1 分子克隆解析

pU1301+1.5KB外源
• 双酶切： BamHI+KpnI
ALPHA
pUC19
பைடு நூலகம்
Eco RI (397 )
P(BLA)
Acc 65 I (409) Ava I (41 3) Xma I (41 3) Kpn I (41 3) Sma I (41 5 )
AP r
pUC19
2686 bp
Bam HI (41 8) Pst I (440) Hin dIII (448)
P(LAC) ORI
分子克隆的主要步骤
1. 两种载体的抽提
2. 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量
3. 两种载体的限制性内切酶消化
4. 目的片段的回收及亚克隆载体的去磷酸化
5. 载体与外源DNA的连接 6. 感受态细胞的制备 7. 连接子转化感受态细胞 8. 重组子筛选及鉴定
质粒载体的提取
载体必备条件
实验材料
携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液； 携带含有水稻 DNA 片段的 pU1301 载体的大肠杆菌 菌液。
操作步骤
1. 取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应
抗生素的 LA 培养基上涂布或划线分离单菌落，
37℃过夜培养）；
2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗
生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜
1. 是一个复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携 带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增； 2. 有 1 到多个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于 外源基因的插入； 3. 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)，以此 知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将携带载体 的细胞从其他细胞中分离出来。
第一部分：分子克隆技术
将外源（某载体上的水稻）DNA
片段亚克隆到另一载体上。
pU1301
CaMV 35S promoter
Hin dIII (13575)
Terminator
Bam HI Sma I Kpn I (13246)
TEV Leader
Eco RI (13066) Eco RI (12426) Nco I (12076) Nco I (1)
碱裂解法用到的试剂
Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM EDTA 10 mM RNase A 100 µ g/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1% Solution III: Final concentration KAC 1.32 M Using HAC to adjust pH to 4.8
7.
12000 g离心10分钟；
8.
吸取800l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂 质）至另一个 1.5ml 离心管中，加入 2/3 体积的 异丙醇，室温下放置5分钟；
12000 g 常温离心15分钟；
TE (pH 8.0)： Tris.HCl （pH 8.0） EDTA （pH 8.0） 苯酚/氯仿 无水乙醇或异丙醇 10 mM 1 mM
试剂的作用（一）
Solution I: 重悬细菌; Solution II: 其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞 内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打 开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的 质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开;
质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或 表达外源基因的主要载体，它在基因操作中具有 重要作用。
质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验
技术。
质粒的基本特点
双链闭合环状 DNA分子，具有自主复制和转录 能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表 达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中， 也可整合到细菌染色体上。 质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞 周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1至几个 拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝 数较多，一般在细胞内有20个以上）。
Gus first exon Catalase intron Gus second exon Histidine tag
Bst EII
Mazie Ubiquitin promotor
Kpn I (11754) Sal I Hin dIII (11015) Bst XI
Nos poly-A
CaMV35S promoter
质粒的提取
碱裂解法，主要包括4个步骤： 1. 细菌的培养：从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的 培养基中，培养至对数生长后期；
2. 菌体的收集和裂解：通过离心收集菌体，NaOH/SDS处理
裂解细胞； 3. 染色体DNA 、RNA 及其它杂质的去除：碱处理后用冰冷的 KAC 缓冲液处理后离心； 4. 质粒的纯化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或异丙醇沉淀。
试剂的作用（二）
Solution III 中和后，宿主 DNA 由于很大，碱基 还未来得及配对就在冰冷的条件下与 SDS、蛋白 质、高分子量的 RNA 等缠绕在一起沉淀下来， 而质粒 DNA 由于很小且双链未分开，能够迅速 配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。
试剂的作用（三）
1. 苯酚/氯仿： 纯化质粒，去除质粒溶液中残留的 蛋白质等杂质； 2. 无水乙醇或95%乙醇或异丙醇：沉淀质粒DNA 3. TE 或H2O：溶解质粒DNA
培养；
3. 吸取1.5 ml菌液，12000 g离心1分钟，收集菌体， 倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽 量将菌液倒干净； 4. 加入300l Solution I振荡打匀，重新悬浮细胞， 震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 5. 加入300l Solution II，轻柔颠倒混匀，放置至 清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 6. 加入300l Solution III颠倒混匀，放置于冰上10 分钟，使杂质充分沉淀；
Xho I (9995)
PU1301
T-Border (right)
14336 bp
pVS1 sta
hygromycin (R)
Xho I (8901)
CaMV35S polyA T-Border (left)
Sac II
pVS1 rep
kanamycin (R)
pBR322 bom pBR322 ori