲和配体；T7展示系统可 以高、中、低拷贝地展示不同分子量的蛋白质，是 目前最为理想的展示系统。
目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅 速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用 位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗 体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研 究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的 不同领域得到了应用，并对这些领域产生了 深远的影响。
噬菌体展示技术的优势
• 噬菌体展示技术最关键的优势有： • 第一，淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能； • 第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的 情况下，通过感染细菌得到富集； • 第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬 菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽 或蛋白质的序列分析既快速又简便。
7.蛋白质组学： 噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质 合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其 有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文 库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是 利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万 种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术 正好能符有关的蛋白质。
噬菌体展示技术操作步骤
筛选多肽试剂及配制（1）LB培养基：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl 5g溶于去离子水，至1L，高压灭菌，4℃保存。
（2）IPTG/Xgal：称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。
（3）LB/IPTG/Xgal平板：1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。
（4）顶层琼脂糖凝胶：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl 5gMgCl2.6H2O 1g琼脂糖7g溶于适量去离子水中，至总体积为1L。
高压灭菌，分装为50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。
（5）2×M9盐：Na2HPO412gKH2PO46gNaCl 1gNH4Cl 2g溶于适量去离子水中，至终体积为1L。
（6）小型平板：500ml 2×M9盐500ml 3%琼脂粉20ml 20%葡萄糖2ml 1M MgSO40.1ml 1M CaCl21ml 硫胺素（10mg/ml）在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。
平板储存于4℃。
（7）封闭缓冲液：0.1M NaHCO3(PH 8.6)5mg/ml BSA0.02% NaN3过滤除菌，储存于4℃。
（8）TBS：50mM Tris-HCl (PH 7.5)150mM NaCl高压灭菌，室温储存。
（9）PEG/NaCl：20%（w/v）聚乙二醇-80002.5M NaCl高压灭菌，室温储存。
（10）碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl (PH 8.0)1mM EDTA4M NaI室温避光保存。
操作步骤：1．第一天（1）以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制备 100μg/ml的靶分子溶液。
如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。
（2）在每孔内加入1.5ml 靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。
《噬菌体展示技术》课件
噬菌体展示技术是一种利用噬菌体作为载体，展示蛋白质和肽段的技术。本 课件将介绍噬菌体展示技术的基本原理和应用领域。
简介
什么是噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是一项利用噬菌体将蛋白质或肽段展示在其表面的技术。
为什么要用噬菌体展示技术
噬菌体展示技术可以很好地展示和筛选特定的蛋白质或肽段，具有高效和可控性。
噬菌体展示技术的应用领域
噬菌体展示技术在抗体选择、疫苗研发和肿瘤治疗等领域具有广泛应用。
基本原理
1
噬菌体结构简介
噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，具有
基因工程技术
2
包裹着基因组的蛋白质壳和尾部结构。
通过基因工程技术将目标蛋白质或肽段
的编码序列与噬菌体基因组融合。
3
噬菌体展示技术基本流程
包括载体构建、噬菌体感染宿主细菌、 蛋白质或肽段展示、筛选和验证等步骤。
噬菌体展示技术的未来发展前景
随着技术的不断进步，噬菌体展示技术在生物医药领域有望取得更大的突破。
未来，噬菌体展示技术有望在药物研发、生物制药和生物能源等领域发挥更重要的作用。
2 噬菌体展示技术的研究热点
当前的研究热点包括展示技术的改进、筛选方法的优化和多肽库的构建。
总结
噬菌体展示技术的优点
具有高效、可控、快速筛选和改造特定蛋白质或肽段的优点。
噬菌体展示技术的局限性
依赖于噬菌体感染宿主细体选择技术
噬菌体展示技术可用于快速筛选和改造具有高亲和力的抗体，用于治疗各种疾病。
疫苗研发技术
利用噬菌体展示技术可以快速筛选出具有高效免疫特性的抗原，用于疫苗的设计和开发。
肿瘤治疗技术
噬菌体展示技术可以实现肿瘤靶向治疗，将药物或治疗性蛋白质展示在噬菌体表面，以增强 治疗效果。
噬菌体表面展示技术
噬菌体展示技术
一、定义
噬菌体展示技术(Phage Display Techniques ,PDT)是一项筛选技术，将 外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的 DNA则位于 病毒粒子内。
