第三章基因组文库的构建
cDNA和基因组文库DNA的构建
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
第三章-基因组文库的构建
三、cDNA克隆载体
Zap cDNA克隆载体来自腺病毒系统，属于 噬 菌粒（phagemid）载体。线状的 Zap cDNA克 隆载体在体内能通过噬菌粒获救(phagemid rescue) 变成环状的表达载体。
(a) 噬菌体连续感染两个不同的E.coli 菌株，在这 两个菌株中一个噬菌体不受“限制”，而另一个 受到“限制”。结果,在kanr 菌落中获救，此菌落 中含有多个拷贝的双链质粒。
巨细胞病毒第三节 cDNA的筛选间接用探针筛选噬菌体cDN相关氨基酸密码子的简 并寡核苷酸探针；
（2）纯化蛋白质的相应抗体探针； （3）针对差异表达基因的扣除
cDNA探针。
探针的特异性可通过以下的策略来解决： ①选基因的特异序列为探针； ②长度不低于17～20nt； ③控制片段但酶的选择和酶切反应条件的选择是取决于克隆载体的类型重组噬菌体细胞基因组噬菌体尼龙膜与放射性探针进行分子杂交用放射自显影定位阳性克隆阳性克隆用限制性酶剪切提取dna用限制性酶剪切用连接酶连接重组体dna细菌感库的构建
用体外包装系统将串联体中单个的基因组DNA分 别包装入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌 体颗粒。
用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
将DNA亚克隆到质粒载体中的通用策略
①根据已知的酶切图谱进行定向克隆
（directed cloning）；
②用常用的限制性酶交错剪切或平切进行
随机亚克隆。
这种策略也称为“鸟枪法（shot-gun）”，即将 完整的基因组或部分基因组的DNA用限制性酶 或机械的方法随是将小片段逐一测序，再拼接 成序列图谱。
第三章 cDNA文库和基因组文库
片段
• 缺点： 酶切可能切断cDNA
对策：
利用切点稀少的限制酶
甲基化
• 接头（adapter）
是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，
另一头为平末端的特殊的寡核苷酸片段。
• 可能问题：
接头自身连接
• 解决方法：
接头分子一端磷酸化
具异常的5’-OH粘性末端结构的Bam稀少的限制酶
②dG：dC段可能影响转录和测序
back
同聚物加尾法克隆双链cDNA
通过依次加入、连接 合成的DNA衔接物 进行cDNA克隆
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
• 衔接物（linker）
指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成，具
有一个或数个限制酶识别为点的5% 15000种
• 步骤： ①新鲜材料 ②提取RNA（mRNA） ③第一条cDNA链的合成
反转录酶④第二条cFra bibliotekNA链的合成⑤双链cDNA同载体的连接
置换合成/引物-衔接头法
λgt10/ λgt11
利用oligo（dT）引物和反转录酶合成cDNA第一链
自身引导法合成双链cDNA
双链cDNA的置换合成
引物-衔接头法合成双链cDNA
• 双链cDNA的置换合成缺点：
缺少对应于mRNA5’端的几个核苷酸
• 引物-衔接头法优点： ①利于获得全长cDNA ②利于和载体连接 缺点： ①酶切可能切断cDNA
• 部分酶解片段越大，所需重组体数目越少 • 载体：λ噬菌体 细抑制自身连接 ②基因组DNA不互补，稍短的片段极不可能连接成 带有原基因组上非相邻DNA区段的结构
第3章 基因工程-【必背知识】高二生物章节知识清单(人教版选择性必修3)(教师版)
新人教版生物学选择性必修3《生物技术与工程》知识梳理第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
一、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。
①使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。
(1)EcoR①限制酶切割EcoR①识别序列为GAATTCEcoR①切割部位为GA之间的磷酸二酯键(2)Sma①限制酶切割Sma①识别序列为CCCGGGSma①切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。
2.种类E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3．比较与名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
基因组文库构建的基本过程
基因组文库构建的基本过程构建基因组文库，听起来是不是有点高大上？其实啊，这个过程就像是做一碗丰富的杂烩，里面有各种各样的成分，味道可好了。
今天就让我们轻松愉快地聊聊这个过程，从头到尾都不复杂，保证让你听完后恍若领悟了宇宙的奥秘！1. 基因组的准备首先，咱们得有“食材”，也就是目标基因组。
想象一下，像个侦探一样，你得先找到你要研究的生物，这可能是一只可爱的青蛙，或者一株神秘的植物。
然后，从这些生物体中提取DNA，这一步就像是把青蛙放在水里，慢慢观察它的变化。
