噬菌体展示技术操作步骤

筛选多肽

试剂及配制

（1）LB培养基：

胰蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl 5g

溶于去离子水，至1L，高压灭菌，4℃保存。

（2）IPTG/Xgal：

称取1.25g IPTG，1.0g Xgal，溶于二甲基甲酰胺，至总体积25ml，-20℃避光保存。（3）LB/IPTG/Xgal平板：

1L LB培养基+15g琼脂粉，高压灭菌，冷却至70℃以下，加入1ml IPTG/Xgal，立即铺板，4℃避光保存。

（4）顶层琼脂糖凝胶：

胰蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl 5g

MgCl2.6H2O 1g

琼脂糖7g

溶于适量去离子水中，至总体积为1L。高压灭菌，分装为50ml/份，室温保存，使用时于微波炉内融化。

（5）2×M9盐：

Na2HPO412g

KH2PO46g

NaCl 1g

NH4Cl 2g

溶于适量去离子水中，至终体积为1L。

（6）小型平板：

500ml 2×M9盐

500ml 3%琼脂粉

20ml 20%葡萄糖

2ml 1M MgSO4

0.1ml 1M CaCl2

1ml 硫胺素（10mg/ml）

在混合之前，将上述成分分别高压灭菌并冷却至70℃以下，葡萄糖和硫胺素采用过滤除菌。平板储存于4℃。

（7）封闭缓冲液：

0.1M NaHCO3(PH 8.6)

5mg/ml BSA

0.02% NaN3

过滤除菌，储存于4℃。

（8）TBS：

50mM Tris-HCl (PH 7.5)

150mM NaCl

高压灭菌，室温储存。

（9）PEG/NaCl：

20%（w/v）聚乙二醇-8000

2.5M NaCl

高压灭菌，室温储存。

（10）碘化物缓冲液：

10mM Tris-HCl (PH 8.0)

1mM EDTA

4M NaI

室温避光保存。

操作步骤：

1．第一天

（1）以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制备 100μg/ml的靶分子溶液。如果需要稳定靶分子，可以用含有金属离子的相似离子强度缓冲液。

（2）在每孔内加入1.5ml 靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润（这一步要多注意，尽量避免溶液形成液珠）。

（3）在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。

2．第二天

（4）将ER2537（滴度测定时用来铺板的细菌培养物）接种至10ml LB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中（比例为1：100）。37℃剧烈振摇。

（5）将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1h。

（6）去除包被液。用TBST（TBS+0.1%Tween-20）快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。按照步骤5的方法去除洗涤液（也可利用自动洗板机洗涤）。洗涤要迅速，避免平皿干燥。（注意每次更换纸巾，以避免交叉污染）。

（7）用1ml TBST稀释4×1010噬菌体（10μl原库），加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。

（8）以步骤5的方法去除未结合的噬菌体。

（9）以步骤6的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。

（10）用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体（0.1-1mM）的TBS，或是含有靶蛋白（100μg/ml）的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10-60min。将洗脱液转入微量离心管中。

（10a）或使用通用缓冲液，0.2M甘氨酸-盐酸（PH2.2），1mg/ml BSA。轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μl 1M Tris-HCl(PH 9.1)中和。

（11）取小量洗脱液（1μl）测定滴度，如果有必要，可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序（见后续操作）。（未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1：100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5h，进入步骤13）。

（12）将剩余的洗脱物进行扩增：将洗脱物加入20ml ER2537培养物中（对数早期），37℃剧烈振摇孵育4.5h。

（13）将培养物转入微量离心管中，4℃，10000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。

（14）将80%的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/ NaCl。4℃沉淀噬菌体至

少60min或过夜。

3．第三天

（15）4℃，10000转离心PEG的沉淀物15min，倾去上清，再次离心，吸去多余的上清。

（16）用1ml TBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4℃离心5min使残留的细胞沉淀。

（17）将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15-60min。4℃离心10min，弃上清，再次短暂离心，用微量枪头吸去残留的上清。

（18）用200μl TBS，0.02%NaN3悬浮沉淀物，离心1min，将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。

（19）测定洗脱物在扩增后的浓度，贮存于4℃。

（20）包被平皿进行第二轮筛选，同步骤1-3。

4．第四天和第五天

（21）计数蓝色噬斑，确定噬菌体的滴度，计算对应于1×1011-2×1011pfu的噬菌体体积。如果滴度太低，在筛选时可采用对应于109 pfu的噬菌体体积。

（22）进行第二轮筛选：重复步骤4-18，用含1×1011-2×1011 pfu噬菌体的第一轮扩增洗脱液进行筛选，将洗涤液中的Tween 20浓度增至0.5%。

（23）测定第二轮筛选扩增洗脱液的滴度。

（24）包被平皿进行第三轮筛选，步骤1-3。

5.第六天

（25）进行第三轮筛选：用第二轮扩增洗脱液中1×1011-2×1011 pfu噬菌体进行筛选，洗涤时，Tween 20的浓度仍为0.5%。

（26）测定未扩增的第三轮洗脱液的滴度。如果不进行第四轮筛选则不必扩增第三轮的筛选洗脱物。滴度测定时的蓝色噬斑可用于测序：平板的孵育时间不得长于18h，因为时间过长可能造成噬菌体感染率下降。将剩余得洗脱物保存于4℃。

（27）选取单克隆ER2537 过夜培养。

噬菌体滴度的测定

材料和试剂

（1）微波炉。

（2）LB/IPTG/Xgal培养板。

（3）LB培养基。

（4）顶层琼脂糖凝胶。

操作步骤

（1）在5-10ml LB培养基中接种单个ER2537克隆，振摇孵育直至对数生长中期（OD600=0.5）（2）在细胞生长时，微波融化顶层琼脂糖凝胶，分装至无菌培养管内，每管3ml。维持在45℃备用。

（3）37℃预热LB/IPTG/Xgal培养板，备用。

（4）以LB培养基10倍比稀释噬菌体。

建议稀释范围：对扩增的噬菌体培养上清，108-1011；对未扩增的筛选洗脱液，101-104。每次稀释都换用新的加样枪头，最好使用气溶胶阻隔枪头以避免交叉污染。

（5）一旦ER2537培养物长至对数生长中期，分装至微量离心管中，每管200μl。

（6）将倍比稀释的噬菌体上清加入含细菌培养物的微量离心管中，一支微量离心管中仅加入一种稀释液10μl，快速涡旋，室温孵育1-5min。

（7）转移至含有45℃顶层琼脂糖凝胶的管中，快速涡旋混匀，立即倾倒至预热的