2017春 植物生物技术实验指导 (自编) -1要点

生物工程综合实验—植物生物技术模块

生物工程教研组编

2017年春学期

目录

实验一植物组培实验室设计和实验设备、实验用品认知 (3)

实验二MS培养基母液的配制 (6)

实验三MS培养基配制与灭菌 (9)

实验四无菌接种操作 (12)

实验五外植体分化生长的诱导培养 (12)

实验六外植体脱分化生长的诱导培养 (17)

实验七组培苗的炼苗 (20)

实验一植物组培实验室设计和实验设备、实验用品认知

一、目的与要求

1、结合对植物细胞工程安徽省工程技术研究中心植物组织培养生产车间和研究实验室的现场认知，了解掌握植物组织培养实验室的组成和所需的基本仪器设备，学会植物组织培养实验室的设计；

2、为后续植物组培实验课程学习与实训准备所需的相关用品。

二、教学场所

1、植物细胞工程技术研究中心；

2、生物工程综合实验分室（A514）。

三、内容与方法

（一）关于植物组培实验室的认知与设计

1、组培实验室设计原则

要求环境干燥清洁；符合无菌操作规程要求；满足生产技术流程需要。

2、组培实验室的一般组成与设备

包括化学实验室、洗涤准备室、培养基制备室、无菌操作室、培养室、细胞学观察研究室，等。

（1）化学实验室

各种相关药品的贮存、溶液配制等。

主要设备：药品柜，防尘橱，冰箱，天平，蒸馏水发生器，加热器（电磁炉等），玻璃器皿，等。

（2）洗涤准备室

用于完成相关器具的洗涤、干燥、堆放存储等。

主要设备：洗涤池，洗瓶机，操作台，烘箱，储物架（柜）等。（3）培养基制备室

用于进行培养基的生产。

主要设备：冰箱，天平，蒸馏水发生器，酸度计，加热器（电磁炉等），玻璃器皿，分装机，灭菌设备，操作台，等。

（4）无菌操作室

主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的继代等。无菌室的房间不宜太大，数量根据需要设置。要求干爽清洁，相对密闭，墙地光滑防潮，配置平移门。每一无菌室设内外二间，外间为缓冲室，内间较大，为接种室。

主要设备：紫外灯，超净工作台，臭氧发生器，酒精灯，接种器械（镊子、剪刀、解剖刀、接种针），手推车，等。

（5）培养室

是将接种的材料进行培养生长的场所，大小依规模而定。培养室的设计以充分利用空间和节省能源为原则。

主要设备：空调机，加热器，增湿器，培养架，光照设备，培养箱，转床，人字梯，等。

（6）细胞学观察室

用于进行培养物的取样观察和分析。

主要设备：显微镜，细胞染色、计数、制片设备，天平，离心机，等。（二）组培实验用品的准备

1、玻璃器皿及规格

（1）培养瓶：100~500 mL的玻璃或塑料培养瓶等；

（2）培养皿：9～15 cm；（3）烧杯：100～5000 mL；

（4）量筒：10～1000 mL；（5）移液管：1～10 mL；

（6）试剂瓶：100～1000 mL；（7）容量瓶：100～1000 mL。

2、接种器械

酒精灯，不锈钢镊子、剪刀、解剖刀等。

3、其它用品

培养瓶封口膜（盖），棉线，记号笔，打包纸（牛皮纸、报纸），转运筐，等。

四、预习思考与作业

1、试分析植物组培苗工厂化生产的车间设计与设备选型。

2、分组准备（领取、洗涤、保管）植物组培实验主要用品。

实验二MS培养基母液的配制

一、目的与要求

1、了解植物组织培养培养基的组成，常用配方；

2、掌握培养基配制的步骤，母液的概念与配制方法。

二、教学场所

生物工程综合实验分室（A514）。

三、内容与方法

（一）基本原理

植物培养基配方中的成分多样，为减少每次培养基配制的工作量和误差，有必要将配方中的成分分为几类，分别配制成若干浓缩倍数的母液备用。（二）实验内容

完成MS培养基各种母液的配制。

四、材料与用品

（一）主要化学试剂和药品

详见表1。

（二）仪器用具

天平、烧杯、试剂瓶、量筒、容量瓶、蒸馏水器、加热器、电冰箱，等。

五、实验操作

（一）MS培养基的基础配方与母液配制

1、MS培养基的配方和母液配制用量

详见表1。

2、配制1 L培养基所取母液的量

配制1 L培养基，所取上述各种母液的数量为：大量元素和钙盐母液各

50 mL，铁盐、微量元素和有机物的母液各10 mL。

铁盐配制：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将Fe盐溶液倒入EDTA 溶液中混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。

CuSO4·5H2O 和CoCl2·6H2O 因量较小，应先配成更高浓度250mg/L 的母液(10000×), 再根据母液体积取用。

（二）植物激素的母液配制

6-BA、NAA、2,4-D等常用植物激素，可配制成0.1 mg/mL的母液，单独配制和取用。

配制时，6-BA、NAA、2,4-D等，可先用少量1 M NaOH再加入热水定容。

表1 MS培养基的母液配制方法参考表

注意事项：

（1）钙盐、铁盐单独配制。铁盐需要用棕色试剂瓶盛装。

（2）烟酸在冷水中溶解度差，称量后可先单独用适量热水溶解后，再加到相应的母液中一起定容。

附：MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS 固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。MS培养基的无机养分的数量和比例比较合适，足以满足植物细胞在营养上和生理上的需要。因此，一般情况下，不用再添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。和其它培养基的基本成分相比，MS培养基中的硝酸盐、钾和铵的含量高，这是它的显著特点。

六、预习思考与作业

1、MS培养基配方中，CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O的用量小，配制母

液时直接称量相对较困难，如何操作可减少此困难并降低误差？

2、配制浓缩倍数较高的大量元素母液时，为何往往会发生沉淀，如何

避免？

3、表1中的试剂，有的含有结晶水，假如提供的试剂的结晶水的个数

与配方中的不一样，应如何处理？