提取DNA的过程其实也没那么神秘，简单来说，就是用一些化学试剂把细胞里的DNA分离出来。
就像剥蒜一样，简单又有效。
接下来，得把提取的DNA切割成小片段。
这就好比在厨房里把食材切成小块，方便后面的烹饪。
这个切割的过程，通常用一些特殊的酶，听上去高端，但实际上就是让DNA变得易于处理。
你可能会想，这么多小块到底怎么存起来呢？别急，接下来就要介绍基因组文库的“容器”了。
2. 构建文库2.1 载体的选择在我们的基因组文库中，载体就像是一个个小小的运输箱，专门用来存放那些切割好的DNA片段。
这里面有各种各样的选择，最常见的就是质粒，这种小圆圈状的DNA 能在细胞中独立复制，真是个省心的好伙伴！当然，也有其他的载体选择，比如病毒载体，听起来就有点神秘，实际上它们也只是利用病毒的特性来运送我们的DNA而已。
2.2 转化过程有了载体后，咱们就可以把这些小DNA片段装进去，进行转化了。
转化就像是给每个小箱子上锁，把它们装上货车，准备运输到指定地点。
通常我们会把这些装有DNA的载体放入细胞中，等待它们“安家落户”。
这一步可有讲究了，要控制好温度和环境，让细胞在“舒适”的状态下接纳这些新朋友。
3. 筛选与鉴定3.1 筛选一旦我们的载体和DNA片段都进了细胞，接下来就是筛选这些“小箱子”了。
这一步可以想象成是在参加一个聚会，大家都是陌生人，但你只想和那些有趣的、能引起你兴趣的人交朋友。
第三章基因工程目的基因的获取分离
用氢氧化钠消化杂合双链 中的 mRNA 链
解离的第一链 cDNA 的 3‘末端就会形成一个发夹环 （发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因 至今未知，据推测可能是 由帽子的特殊结构相关）
引导 DNA 聚合酶复制出第 二链，此时形成的双链之 间是连接在一起的
再利用 S1 核酸酶将连接处 （仅该位点处为单链结构） 切断形成平通过几种限制性内切酶切
割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克 隆，由此产N=ln（1DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
第一：细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
mRNA
总RNA
tRNA 第二：第一链 cDNA 合成；
rRNA 第三：第二链 cDNA 合成；
2 合成cDNA第一条链 第四：双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
（1）随机引物引导法
并导入宿主中繁殖。
（2）oligo（dT）引导法
（1）随机引物引导法 5´
链 cDNA 为模板合成一段段互补的序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5'
cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的
在 DNA 连接酶的作用下连接成一 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这
条链，即 cDNA 的第二链
种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几个核苷酸缺失， 但一般不影响编码区的完整。
查阅资料自学！
如何找回两膜或硝酸 纤维素滤膜之后，就可以同特异性
的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，
A 应用核酸探针分离克隆的目的基因 以便筛选出具有目的基因的阳性克 隆。这个过程叫做克隆基因的分离
基因组文库的构建过程
基因组文库的构建过程1. 基因组文库到底是什么？说到基因组文库，很多人可能会一脸懵，觉得这跟他们平常的生活完全扯不上关系，其实这就是科学家们用来储存基因信息的一种方式。
简单点说，就是把所有的基因像书一样整理好，方便后人查阅、研究和利用。
好比我们会把一本厚厚的食谱分门别类，想吃什么菜随时翻出来，这就是基因组文库的妙处。
在它的庇护下，科研人员就能随时拿出各种基因的“身份证”，让小小的基因发挥出超大能量。
2. 构建基因组文库的步骤2.1 提取DNA首先，咱们得从细胞中提取出DNA，这可是整件事情的开端。
就像从果子里挤出果汁，如果不先把果子准备好，你再想喝到果汁，简直是白日做梦。
提取DNA的过程看似简单，但可得小心谨慎，免得“失之毫厘，谬以千里”。
科学家们用各种化学试剂，像是一场小型的化学派对，最终把DNA提取出来，然后像捡到宝一样，小心呵护着。
2.2 进行切割提取完DNA后，接下来就是切割了！没错，听起来有点儿暴力，但这其实是为了让DNA变得更小，方便我们后面进行分析。
科学家们用一种特别的酶，就像料理大厨用刀切菜一样精准，可以把DNA切割成许多小片段。
每一片都是独特的，有点像拼图的每一块，只等着我们组合拼接。
2.3 建库接下来说到建库，小伙伴们要聚焦了！这一步可是整件事的重头戏。
科学家们会把这些切割好的DNA片段拷贝到一种载体中，类似把拼图放进一个大盒子里，当然这个“盒子”可是经过特殊设计，能确保我们的DNA安全无虞。
这个过程就叫做克隆，听起来是不是有点科幻感？别担心，脑子里别想太多电影情节，这可是正儿八经的科学探索。
3. 筛选和验证3.1 筛选目标片段库建完后，接下来就进入了筛选阶段。
