DNA甲基化及其检测

总结：基于重亚硫酸盐转化的方法
MSP, methylation-specific PCR; Ms-SnuPE, methylation-sensitive single nucleotide primer extension；Ms-SSCP, methylation-sensitive single-stranded conformational polymorphism; MS-REs, methylation-sensitive restriction endonucleases
启动子区甲基化芯片技术
HRM技术： 用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点 鉴 定感兴趣的CpG 岛 。
HRM技术原理
HRM技术原理
HRM特点
高灵敏性：可检测低达0.1%甲基化程度。 高通量：1次可同时检测不超过384样本，适用于 大样本多位点甲基化扫描。 高重复性：重复性100%。 使用范围广：不受碱基位点局限。 操作简便：只需设计特异引物，无须序列特异性探 针，无需测序。
表观遗传学目前的主要研究发现

DNA甲基化 染色质重塑 RNA调控（RNA干扰， 非编码RNA:microRNA,
long non-coding RNA等)
二、 DNA甲基化
DNA甲基化
RNA机制
组蛋白翻译后修饰

1950年，Wyatt在Nature上首次指出测序结果表明 DNA可能存在第5碱基。
图 1-1 MSRE-PCR原理图
注：左图DNA无甲基化, DNA被切断, 无法得到PCR产物; 右图DNA有甲基化, DNA保持完整,可以获得PCR产物.
基因诊断中心郑芳实验室
采用甲基化敏感性限制性内切酶技 术结合PCR的方法（MSRE-PCR） 筛选在肝癌与癌旁组织中有甲基化 差异的基因。
基因诊断中心郑芳实验室
焦磷酸测序法的局限性
利用该方法测定在人类基因组中大量存在且DNA甲基化高 发的重复元件Alu和LINE-1(long-interpread nucleotide element)的甲基化率，以它们的甲基化水平代表人类基因 组DNA甲基化的总体水平。但是该方法的得到的不是严格 意义上的全基因组DNA甲基化率，并不能精确的反映全基 因组DNA甲基化水平的实际情况。
空
21B 21BE 21A 21AE 17B 17BE 17A 17AE M
500bp 400bp 250bp 150bp 100bp
图1-3：DNM基因琼脂糖凝胶电泳图
注：M：Marker；E：加酶体系；A：癌组织；B：癌旁组织；空：水空白
基因诊断中心郑芳实验室
优点： ①方法相对简单； ②可进行甲基化水平的定量研究； ③需要样本量少。 缺点： ①只能获得特殊酶切位点甲基化情况。
mC, 5-methylcytidine; A, adenosine; C, cytidine; G, guanosine; T, thymidine.
定义 ‘Epi’genetics - ‘On’ or ‘over’ the genetic information encoded in the DNA
基因型不变的情况下，影响表型并能遗传的 现象，称为表观遗传或后生遗传。 表观遗传学研究的是在基因组DNA序列不变的 情况下，在表型上具有的稳定的、可遗传(或潜 在的可遗传性)的变化。
在细胞基因组上存在两类信息：
A- 遗传学信息 B- 表观遗传学信息
前者——维持细胞活性功能工厂的所有物质材料
后者——怎么建、何时建、在哪建的附加信息
基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以 记载遗传信息。
表观遗传的特点：广泛，多样， 复杂
DNA sequence coding
Epigenetic programming
DNA甲基转移酶： DNMT
胞嘧啶： Cytosine
5’-甲基胞嘧啶： 5Methylctosine S-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH
1）广泛性 2）可遗传性 3）可逆性 4）组织特异性
广泛性

CpG岛(CpG islands) 在结构基因5’端附近的调控区段， CG二联核 苷常常以成簇串联的形式排列，含量大于50%。 预测软件
•质谱分析
图6 PMVK基因扩增产物反向测序结果
图7 TRIB3基因扩增产物正向测序结果
应用二： 重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序 (Bisulfite-sequence PCR，BSP)
BSP克隆测序结果
43B 43BE
43A 43AE M
(369bp)
43A
43B
43B
注： A：癌组织；B：癌旁组织；○­：未甲基化；●：甲基化
如果他们出生在不同 的地方…
Basket ball player？
President？
Singer？
TV host？
基因
环境
表型
相同的基因型
?
不同的表型
什么是表观遗传学？
表观遗传学： 基因序列无变化
基因功能发生变化 可遗传并且是可逆的
表观遗传学机制： DNA甲基化
组蛋白修饰 RNA调控（RNA干扰， microRNA, long non-coding RNA等)
BSP克隆测序甲基化率三维图形
应用三： 甲基化特异性PCR (methylafionspecific PCR，MS-PCR)
甲基化特异性PCR
MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化 U M U M U M ladder
250 200 150 100
图
MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片
焦磷酸测序
焦磷酸测序
焦磷酸测序
焦磷酸测序的优势：
灵敏度高，可测到邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚 至包括测序的引物区域。 除常规的检测位点变化情况外，还可准确计算频率变化。 对于检测位点要求低，可检测未知序列信息，覆盖到人 类基因组的所有CpG位点； 对于样品要求低，适用于新鲜、冷冻和FFPE样本。
高效毛细管电泳（HPCE法）
Resolution of nucleosides obtained from enzymatic hydrolysis of genomic DNA from human cancer cell line HT29 by HPCE.
总体甲基化=100%×5mC/(5mC+5C）
武汉大学中南医院基因诊断中心
郑 芳



