葡萄糖转运载体测定方法

一.刷状缘膜囊的制备：（方法参照Kessler(1978),Shirazi-Beechey(1991)和Bauer （2001b）修正）

所有操作过程需在冰上或者4℃下进行。将冷冻样品进行称重，并在冷烧杯中用缓冲剂（100mM 甘露醇，2mM HEPES/Tris 缓冲剂，pH7.1）解冻。解冻后，在冷的有盖培养皿中用剪刀和镊子将组织样剪为1cm小块，将小块组织样重放入冷烧杯，然后将组织块悬液振动2次(设定为No.80)，每次一分钟。用布氏漏斗过滤振动后溶液，溶液转入250mL量筒，记录滤液体积后转移至400mL烧杯中。将烧杯放置冰上，搅拌溶液。制作多个平行样以备进一步分析，这些处理后样品为匀浆液。已知浓度的氯化镁溶液加入到匀浆液中以达到10mM的终浓度，温和搅拌溶液20分钟，然后进行两种离心：5min，3000*g；30min，30000*g。利用20-G型检测针对剩余的颗粒进行再悬浮，缓冲液为100mM甘露醇+20mM HEPES/Tris，pH7.5。悬浮颗粒在组织研磨机（Potter-Elvehjam; Teflon/glass）中均匀搅拌十次后在30000*g离心30min。最终颗粒用23-G型检测针在500μL缓冲液中（300mM甘露醇，0.1mM硫酸镁，20mM HEPES/Tris，pH7.5）再次悬浮。悬浮颗粒（囊泡）由反复流过27-G型检测针10次的溶液制备均匀，避免出现气泡。将试样等分入冷冻管后-80℃保存。

二.检测

利用BSA(牛血清白蛋白)作为匀浆蛋白浓度和囊泡浓度的标准。麦芽糖酶是刷状缘膜富集度的标记酶，Truner 和Moran（1982）的方法测定麦芽糖酶活，使用25mM磷酸盐缓冲液（pH6.3）和30mM麦芽糖。释放的葡萄糖通过COBAS FaraⅡ（全自动生化仪）（Roche，Montclair，NJ）测定麦芽糖酶活表达为μmol product/min*mg of protein。囊泡中麦芽糖酶活的富集（enrichment）表示为囊泡麦芽糖酶活/匀浆麦芽糖酶活。

37℃下将5μL（50μg of protein）的小囊泡置于预热的微量离心管中，预热的培养基中包含100mM硫氰酸钠或硫氰酸钾、99.8mM甘露醇、20mM HEPES/Tris （pH7.5），再加入200μM葡萄糖（1.0μCi【U-14C】-D-glucose）。加入1mL冰冻终止溶液（150mL氯化钠，250μM根皮苷）3s后葡萄糖吸收被终止。移取0.9mL上述溶液，迅速通过0.45μm圆形纤维素薄膜。整个薄膜用终止溶液（5*1mL）清洗。将薄膜置于20mL 闪烁计数瓶中，瓶中加入12mL scintillation cocktail（Scintisafe Plus 50%LSC Cocktail）。样品通过Quantasmart软件用于放射性测定（闪仪Tri-Carb 2900TR/SL）。在Na+和K+存在的前提下，葡萄糖吸收的测定重复五次。钠依赖性葡萄糖的吸收通过硫氰酸钠孵化值减去硫氰酸钾孵化值得到。

三.免疫印迹

囊泡和匀浆液（40µg蛋白/道）在60℃下孵育，然后用7.5%的SDSPAGE分离。蛋白通过电转移至0.45µm的硝化纤维膜上，用固绿染色法（固绿染色液）使其显现出来（Fisher Scientific, Pittsburgh,PA）。为了指示刷状缘膜的纯度，连续用探针检测SGLT1，GLUT2和碱性磷酸酶。薄膜在封闭溶液中（2.3%康乃馨脱脂奶粉溶于30mM Tris碱，300mM NaCl，0.1%（vol/vol）吐温20，pH7.5）封闭1.5h。将薄膜置于迷你转迹机中，每个样品道的封闭液中放置50µL抗-SGLT1抗体（兔抗兔SGLT1；1：325稀释度；100µg/µL初始浓度），然后在摇床中室温杂交1h（摇床）。将薄膜浸在含有150µL封闭液迷你转迹机中，再将薄膜从迷你转迹机中取出，在封闭液中继续浸泡5min。辣根过氧化物酶共轭二抗（驴抗兔免疫球蛋白；1：5000稀释度）作用于每个薄膜样品各1h。将薄膜在封闭液中浸泡5次，每次5min，再在TBS/Tween20（30mM Tris base，300mM Nacl，0.1%【vol/vol】Tween20，pH7.5）中浸泡10分钟。对薄膜轻轻点样以除去多余水分，发光底物也通过blotted 处理5分钟。薄膜轻轻blotted，包在塑料包中，进行曝光，洗照片。准备下一个探针时，将薄膜在60℃溶液中进行水浴分带（69mM SDS，62mM Tris Base，7.8µL/mL β-巯基乙醇）。在探测GLUT2之前，需将样品在封闭液中封闭2h（2.5%康乃馨脱脂牛奶混于30mM Tris Base，150mM Nacl，pH7.5）。薄膜在含有50µL anti-GLUT2抗体（兔抗鼠GLUT2；1:165稀释度；100µg/µL初始浓度）的样品道中杂交1.5h。杂交完成后，每个薄膜浸泡于迷你转迹机中的240mL封闭液中。从迷你转迹机中取出后，薄膜在封闭液中浸泡3次，每次5分钟。辣根过氧化物酶共轭二抗（驴抗兔免疫球蛋白；1:5000稀释度）作用于每个样品各1.2h。剩余的清洗液和化学发光显影部分和SGLT1探测处理方法一样。显影后，将薄膜再次分条带。

探测碱性磷酸酶前将样品在封闭液中（2.0%脱脂牛奶混于10mM Tris Base，200mM Nacl，pH7.5）孵育1.5h。在不同管中薄膜与碱性磷酸酶抗体（小牛抗兔碱性磷酸酶，calf antirabbit；1:10000；10mg/mL初始浓度）杂交1h。杂交后，将薄膜在封闭液中浸泡5次，每次5min。辣根过氧化物酶共轭二抗（驴抗兔免疫球蛋白；1:5000稀释度）作用于每个样品各1h。剩余的清洗液和化学发光显影处理同SGLT1探测相同。

四.相关蛋白丰度及分子大小的测定：

扫描放射自显影的数字成像，并利用UN-SCANIT软件程序对光密度进行扫描和评估（方法参照Swanson，2000）。光密度值作为任意单位被报道，并用信号值减去放射自显影照片的一个平均背景值作为实际值。用每段肠道的匀浆信号值减去囊泡信号值，就可以得到SGLT1，GLUT2和碱性磷酸酶的富集值。通过利用十二指肠的光密度值减去各个肠段的光密度值，把用于评估整个肠道SGLT1丰度的光密度值标准化至十二指肠样品。SGLT1和GLUT2的表观位移权重通过对移动距离和已知Marker的位移进行回归得到，范围为184.5-9.1kDa（用标准点预染的蛋白梯）。