就像我们去超市挑水果，总得挑一些看起来新鲜的，基因组文库也是如此。
一些基因有可能因为各种原因不太好，科学家们会通过培养和筛选，把一些很有潜力的基因片段挑出来。
这其中的细致和耐心，简直堪比工匠精神，得一丝不苟。
3.2 验证质量最后一步是验证，就像做一道菜，你不能光有调料，还得保证味道正宗。
文库构建及酵母双杂交技术
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1 基因组文库的构建基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。
1. 1构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。
1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。
不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。
1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
噬菌体载体构建基因组文库第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。
2.1高质量mRNA的制备应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。
将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
PolyAT tract mRNA 的分离纯化过程第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2.2反转录成cDNA可同时在反转录系统中加入Oligo(dT)12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；应选用活性较高的反转录酶(Reverse transcriptas)；应选用甲基化dCTP；应保证所获得双链cDNA 的方向性。
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序1. 引言基因组文库构建是现代生物学研究中的重要步骤之一。
通过构建基因组文库，研究人员可以将生物体的基因组DNA进行分离、纯化和扩增，为后续的基因组测序和功能分析提供重要的材料。
本文将介绍一种常用的基因组文库构建程序，并探讨其在生物学研究中的应用和意义。
2. 基因组文库构建程序概述2.1 DNA提取在进行基因组文库构建之前，首先需要从生物体中提取DNA。
DNA提取方法可以根据不同生物体类型和样本来源进行选择，常见的方法包括酚/氯仿法、离心法、商用DNA提取试剂盒等。
2.2 DNA片段化DNA片段化是将长链DNA切割为较短片段的过程。
常用的片段化方法包括限制性内切酶切割、超声波处理、化学法等。
选择合适的片段化方法可以根据后续实验需求和测序平台要求来确定。
2.3 DNA末端修复和连接在片段化后，需要对DNA末端进行修复，并在修复后对连接适配体进行连接。
末端修复可以通过使用DNA聚合酶和DNA连接酶来完成。
连接适配体是一种含有特定序列的DNA片段，可以与测序平台上的引物配对，使得测序引物能够与待测DNA片段结合。
2.4 DNA片段扩增和纯化连接适配体后，需要对文库中的DNA片段进行扩增和纯化。
扩增方法通常使用聚合酶链式反应（PCR）进行，以获得足够数量的文库DNA。
纯化则是通过凝胶电泳、磁珠吸附等方法去除杂质和副产物，获得高质量的文库DNA。
2.5 文库验证和测序最后一步是对构建好的基因组文库进行验证和测序。
验证可以通过凝胶电泳、定量PCR等方法来确定构建文库中的DNA片段长度分布、纯度以及数量。
而测序则可以使用各种高通量测序平台进行，并根据实验目标选择合适的测序深度。
3. 基因组文库构建程序在生物学研究中的应用3.1 基因组结构分析基因组文库构建程序为研究基因组结构提供了重要工具。
通过对不同细胞类型或不同物种的基因组文库进行测序，可以揭示基因组的结构变异、拷贝数变异以及染色质重排等信息，为研究基因组结构与功能的关系提供重要线索。
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
基因组文库的构建和应用研究进展
基因组文库的构建和应用研究进展
近几年，随着基因组学的发展，基因组文库的构建和应用也受到了广
泛的关注。
为了提高基因组研究的精准度，开发一个能够有效收集和保存
基因序列及其相关信息的"基因组文库"变得非常重要。
基因组文库构建的三个主要步骤是：(1)基因组DNA提取：提取植物、微生物、动物等生物样本中的基因组DNA；(2)DNA测序：对提取的基因组
进行高通量测序，以获得基因组的结构序列；(3)基因组比对：根据基因
组序列，进行其他基因组或蛋白质序列数据库的比对，以确定基因的位置
及功能。
基因组文库的应用主要是对基因组的实验研究，其常用的方法有：(1)基因表达研究：利用芯片、qPCR或其他方法，检测基因组中基因表达水
平的变化；(2)基因复制研究：利用基因组文库中保存的基因序列，进行
合成基因的复制；(3)基因突变分析：对基因组中基因结构的变化进行研究，确定其影响；(4)结构基因组学：根据基因组文库中的基因组序列，