表观遗传学 DNA甲基化 DNA甲基化检测方法 研究进展
一、表观遗传学
现象1： 一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同
表达模式迥异
基因型相同
பைடு நூலகம்
现象3：
肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性， 而基因的DNA序列并不发生变化。
现象4： 橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似， 其实味不同。同一种水果，在不同产地生长，其味 道，大小，外观可能相差很远。
应用五：甲基化敏感性单链构象分析 （methylation specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）
甲基化敏感性单链构象分析
优点： ①能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析； ②能够对甲基化的等位基因进行半定量； ③可以提示甲基化状态分布的不均匀性。 缺点： ①只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而 较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG位 点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾 的现象，故敏感性及准确性略低； ②检测片段不宜过长。
不同甲基化检测方法的检测通量
sample throughput versus genome coverage. A plot of sample throughput against genome coverage for various DNA methylation techniques. Throughput is determined by the number of samples that can be analysed per experiment, based on large eukaryotic genomes. Coverage is determined by the number of CpGs in the genome that can be analysed per experiment. Daniel Zilberman et al. Development 134, 3959-3965 (2007)
应用四：结合重亚硫酸盐的限制性 内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
甲基化特异性的限制性内切酶： 可以识别甲基化的胞嘧啶 甲基化敏感性的限制性内切酶： 可以识别甲基化的胞嘧啶
基因诊断中心郑芳实验室
其他，如改变染色质结构，…
DNA甲基化的功能
DNA 修复 癌基因代谢
DNA 甲基化
基因表达的调节
细胞周期 凋亡
分化
三、DNA甲基化检测手段
DNA甲基化检测方法总览
主要检测途径
•3-1 基于重亚硫酸盐转化的方法 •3-2 不基于重亚硫酸盐转化的方法
3-1基于重亚硫酸盐转化的方法
质谱分析
•水解核苷酸
优点： 可同时检测基因组内多个CpG位点。实验结果易解 释，成本低廉。
缺点： ①由于CG仅限于内切酶识别序列中，因此非识别序 列的CG将被忽略； ②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态 时，该检测方法的结果才有意； ③需要样本量大； ④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题； ⑤不适用于混合样本。
3-2 整体甲基化水平的检测方法
全基因组整体甲基化水平的分析
应用一： 高效液相色谱法（HPLC) 高效毛细管电泳（HPCE）
高效液相色谱法（HPLC) 高效毛细管电泳（HPCE）
先将DNA样品经过盐酸或氢 氟酸裂解为单个碱基（A, T, 5C, G, 5mC), 水解产物通过色 谱柱或毛细管，将结果与标 准品比较，紫外光测定吸收 峰值，计算5mC/(5mC+5C)的 积分面积得出基因组整体的 甲基化水平。 相比HPLC, HPCE方法更加简 便，快速，经济。两种方法 测定基因组DNA甲基化水平 的敏感性均较高。
甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。
研究结果
SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态
MSP扩增产物凝胶电泳图
注：M表示 甲基化，U表示未甲基化 B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5 为正常对照组五例标本； H2O为阴性对照；m为50bpMarker。
优点： ①操作简便； ②敏感性高。 缺点： ①引物设计要求高； ②只能作定性研究； ③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； ④只能了解部分位点的甲基化状态。
标本范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋 的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液 标本、粪便标本等非手术标本的检测。
应用十：焦磷酸测序法
焦磷酸测序法（Pyrosequencing）
•是由4种酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶催化的同一反 应体系中的酶级联化学发光反应 •每一轮测序反应体系中只加入一种dNTP。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合 酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的 dNTP和释放的PPi是等量的 •ATP硫酸化酶催化PPi与5’-磷酰硫酸（APS）结合形成ATP，然后在荧光素酶的催化作 用下，生成的ATP和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。CCD感应器检测到 光信号后，Pyrogram转化为检测峰，每个峰的高度（光信号）与掺入的核苷酸数目呈 正比 •Apyrase不断降解未掺入的核苷酸和ATP，淬灭光信号，再生反应体系
http://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html

http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/
A: 未甲基化或低度甲 B: 甲基化的CpGs阻 C: MBP ( Me-CpG 基化的启动子能够允 止转录因子的结合， binding protein ) 也 许转录正常进行。 因此阻止转录。 阻止转录因子和启动 子区的结合。