第三章基因组文库的构建

(b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬 菌体的蛋白被溶解，和重组体DNA分开， DNA吸附到膜上。再将此膜与带有放射 性同位素标记的探针进行分子杂交，可 以杂交的便是目的基因。带有此DNA的 克隆可通过放射自显影而显现出来。这 样阳性克隆可从培养基中分离出来，再 转接到新鲜的宿主菌中，使目的因得到 扩增。
序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部分离,直接和载 体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
存在的问题：
① 所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，
二. DNA片断大小的分部分离：
如已知含目的基因克隆片段的大小范围， 可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝 胶电泳将DNA群体按大小分部分离。
三.目的基因克隆片段的富集。
四.克隆数的确定
任一DNA序列在文库中出现的概率：
N ln(1 p) ln(1 I / G)
N:该序列需要克隆的总数； p:待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，
载体
( 选择一种)
大小分级
可供克隆的 DNA 片段
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与效价测定
筛选目的基因
扩增文库长期保存
构建基因组 DNA 和 cDNA 文库的流程示意图
用λ噬菌体置换型载体构建基因文库。用限制 性酶消解λ噬菌体载体，切除了中央的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将 约15kb的酶切片段随机地和λ噬菌体载体的两 臂连接，形成线性的重组的串联体。用体外包 装系统将串联体中单个的基因组DNA分别包装 入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌体颗 粒。用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬 菌斑。每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一 个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。
② 目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，筛出完整基因更不容 易。
2.随机片段化：
超声波：可产生300bp的短片段。
高速搅拌：1500转/分×30分 8kb的分子群体。
可切 平均长度
3.双酶消化
细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限制性酶剪切
尼龙膜 与放射性探针 进行分子杂交
膜
重组噬菌体
重组体DNA
细菌 感染
裂解
释放噬菌体
菌苔 噬菌体克隆文库
噬菌斑中的 噬菌体克隆
用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主菌
扩增外 源基因
cDNA文库(cDNA library) ： 克隆的重 组cDNA的集合，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
λ噬菌体感染这两种菌株时均不能产生噬菌体颗粒，但将 这两种裂解液合并在一起，由于基因的互补作用，可以产 生成熟的噬菌体颗粒。利用这个原理可以进行体外包装。
另一种思路是利用包装信号的突变体。λ噬菌体的 包装是通过头部蛋白上的A蛋白识别cos区，对由滚 环复制产生的串联体DNA加以剪切，正好将一个基 因组的DNA切下，包装成噬菌体颗粒。如制备cos位 点的突变体，使噬菌体可以合成完整的外壳蛋白， 但却不能包装，而重组质粒上装有正常的cos区， 从而能被包装成噬菌体颗粒。这两种策略都是 λ噬菌体突变体的溶原菌，来制备包装抽提物。
二是构建cDNA文库。cDNA文库是克隆的重组cDNA的总 和，通常是建立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特 定物种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。它是以细 胞中的mRNA为模板，用反转录酶合成的双链DNA。
组织
mRNA cDห้องสมุดไป่ตู้A
甲基化，加接头 的双链 DNA
DNA
部分或完全 消化的 DNA
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载
体容量，如噬菌体插入片段不超过25kb,为此可 选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为256bp) , 识别6bp的限制酶切割平均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过 1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分 子量可达10～30 kDa,它们存在着随机序 列重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可 将这些片段群体按大小分开，可得到的 分子量大小约为20kDa的随机DNA片段 群体。
λ噬菌体克隆文库的构建
(a)将外源基因组的DNA片段克隆到λ噬菌体载体 中来构建基因组DNA文库。菌苔上的噬菌斑中 含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来 自单个感染噬菌体的一个克隆。各个克隆带有 不同的细胞DNA片段。现在的难题是用探针与 带有目的基因的克隆进行杂交来鉴别携带着特 殊基因的克隆。
第三章 基因组文库的构建
在基因文库中存在两类基本的基因序列。
基因组文库(genomic library)即基因文库(gene bank)。
构建基因文库：
一是构建DNA文库。DNA文库是含有某种生物体全部基因的 随机片断的重组DNA克隆群体。其中可能含有基因外显子、 内含子、基因5'端调控区、3'端的尾随序列以及基因间的 间隔区。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多 克隆的过程，最终可建立cDNA文库。
建库的目的： 1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因； 2.是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中
分离稀有的cDNA克隆。 建库的关键： 如何产生足够数量的重组DNA 建库应注意： 1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA
体外包装
重组λ噬菌体载体的体外包装有两种不同的策略。一是利 用与编码包装蛋白的基因的突变体。野生型噬菌体的的包
装需要E、D、A等基因的产物，这些基因中的任何一个发
生突变噬菌体都不能顺利包装，从而在宿主的细胞中积累 了大量的前头部蛋白。BHB2688和 BHB2690两种菌株正是这
两种突变菌株，前者是E的突变体，后者是D 基因的突变体。