可以研究基因组结构的改变和功能网络的构建。
此外，基因组文库还可以应用于其他领域，比如药物开发，因组文库
进行药物靶点的发现和研究；农业快速检测。
基因文库的构建
出于压缩重组克隆的数量，用于基因组构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或考斯质粒；对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体
由于绝大多数真核生物的几种载体的最大装载量如下：
质粒
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
ABC
DEF G
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
A
1
1
1
1
B
1
11
1
C
1
1111D Nhomakorabea1
1
11
1
E
1
1
1
1
F
1
1
11
G
1
1
1
1
01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 0的克隆都是随机序列，必须将所有的克隆排 列成一个像天然染色体DNA上所表现出的信息基因的基本概念 基因的构建程序 基因组重组克隆的排序
基因的基本概念基因库与基因
基因库（gene pool） 特定生物e bank） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式 存序列为探针，进行第二步走 读，直至线型染色体DNA的端点
染色体走读法（chromosome walking）
亚克隆旁测序列
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
基因组文库的构建培训讲学
3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基 中
方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为25% 的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。
缺点：需保存的列合成引物， 扩增特异性片段
结束语
谢谢大家聆听！！！
24
• 对于高等真核生物而言，基因组DNA十 分庞大,基因可达数万个，且基因组成结 构复杂，除编码序列，还有非编码序列 及调控序列，基因间还存在大量的间隔 序列和重复序列，因此，单个目的基因 在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以克隆子的保存与筛选1、基因组DNA的保存1) 影印膜滤保存法
2）在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培加的序列过多或过少。
（一）生物基因组DNA的提取 染色体DNA
（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024
2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb
①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的
提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的
部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染
宿主细胞； ⑤重
基因重组
体外包装
转化细菌四、生物基因组DNA的构建一个理想的基因组DNA应具备下列条件： • 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 • 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 • 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序基因组文库构建程序基因组文库构建是基因组学研究中的重要步骤之一，它是将DNA 分子切割成小片段，并将这些小片段插入到载体DNA中，形成文库。
文库构建的成功与否直接影响到后续的测序结果和分析结果。
因此，开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
基因组文库构建程序的主要步骤包括DNA片段切割、文库构建、文库质量控制等。
其中，DNA片段切割是文库构建的关键步骤之一。
DNA片段切割的方法有多种，如限制性内切酶切割、超声波切割、化学切割等。
不同的切割方法适用于不同的样品类型和研究目的。
例如，限制性内切酶切割适用于较小的基因组，而超声波切割适用于大型基因组。
文库构建是基因组文库构建程序的核心步骤之一。
文库构建的方法有多种，如插入式文库构建、接头式文库构建等。
插入式文库构建是将DNA片段直接插入到载体DNA中，而接头式文库构建则是在DNA片段的两端加上接头序列，再将其插入到载体DNA中。
接头式文库构建相对于插入式文库构建具有更高的文库构建效率和更低的文库构建偏差。
文库质量控制是基因组文库构建程序的最后一步。
文库质量控制的目的是检测文库的质量和纯度，以保证后续的测序结果和分析结果的准确性。
文库质量控制的方法有多种，如琼脂糖凝胶电泳、荧光定量、质量评估等。
