酶活性测定中K值的计算方法与应用价值

酶活性测定中4种K 值的计算方法与应用价值

酶活性测定的计算及校正所用的K 值,可分为4种。其计算方法与应用价值不同,现讨论如下。1　理论K 值(设为K T )这是根椐带色原底物经酶促反应后游离的色原,或偶联

氧化(还原)型辅酶Ⅰ(Ⅱ

)系统中生成的还原型辅酶Ⅰ(Ⅱ)等指示物质,在一定波长下的理论摩尔吸光度(

ε),及酶测定计算公式中除所测△A /min 外的各项数值计算得到的常数值

。

各试剂生产厂家给出的K 值都属于此。其ε是文献记载的,

如NADH 340nm ,各家均用6.22×103。同一测定项目的同一方法,各厂家试剂盒K 值的差别,是由于设置的样本与试剂体积比不同产生。文献上的NADH 的ε是用经过严格校正波长及光径后的窄半波宽的高级紫外分光光度计,用手工方法测定的。而调查结果表明,各种自动生化分析仪达不到这个值(见表1)。所以,K T 只能供用户列计算式及求实测K 值时参考,不能直接应用于酶活性的计算。

表1　文献报道用各型生化分析仪实测NADH 的ε值

　作者　仪器种类台数NADH 平均ε340nm (1・

m ol 21・cm 21)×103桑克彦

[2]

东芝80FR ,30FR ,200FR ;日立7170;宝灵曼;>12 5.87岛津CL8000

李勇等[4]

日立7150,7170,7060,7600;

奥林巴斯Au800,Au640,8 5.73雅培Aeroset TM 蒋声高等[8]

日立7150,7170;

贝克曼VX4,CX5,CX7;

奥林巴斯Au560,Au600,18 5.78Au640,Au800,Au1000等

2　实验仪器的实测K 值(设为K I )

仪器诸因素(波长的准确性及半波宽,比色池光径及磨

损与清洁度,温控的准确性,加样系统状况等)若不合要求,或发生变化都影响指示物质的实测ε或公式中的有关项。因此,各实验室应在具体仪器条件下,定期测定各种指示物质的K I 值。对于不易获得高纯且不稳定的指示物质,如NADH ,一般用己糖激酶法测定葡萄糖产生的等摩尔的NADH 的A 340nm ,计算其实测的ε再计算实测K (K I )。对于可产生高纯且稳定的物质如对硝基酚(42NP )等,可配成溶液(如AL P 测定中,配成0.04mmol/L42NP 于p H10.09,37℃、84mmol/L 22氨基22甲基12丙醇中,37℃,405nm ,1cm 光径,标准A =0.748),直接在实际仪器条件下测吸光度,计算

实测ε,再计算实测K (K 1)。

用这种方法在各生化分析仪上测得的NADH 的ε值比理论值低得多(表1),可见实测仪器K 值(K I )十分重要!3　实测仪器及反应试剂因素的K 值(设为K IR )

各色原指示物质在不同介质环境中,其ε会发生程度不等的变化。对那些可得到高纯而稳定的指示物质,若不仅将其配制在一定的介质中,而且按临床标本用的现场试剂(不只是缓冲液)及仪器测定吸光度,求实测ε值及K 值(K IR )。即不仅配指示物质的介质与测定标本的方法相同,而且指示物质的处理过程(如加样)、试剂及仪器条件均与样品测定时相同,可消除更多的影响因素。我们曾介绍过此法[5]。国内有类似应用报道[7],但只用缓冲液处理指示物质。

以AL P 和Amy 测定时从底物释放的42NP 为例就可以说明测定K IR 的重要性。

缓冲液中OH -对42NP 上的酚性羟基的质子有很强的吸引力,从而形成共轭的醌式结构。但与酚羟基结合的化合物的化学基团也吸引质子,即使在碱性条件下,也呈无色的酸式。一旦酶促使其水解,42NP 游离,则呈黄色的碱式。但其离子化程度随p H 而变化,所以42NP 是p H 指示剂,是常用的色原物质。无色的质子化酸式的p K 值为7.15,黄色阴离子在405nm 的ε=180001・mol 21・cm 21,在不同p H 值下离解程度及其相对吸光度如图

