免疫组织化学染色
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点摘要：一、免疫组织化学染色的概念二、免疫组织化学染色的原理三、免疫组织化学染色的方法四、免疫组织化学染色的应用五、免疫组织化学染色的优缺点正文：免疫组织化学染色是一种将免疫学原理应用于组织学的方法，通过化学反应使组织中的抗原与抗体结合，从而检测特定抗原在组织中的分布和表达情况。
该技术广泛应用于生物学、医学等领域，对疾病诊断、研究及治疗具有重要意义。
免疫组织化学染色的原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应。
首先，通过化学或物理方法暴露组织中的抗原，然后用特异性抗体与抗原结合，最后通过显色反应检测结合情况。
常用的显色方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光染色法等。
免疫组织化学染色方法包括以下几个步骤：1.组织处理：固定、脱水、透明、浸蜡等；2.抗原修复：去除组织中的封闭抗原，暴露目标抗原；3.免疫染色：用特异性抗体与抗原结合；4.显色：检测抗体与抗原结合后的显色反应；5.观察和分析：通过显微镜观察染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况。
免疫组织化学染色技术在生物学和医学领域具有广泛应用：1.疾病诊断：通过检测特定抗原的表达，辅助诊断疾病，如肿瘤、炎症等；2.疾病研究：研究抗原在疾病发生和发展过程中的作用机制；3.药物研发：检测药物对特定抗原的影响，评估药物疗效；4.肿瘤分期和预后评估：通过检测肿瘤组织中抗原的表达情况，评估肿瘤分期和预后。
免疫组织化学染色技术具有以下优缺点：优点：1.高敏感性：能够检测微量抗原；2.高特异性：特异性抗体与抗原结合，减少交叉反应；3.定位准确：显示抗原在组织中的分布和表达情况；4.易于操作：方法简单，仪器设备要求较低。
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点摘要：1.免疫组织化学染色的基本概念2.免疫组织化学染色的原理与应用3.免疫组织化学染色的操作步骤4.免疫组织化学染色中的关键试剂与技术5.免疫组织化学染色在医学诊断与研究中的应用6.免疫组织化学染色的优缺点及改进方向正文：免疫组织化学染色是一种检测组织切片或细胞样本中特定抗原或抗体的方法，它结合了组织学、免疫学和化学技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物研发等领域。
免疫组织化学染色的基本原理是基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在染色过程中，首先将待检测的组织切片与特定抗体结合，然后加入抗原-抗体复合物，最后通过化学反应显色。
根据显色结果，可以判断组织中特定抗原或抗体的存在与否，从而为临床诊断、疾病研究提供重要依据。
免疫组织化学染色操作步骤主要包括以下几个方面：1.抗原修复：通过加热或酸碱处理，使组织中的抗原决定簇暴露，便于抗体结合。
2.切片：将组织样本切割成薄片，便于后续染色和观察。
3.脱蜡：将切片脱去脂肪和蜡质，使抗原抗体更容易结合。
4.抗原处理：对切片进行抗原修复，增强抗原性。
5.抗体染色：将切片与特定抗体结合，孵育一段时间，使抗体与抗原发生反应。
6.冲洗：去除未结合的抗体，防止背景染色。
7.显色：加入显色剂，使抗原-抗体复合物呈现特定颜色。
8.复染：为了更好地观察细胞结构和核染色，可以进行复染。
9.封片：用封片剂固定切片，便于长期保存和观察。
在免疫组织化学染色过程中，关键试剂与技术包括：1.抗体：针对特定抗原的抗体，如单克隆抗体和多克隆抗体。
2.抗原修复液：用于修复组织中的抗原决定簇。
3.显色剂：如DAB、HRP等，能使抗原-抗体复合物呈现特定颜色。
4.酶标二抗：用于检测抗原-抗体复合物的酶标二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）等。
5.酶标仪：用于检测酶标二抗的活性，从而判断抗原或抗体的表达水平。
免疫组织化学染色在医学诊断与研究中的应用主要包括：1.肿瘤诊断：通过检测肿瘤标志物，如CEA、AFP等，辅助临床诊断肿瘤。
免疫组织化学染色原理
免疫组织化学染色原理
免疫组织化学染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定分子的存在和定位。
它基于免疫反应的原理，即针对特定抗原的特异性结合。
免疫组织化学染色的步骤包括固定、抗原解脱、抗原检测和染色四个主要步骤。
首先，需要将组织固定在载玻片上，通过化学处理来保留组织结构和抗原的位置。
然后，通过抗原解脱的步骤，去除组织中的其他成分，使得需要检测的抗原能够更好地暴露出来。
接下来，进行抗原检测。
这一步骤在免疫组织化学染色中非常关键，它使用特异性的抗体来与待检测的抗原结合。
抗体可以来源于动物、人类或是由基因工程技术合成。
最后，进行染色步骤。
常用的染色方法有酶标记技术和免疫荧光染色。
在酶标记技术中，抗原和抗体结合的位置会形成反应物质，如染色剂或显色物质，使得抗原的位置能够被视觉观察到。
而在免疫荧光染色中，抗体通常会被标记上荧光物质，其发出的荧光信号能够在显微镜下被观察到。
免疫组织化学染色的原理是利用抗体与抗原特异性结合来检测特定分子在组织中的存在和定位。
这种技术被广泛应用于医学研究、疾病诊断和药物研发等领域，为我们提供了对组织内分子进行定性和定量分析的重要工具。
免疫组织化学染色实验步骤
免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。
主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。
器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。