表型————基因型
使大量多肽与其DNA编码序列之间、表型与基因型之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内易被降解，因此，必，也是体内选择压力的一个例子。真核细胞蛋白在细菌中表达差是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故。
多肽类药物： 如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒 α-bungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。
蛋白质组学：
01
噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能关的蛋白质。
所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；
展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。
噬菌体展示技术的优势
在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的。
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筛选多肽试剂及配制（1）LB培养基：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl 5g溶于去离子水，至1L，高压灭菌，4℃保存。
（2）IPTG/Xgal：称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。
（3）LB/IPTG/Xgal平板：1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。
（4）顶层琼脂糖凝胶：胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl 5gMgCl2.6H2O 1g琼脂糖7g溶于适量去离子水中，至总体积为1L。
高压灭菌，分装为50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。
（5）2×M9盐：Na2HPO412gKH2PO46gNaCl 1gNH4Cl 2g溶于适量去离子水中，至终体积为1L。
（6）小型平板：500ml 2×M9盐500ml 3%琼脂粉20ml 20%葡萄糖2ml 1M MgSO40.1ml 1M CaCl21ml 硫胺素（10mg/ml）在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。
平板储存于4℃。
（7）封闭缓冲液：0.1M NaHCO3(PH 8.6)5mg/ml BSA0.02% NaN3过滤除菌，储存于4℃。
（8）TBS：50mM Tris-HCl (PH 7.5)150mM NaCl高压灭菌，室温储存。
（9）PEG/NaCl：20%（w/v）聚乙二醇-80002.5M NaCl高压灭菌，室温储存。
（10）碘化物缓冲液：10mM Tris-HCl (PH 8.0)1mM EDTA4M NaI室温避光保存。
操作步骤：1．第一天（1）以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制备 100μg/ml的靶分子溶液。
如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。
（2）在每孔内加入1.5ml 靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。
（3）在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。
4℃保存于湿盒中备用。
2．第二天（4）将ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至10ml LB培养基中。
如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中（比例为1：100）。
37℃剧烈振摇。
（5）将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1h。
（6）去除包被液。
用TBST（TBS+0.1%Tween-20）快速洗涤6次。
反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。
按照步骤5的方法去除洗涤液（也可利用自动洗板机洗涤）。
洗涤要迅速，避免平皿干燥。
（注意每次更换纸巾，以避免交叉污染）。
（7）用1ml TBST稀释4×1010噬菌体（10μl原库），加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。
（8）以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。
（9）以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。
（10）用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。
洗脱液可以是含有配体（0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白（100μg/ml）的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。
室温下轻缓摇动10-60min。
将洗脱液转入微量离心管中。
（10a）或使用通用缓冲液，0.2M甘氨酸-盐酸（PH2.2），1mg/ml BSA。
轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μl 1M Tris-HCl(PH 9.1)中和。
（11）取小量洗脱液（1μl）测定滴度，如果有必要，可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序（见后续操作）。
（未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。
在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1：100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5h，进入步骤13）。