[1],其ε与p H 的关系式是[10]:

εpH =18000×10

(pH -7.15)/10(

pH -7.15+1(PB 50mmol/L ,400nm ,30℃,引自金岛才仁等)

图1　42NP 离子化程度与p H 的关系

图示p H >9.0时充分离子化,p H 7.15附近离子化受

p H 影响极大。故AL P 测定中(p H >10.0)42NP 离子化受p H 微小变化影响小,Amy 测定中(p H =7.12)42NP 离子化受p H 的微小变化影响大。

现以Amy 测定的IFCC 法(底物EPS )中实测K IR 为例,说明具体测K IR 方法。配制1mmol/L 42NP :取Sigma 的42NP 69.55mg ,用p H 7.15,50mmol/L HEPES (含70mmol/L NaCl )溶解并用经校正的容量瓶稀释到500ml 。以此为样品,用现场Amy 试剂盒及参数,终点法,盐水代样品

作空白(B ),测5次求平均值。因ε及K 值计算中许多项目已消去[5],故可根据A 值直接计算K IR :

当L =1cm ,指示物为1mmol/L 时,

K IR =

(S V +R V )×106

ε×S V

=

(S V +R V )×106

〔(A 42NP ,405nm -A B )/1×10×S V S V +R V

〕×S

V

=

1000

A 4NP ・405nm -A B

我们用两种IFCC 法Amy 测定试剂盒,在南京8家医院

实验室的不同生化分析仪上,用统一配制的1mmol/L 42NP ,

实测K IR 在7.48～10.97, x ±s =9.53±0.992[4],与理论值

12.0[6](p H 7.15,50mmol/L HEPES ,70mmol/L NaCl 中,

37℃

)相差非常明显。 这种K IR 在一定程度上消除了仪器及试剂诸因素对指示物质A 的影响。严格地讲,临床样品中的蛋白质种类和浓度,脂肪酸也有影响[6],但目前在用指示物质作实测K 值时一般均未加白蛋白等。而Amy 测定的IFCC 推荐方法已明确分别列出测定含与不含蛋白样品时42NP 的两种ε。4　实测ERM 的K 值(设为K IRE )[2]准确地说,使标准物质的表示值在分析仪上的再现为校正或校准。上述实测K I 、K IR ,用指示物质从仪器及仪器与试剂方面对理论K 值的校正,均未参加酶促反应过程,影响酶促反应的诸因素未得到补偿校正。酶测定中最理想的校正方法是用部分提纯而稳定的定值准确的酶校正液或酶参考液(ERM ),进行全过程的校正。因为酶不易制成纯品,又不稳定,且提纯酶与血清酶反应性不一定相似,所以用ERM 校正长期未解决。近年来有很大进展。欧共体、美国、日本相继推出CRM (有证参考品)、SRM (标准参考品)及ERM (酶参考品)用于酶测定的校正。对ERM 的定值方法(标准方法)决定其溯源。日本ERM 溯源为J SCC 常用基准法,欧共体CRM 溯源为IFCC 法。若用IFCC 推荐法,37℃下定值,在日本称为SOP 法(Standard operating procedure ,标准操作法),溯源为IFCC SOP 法;我国为CSML S 法(中华医学会检验学会法)。各被校正且通过的方法称为溯源法的对应法,其试剂盒称为溯源标准法所对应的试剂盒,其测定值可以溯源,溯源相同的各试剂盒间结果应一致。酶校正液,仅用于与溯源标准法对应的试剂盒才有效。试剂生产厂家必须保证这种有效性。