其中，质量评估是文库质量控制的重要步骤之一，它可以评估文库的质量和纯度，并确定文库的适用范围和测序深度。
基因组文库构建程序是基因组学研究中不可或缺的步骤之一。
开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
未来，随着基因组学研究的不断深入，基因组文库构建程序的研究和开发将会越来越重要。
第三章基因文库的构建
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
16
一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
17
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
示差筛)
• 扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cD)得以实现的。
• 差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA 之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效 率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有 效的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆 的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂 交的筛选效率，一种切实可行
点，因此可用 P2 噬菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。在填充片段两端带有对称的多 克隆位点。
载体
• 质粒载体—用于基因组较小的生黏粒—45kb 细菌人工染色体（BAC）—350kb 酵母人工染色序列• 具有代表性的基因应该在最大限度上 覆盖所有的原初序列。
• 合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳
质粒载体
蓝白筛选
YAC载体
置换型载体
• 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段 的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆 外源片段的大小范围是 9-2cDNA内部， 在添加接头前先用EcoRⅠ甲基化酶甲基化。
• 最后用T4DNA连接酶连接。
cDNA末端的处理
• 末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆 载体末端互补的尾部
末端转移酶 末端转移酶
与载体的连接
• 载体先用碱性磷酸酶去磷酸化以防止载体 自连接。
• T4DNA连接酶连接载体与c龙膜 上；膜上的DNA在碱性 条件下变性，解聚形成 单链；再通过烤膜或紫 外线照射，单链将与膜 紧密结合；再将膜置于 含有放射性标记的核酸 探针的溶液中保温，使 探针与其互补序列进行 杂交；杂交后充分洗去 未杂交的探针，然后可 由放射性自显影鉴定。
（1原）位原位杂杂交交筛筛选选
第三章--基因工程目的基因的获取分离-幻灯片(1)
mRNA差异显示存在的问题
1 检测全部的mRNA工作量大
要获得mRNA的全部片段，必须有20个10个碱基长度的随机引物 和12个固定引物，有240种组合
2 引如物何片提段高过稀短有，m再R扩N增A时的产检率测低水平
非相关cDNA污染 因扩增片段短，特别是小于200bp的cDNA，Northern杂交检测无信号或 有信号无差异
缺 点: 在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导
致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链 cDNA分子
（2）双链cDNA的置换合成
它是由一组酶共同控制，包
括 RNA 酶 H 、大肠杆菌
DNA 聚合酶 Ⅰ 和 DNA 连接 酶。
优点:a)合成cDNA的效率高 b)直接利用第一链的反应产物，不需纯化
mRNA差别显示技术也叫DDRT-PCR（differential display RT-PCR），即差异显示RT-PCR。
理想的显示技术应具备：
1 重复性好；2 便于分离与鉴 定 在生物个体发育的不同阶段，或是在不同的组织或细胞中发生的不同基 因按时间、空间进行有序的表达方式，叫做基因的差别表达 （differential expression），生物的发育与分化、细胞的周期变化、 原生理物：体合对成2外组界引环物境，压通过力随反机应组，合以使及15个00体0种的m衰R老NA与都死有亡3’端等的所p有ol的y(A生)尾命，过而程在， po都ly可(A归)前结面于的基2个因碱的基差只别有表倒达数第。二位可以为A，故有12种组合的特点，把其中的3’
是应用广泛，而且相当有效，尤其适用于大量群体的筛选
2 寡核苷酸探针的人工合成
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体外包装
重组λ噬菌体载体的体外包装有两种不同的策略。一是利 用与编码包装蛋白的基因的突变体。野生型噬菌体的的包