（12）将剩余的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入20ml ER2537培养物中（对数早期），37℃剧烈振摇孵育4.5h。
（13）将培养物转入微量离心管中，4℃，10000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。
（14）将80%的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/ NaCl。
4℃沉淀噬菌体至少60min或过夜。
3．第三天（15）4℃，10000转离心PEG的沉淀物15min，倾去上清，再次离心，吸去多余的上清。
（16）用1ml TBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4℃离心5min使残留的细胞沉淀。
（17）将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15-60min。
4℃离心10min，弃上清，再次短暂离心，用微量枪头吸去残留的上清。
（18）用200μl TBS，0.02%NaN3悬浮沉淀物，离心1min，将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。
（19）测定洗脱物在扩增后的浓度，贮存于4℃。
（20）包被平皿进行第二轮筛选，同步骤1-3。
4．第四天和第五天（21）计数蓝色噬斑，确定噬菌体的滴度，计算对应于1×1011-2×1011pfu的噬菌体体积。
如果滴度太低，在筛选时可采用对应于109 pfu的噬菌体体积。
（22）进行第二轮筛选：重复步骤4-18，用含1×1011-2×1011 pfu噬菌体的第一轮扩增洗脱液进行筛选，将洗涤液中的Tween 20浓度增至0.5%。
（23）测定第二轮筛选扩增洗脱液的滴度。
（24）包被平皿进行第三轮筛选，步骤1-3。
5.第六天（25）进行第三轮筛选：用第二轮扩增洗脱液中1×1011-2×1011 pfu噬菌体进行筛选，洗涤时，Tween 20的浓度仍为0.5%。
（26）测定未扩增的第三轮洗脱液的滴度。
如果不进行第四轮筛选则不必扩增第三轮的筛选洗脱物。
滴度测定时的蓝色噬斑可用于测序：平板的孵育时间不得长于18h，因为时间过长可能造成噬菌体感染率下降。
将剩余得洗脱物保存于4℃。
（27）选取单克隆ER2537 过夜培养。
噬菌体滴度的测定材料和试剂（1）微波炉。
（2）LB/IPTG/Xgal培养板。
（3）LB培养基。
（4）顶层琼脂糖凝胶。
操作步骤（1）在5-10ml LB培养基中接种单个ER2537克隆，振摇孵育直至对数生长中期（OD600=0.5）（2）在细胞生长时，微波融化顶层琼脂糖凝胶，分装至无菌培养管内，每管3ml。
维持在45℃备用。
（3）37℃预热LB/IPTG/Xgal培养板，备用。
（4）以LB培养基10倍比稀释噬菌体。
建议稀释范围：对扩增的噬菌体培养上清，108-1011；对未扩增的筛选洗脱液，101-104。
每次稀释都换用新的加样枪头，最好使用气溶胶阻隔枪头以避免交叉污染。
（5）一旦ER2537培养物长至对数生长中期，分装至微量离心管中，每管200μl。
（6）将倍比稀释的噬菌体上清加入含细菌培养物的微量离心管中，一支微量离心管中仅加入一种稀释液10μl，快速涡旋，室温孵育1-5min。
（7）转移至含有45℃顶层琼脂糖凝胶的管中，快速涡旋混匀，立即倾倒至预热的LB/IPTG/Xgal平板上，轻缓摇动平板使顶层胶均匀分布。
（8）冷却平板5min，37℃倒置培养过夜。
（9）噬斑计数以噬斑数为100左右的平皿为准，噬斑数乘以稀释度即可获得每10μl噬菌体的滴度-噬斑形成单位（pfu）。
噬斑的扩增材料和试剂（1）恒温摇床（2）培养管（3）LB培养基（4）甘油操作步骤（1）以LB培养基稀释ER2537过夜培养物。
1ml分装至培养管，每管中接种一个克隆。
第三轮筛选后，每10个克隆就可能获得一个共同序列。
（2）使用消毒牙签或枪头，穿刺噬斑，接种至上述培养管中。
注意：要挑选噬斑数不超过100的平板上的噬斑，从而保证每一个噬斑仅包含单个DNA序列。
（3）37℃振摇孵育4.5-5h（不能过长）。
（4）可做可不做。
除了测定单个克隆的序列，也可将筛选到的全部噬菌体进行测序，一步就可能获得12个残基中的共有序列。
取10μl未扩增的洗脱物加至1ml宿主菌稀释液中37℃振摇孵育4.5-5h。
（5）将培养物转至微量离心管，离心30s，取上清转入新的离心管中再次离心，取上部约80%的上清转至新的离心管。
这是扩增的噬菌体贮存液，能4℃保存数周，若需长期保存，以无菌甘油1：1稀释后，-20℃保存。
测序模板的快速纯化材料和试剂（1）真空泵（2）PEG/ NaCl溶液（3）碘化物缓冲液（4）70%乙醇（5）TE缓冲液：10mM Tris-HCl ，PH 8.01 mM EDTA操作步骤（1）扩增噬斑（见上述），在第一次离心后，将500μl含有噬菌体的上清转入新的离心管中。
（2）加入200μl PEG/ NaCl，颠倒混匀，室温静置10min。
（3）离心10min，倾去上清。
（4）再次短暂离心，仔细吸去残留上清。
（5）用100μl碘化物缓冲液完全重悬沉淀物，加入250μl乙醇。
室温孵育10min，室温短暂孵育将选择性沉淀单链噬菌体DNA，而大部分噬菌体蛋白保留在溶液中。
（6）离心10min，倾去上清，用70%乙醇洗涤沉淀物，真空吸干。
（7）用30μl TE缓冲液重悬沉淀物。
（8）取5μl作为测序模板，或根据需要增减。
ELISA检测筛选到的靶分子结合肽材料和试剂（1）酶标板，酶标仪。
（2）湿盒。
（3）吸水纸。
（4）LB培养基。
（5）PEG/ NaCl。
（6）TBS。
（7）0.1M NaHCO3(PH 8.6)。
（8）HRP底物缓冲液。
ABTS贮存液：在100ml 50mM的柠檬酸钠溶液（PH 4.0）中溶解22mgABTS，过滤除菌贮存在4℃。
操作步骤（1）噬斑扩增上清部分用于DNA序列测定，其余保存于4℃。
（2）将ER2537接种至20ml LB培养基中，37℃孵育至轻微混浊，或将过夜培养的ER2537按1：100稀释至20ml。
（3）加入5μl噬菌体上清，37℃剧烈通气培养4.5h。
（4）将培养物转入离心管，10000转离心10min。
取上清转入新的离心管，再次离心。
（5）吸取上层80%的上清转入新离心管中，加入1/6体积的PEG/ NaCl，4℃沉淀1h或过夜。
（6）4℃，10000转离心PEG沉淀物15min。
倾去上清，再次短暂离心，吸去残留上清。
（7）用1ml TBS悬浮沉淀物，并转至微量离心管中，4℃离心5min以沉淀残留细胞。
（8）将上清转至新离心管中，再次用1/6体积的PEG/NaCl沉淀噬菌体。
冰上孵育15-60min，4℃离心10min。
倾去上清，再次短暂离心，吸去残留上清。