设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。
2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。
通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。
固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。
切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。
3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。
选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。
之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。
5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。
封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。
6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。
覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。
7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。
洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。
8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。
孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。
9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。
洗涤操作与步骤7相同。
10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。
免疫组织化学染色技术
03 免疫组织化学染色技术的 操作流程
样本的收集与处理
01Βιβλιοθήκη 0203样本类型
免疫组织化学染色技术可 应用于各种组织样本，如 石蜡切片、冰冻切片、细 胞涂片和组织块等。
样本处理
在染色前，需要对样本进 行适当的固定、脱水、包 埋和切片等处理，以确保 抗原的完整性和活性。
样本标记
在切片过程中，需对组织 进行标记，以便后续的定 位和观察。
04 免疫组织化学染色技术的 优化与改进
抗体选择与优化
总结词
抗体选择是免疫组织化学染色技术的关键步骤，直接影响到染色结果的特异性和敏感性。
详细描述
在选择抗体时，应考虑抗体的来源和生产过程，以确保其质量和可靠性。同时，应选择针对目标抗原具有高亲和 力的抗体，以提高染色结果的特异性。此外，可通过实验验证抗体的最佳工作浓度，以实现最佳的染色效果。
染色结果的检测与评估
染色结果的检测与评估是免疫组织化学染色技术的最后步 骤，也是最为关键的一步。检测方法包括显微镜观察、图 像分析等。评估染色结果时，需要综合考虑染色强度、阳 性细胞的数量和分布等因素，以得出准确的结论。
染色结果的检测与评估对于病理诊断、肿瘤研究等领域具 有重要意义。通过免疫组织化学染色技术，可以检测组织 中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病的诊断和治疗提供 有力支持。
抗原修复与阻断
抗原修复
通过加热或化学方法使抗原从组织中 暴露出来，以便抗体能够与其结合。
阻断
为了防止非特异性染色，需要用阻断 剂对组织进行阻断，以消除内源性过 氧化物酶和生物素等物质的干扰。
抗体孵育与洗涤
抗体选择
根据研究目的选择特异性抗体，确保其能够与目 标抗原特异性结合。
抗体孵育
免疫组织化学染色技术PPT课件
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
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2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
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第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
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尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点
免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，简称IHC）是在组织切片或细胞制片的基础上，通过利用特异性抗体与细胞或组织中特定分子间的特异性结合反应，以染色或标记方式来检测目标抗原的一种检测技术。
以下是免疫组织化学染色的一些基本知识点：
1. 抗体选择：根据实验目的选择合适的抗体，一般选择单克隆或多克隆抗体。
抗体可以是来自同种或异种动物，也可以是人源化的。
2. 组织或细胞预处理：包括固定、脱脂、脱水和切片等步骤，目的是保持组织或细胞的形态和结构完整，同时提高抗体的进入性。
3. 抗原解表：染色前需进行抗原解表处理，去除组织或细胞中的内源性酶等物质，以提高抗体的结合效率。
4. 特异性抗体结合：将经过解表处理的组织或细胞与选择的特异性抗体反应，抗体与目标抗原结合形成免疫复合物。
5. 二抗结合：特异性抗体结合后，使用与该抗体结合的二抗（常为抗种属免疫球蛋白）进行结合，放大信号。
6. 染色反应：根据具体实验的需要，可以选择不同的染色反应方法。