装需要E、D、A等基因的产物，这些基因中的任何一个发
生突变噬菌体都不能顺利包装，从而在宿主的细胞中积累 了大量的前头部蛋白。BHB2688和 BHB2690两种菌株正是这
两种突变菌株，前者是E的突变体，后者是D 基因的突变体。
细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限交
膜
重组噬菌体
重组体DNA
细菌 感染
裂解
释放噬菌体菌苔 噬菌体克隆噬菌斑中的 噬菌体克隆用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主重 组cDNA的集合，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部分离,直接和载 体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
存在的问题：
① 所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，
λ噬菌体感染这两种菌株时均不能产生噬菌体颗粒，但将 这两种裂解液合并在一起，由于基因的互补作用，可以产 生成熟的噬菌体颗粒。利用这个原理可以进行体外包装。
另一种思路是利用包装信号的突变体。λ噬菌体的 包装是通过头部蛋白上的A蛋白识别cos区，对由滚 环复制产生的串联体DNA加以剪切，正好将一个基 因组的DNA切下，包装成噬菌体颗粒。如制备cos位 点的突变体，使噬菌体可以合成完整的外壳蛋白， 但却不能包装，而重组质粒上装有正常的cos区， 从而能被包装成噬菌体颗粒。这两种策略都是 λ噬菌体突变体的溶原菌，来制备包装抽提物。
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载
体容量，如噬菌体插入片段不超过25kb,为此可 选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为256bp) , 识别6bp的限制酶切割平均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过 1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分 子量可达10～30 kDa,它们存在着随机序 列重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可 将这些片段群体按大小分开，可得到的 分子量大小约为20kDa的随机D和，通常是建立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特 定物种或器官的所有mRNA制备得到的cDNA。它是以细 胞中的mRNA为模板，用反转录酶合成的双链DNA。
组织
mRNA cDNA
甲基化，加接头 的双链 DNA
DNA
部分或完全 消化的 DNA
(b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬 菌体的蛋白被溶解，和重组体DNA分开， DNA吸附到膜上。再将此膜与带有放射 性同位素标记的探针进行分子杂交，可 以杂交的便是目的基因。带有此DNA的 克隆可通过放射自显影而显现出来。这 样阳性克隆可从培养基中分离出来，再 转接到新鲜的宿主菌中，使目的因得到 扩增。
二. DNA片断大小的分部分离：
如已知含目的基因克隆片段的大小范围， 可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝 胶电泳将DNA群体按大小分部分离。
三.目的基因克隆片段的富集。
ln(1 I / G)
N:该序列隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,组中分离单拷贝的基因；的关键： 如何产生足够数量的重组DNA 建库应注意： 1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA
载体
( 选择一种)
大小分级
可供克隆的 DNA 片段
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与央的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将 约15kb的酶切片段随机地和λ噬菌体载体的两 臂连接，形成线性的重组的串联体。用体外包 装系统将串联体中单个的基因组DNA分别包装 入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌体颗 粒。用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬 菌斑。每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一 个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。
② 目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在 几个重组质粒上，筛出完整基因更不容 易。
2.随机片段化：
超声波：可产生300bp的短片段。
高速搅拌：1500转/分×30分 8kb的分子群体。
可切 平均长度
3.双酶消化