K IRE 校正步骤:①选择酶校正液或ERM ERM 必须与人血清酶反应性一致,稳定,均一,定值准确。定值应是符合溯源要求的标准法。同时选择经实验证明与之配套组合的酶质控品(所测酶的反应性与人血清酶一致);若有酶校正液,而无与其配套的酶质控品,应尽量用酶校正液(如现在不少实验室直接用cfas 兼校正与质控);酶校正液也可用ERM 代替,只是代价太高;若既无酶校正液或ERM ,又无酶质控液,因结果的准确性和精确度都无法监控,此时酶测定试剂盒不能应用。

②溯源性检查　用酶校正液或ERM ,在现场仪器、试剂及其测定参数条件下,检查测定结果是否在标示值的允许范

围内。用酶校正液或ERM 作样品,测5次,求平均值( x ),应

在定值(V a )±5%内,或在定值(V a )±不确定性范围内。若在其内,即可用下式求校正系数K ′及实测ERM 的K 值K IRE : K ′=V a/ x ,求至小数点后两位。 K IRE =K I (IR )×K ′ 将此结果输入并记录保存。例如某AL T 试剂盒的K T =1929,K I =2100;某AL T 的ERM 定值及不确定性为185±7U/L ,测得 x =176U/L ,在允许范围内,可校正。K ′=185/176=1.05,K IRE =2100×1.05=2205。将此K IRE 输入用于计算酶活性浓度。

③质控品的应用　用配套的定值质控品做5次测定,确认其合乎判断标准(其值在正常范围中位数时,在标示值±20%内);高于正常上限时,在标示值±10%内。此后用该质控品进行日常质控,并定期及在仪器经过维修后或更换试剂后测定K IRE 。苏增留等[3]用日本旭化成公司的酶校正液,作了4个仪器试剂系统的K 值校正(即上述K ′,K IRE ),证明经此统一校正后可降低各系统间的CV %。顾国龙报道[9],3种进口酶校正液如用于不配套的(即溯源性检查不合格)的仪器试剂系统,反而会增大系统间的CV %。

④溯源性检查不合要求时的处理　溯源性检查结果不合要求时,不能根据不合要求的测定结果(X )计算K ′及K IRE ,应该检查原因,建议沿着ERM →试剂盒→仪器的顺序检查其质量及相应的K 值。5　四种K 值的关系

K T 仅供用户参考,不可实际应用;K 1值对目前无稳定高纯的指示物质者适用;K IR 对有稳定高纯的指示物质者,应尽量采用;有ERM 或酶校正液的实验室,应将K IRE 与K 1或K IR 合用,这是目前最理想的方法。参考文献:

[1]金岛才仁/小川善资.临床化学分析の指示反应系—PNP ,CNP

[J ].临床检查,1997,41¬102521028.

[2]桑　克彦.校正方法の标准化[J ].临床检查,2000,44¬864-871.[3]苏增留,张克坚,郭健,等.酶校正品在血清酶测定结果标准化中

的应用[J ].上海医学检验杂志,2001,16(2)¬79283.

[4]李勇,孟泽,史利宁,等.2淀粉酶及门冬氨酸氨基转移酶参考品

定值方法的初步研究(本刊待发表).

[5]孟泽.酶测定中实测计算因素(F 值)的通用方法[J ].临床检验杂

志,1998,16(1)¬63264.

[6]Lorentz K.Approved recommendation on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes Part 9.IFCC method for 2amylase (1,422D 2G lucan 242glucanhydrolase ,EC3.2.1.1)[J ].Clin Chem Lab Med ,1998,36(3):1852203.

[7]蒋胜高,许斌,程梅,等.实测摩尔吸光度在酶活性测定质量控制

中的应用[J ].临床检验杂志,2000,18(6)¬3422344.

[8]Burtis C A ,Ashwoos E R.T ietz T ext Book of C linical Chem istry[M].2nd

Ed.Philadelphia :W.B.Saunders C om pany ,1994.8342836.

[9]顾国龙.选择适合测定系统的酶校准品[J ].临床检验杂志,2002,20

(1)¬36.

[10]Eisenthal R ,Dansom M J.Enzyme Assays 2A Practical Approach

[M ].New Y ork :Oxford Universty ,1992.80.