常用的染色方法有酶标法（如辣根过氧化物酶染色法，碱性磷酸酶染色法等）和免疫荧光染色法。
7. 结果观察和分析：观察染色结果，可以通过显微镜观察染色位置和程度，分析目标抗原在组织或细胞中的分布情况。
8. 数据分析和结果解读：根据染色结果，进行数据统计和分析，并结合实验设计和背景知识进行结果解读和推断。
总结：免疫组织化学染色是一种用于检测组织或细胞中特定抗原的技术，通过选择合适的抗体、预处理样品、特异性抗体结合、染色反应等步骤，可以获得目标抗原的位置和分布情况，并通过数据分析和结果解读来获取有效的实验结果。
免疫组织化学染色诊断
免疫组织化学染色诊断
免疫组织化学染色诊断是一种有效检测疾病的技术，它搭配使用专门染色剂和适当的技术进行诊断测试，被用于诊断细胞学疾病，及其它方面。
在这种技术中，把生物标志物，如抗体和其他免疫技术，应用到染色剂的作用上，以确定细胞的分子特征，以及诊断特定疾病的有效性。
由于免疫组织化学染色诊断的特殊性，所以有许多特定的染色剂和技术可用于组织的检测，其中包括柱状染色、滴状染色、板条状染色、对比染色、流质镜等。
免疫组织化学染色诊断除了检测细胞学疾病，还能应用于分子水平上，如诊断小分子抗原、癌标志物、抗原和抗体相关物质、微生物感染诊断、病毒感染诊断、病理活性细胞检测、血清成分检测等。
免疫组织化学技术有多种规格，如单价染色、双抗体染色、多抗体染色、免疫荧光染色和三维染色等，可根据需要进行技术设计。
不同的免疫组织化学染色技术有不同的步骤，但总体上有一些共同的步骤，如水浴的准备，模板的选择，标本的准备，阳性对照的准备，油脂的准备等。
之后，试剂的选择，主要根据染色要求，在可用性和准确性之间取得平衡。
最后，根据用到的染色剂，以及染色时间，灯光和温度条件等参数，来进行染色。
完成染色后，就可以用显微镜查看染色的特点，通过比较可以得出诊断结果。
免疫组织化学染色诊断是一种重要的检测技术，它用于检测细胞学疾病，也可以应用于生物标志物的检测，如抗体等。
另外，由
于所需的技术步骤较简单，以及所需要的设备较少，所以它也成为临床检测疾病的重要技术工具。
它在癌症等重大疾病的诊断上也有着重要的应用。
组织染色技术也可以为疾病的预防、诊断和治疗提供重要的信息，使得更多的疾病能够早期发现和治疗，保障人们的健康。
免疫组织化学染色技术
病毒载量评估
染色技术可以定量检测组织中病毒的数量，有助于评估病毒复制 活跃程度和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他感染性病变进行鉴别诊断，有助于确定病因 和治疗方案。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
通过染色技术可以检测组织中自身抗体的存在， 有助于诊断自身免疫性疾病。
炎症反应评估
染色技术可以反映组织炎症反应的程度和范围， 有助于判断病情进展和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他非自身免疫性疾病进行鉴别 诊断，有助于确定病因和治疗方案。
药物靶点筛选
药物作用机制研究
染色技术可以用于研究药物的作用机制和靶点，有助于发现新的治 疗方法和药物。
药物筛选
染色技术可以用于筛选具有潜在治疗作用的候选药物，有助于降低 药物研发成本和时间。
床常用指标。
病毒检测案例
总结词
免疫组织化学染色技术可用于病毒的快速检测和鉴定， 具有高灵敏度和特异性。
详细描述
在病毒检测中，该技术常用于检测病毒抗原或抗体，以 确定病毒的存在和感染程度。例如，在COVID-19诊断 中，通过免疫组织化学染色技术检测病毒抗原，有助于 快速确诊和防控疫情。
自身免疫性疾病诊断案例
未来展望
随着蛋白质组学、基因组学等领域的快速发展，免疫组织 化学染色技术将继续发挥重要作用，并有望在临床诊断、 药物研发等领域取得更多突破。
02
免疫组织化学染色技术的基本步 骤
样本准备
样本类型
组织样本、细胞样本等，要求新鲜、无菌、无杂质。
样本处理
清洗、切割、固定等，确保样本的稳定性和染色效果。
免疫组织化学技术名词解释
免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。
免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。
1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。
免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。
常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。
2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。
在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。
通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。
3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。
抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。
在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。
4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。
根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。
其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。
5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。
每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。
6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。
在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。
在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。
7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。
常用免疫组织化学染色方法
常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。
它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。
以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。
常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。
IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。
2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。
它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。
利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。
3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。
通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。
这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。
4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。
常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。
在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。
5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。
免疫组织化学染色技术
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荧光素-抗体标记
❖ FITC-IgG（蛋白）
技术类型
❖ 直接染色法 ▪ 荧光素直接标记在特异性抗体（Ab1)
❖ 间接染色法 ▪ 荧光素标记第二抗体（Ab2) ▪ 第二抗体针对第一抗体种属特异性的表 位（如羊抗鼠Ig或羊抗人Ig）
直接法
❖ 优点 ▪ 简单 ▪ 特异
实例：细胞鉴定
❖ 免疫细胞及其亚群（流式细胞术） ▪ T细胞 • CD3+
荧光素
❖ 异硫氰酸荧光素（FITC）
黄绿色荧光
520-530 nm
490-495 nm
荧光素
❖ 四乙基罗丹明（RB200）
橘红色荧光
625 nm
540 nm
荧光素
❖藻红蛋白（PE）
488-561 nm
578 nm
荧光素
❖别藻蓝蛋白（Allophycocyanin, APC ）
660 nm
650 nm
免疫组织化学染色技术
李会强 医学检验学院
Email:lihuiqiang1965@
组织化学染色技术
❖ Histochemistry Technique
❖ 观察对象
▪ 组织、细胞
❖ 使用工具
形
态
▪ 普通显微镜
与 结
▪ 荧光显微镜
构
苏木素 曙红
免疫组织化学染色技术
❖ Immunohistochemistry Technique ▪ 指用标记的特异性抗体在组织细胞原位 通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反 应，对相应抗原（目的蛋白）进行定性、 定位、定量测定的一项免疫检测方法。
标本类型
❖ 组织标本 ▪ 冰冻切片 ▪ 石蜡切片（脱蜡和水化）
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤
免疫组织化学染色步骤：
1.石蜡切片脱蜡至水化。
2.3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
3.蒸馏水冲洗，磷酸缓冲盐溶液（PBS）浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）。
4.5~10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃。
5.PBS冲洗，5分钟×3次。
6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%牛血清白蛋白（BSA）-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7.PBS冲洗，5分钟×3次。
8.滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
9.PBS冲洗，5分钟×3次。
10.显色剂显色（DAB或AEC）。
11.自来水充分冲洗，复染，封片。
12.冰冻切片免疫组化染色步骤。
13.冰冻切片4~8mm,室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分
钟，PBS洗，5分钟×3.用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点
【原创实用版】
目录
1.免疫组织化学染色的概念和原理
2.免疫组织化学染色的方法和步骤
3.免疫组织化学染色的应用和案例
4.免疫组织化学染色的发展趋势和前景
正文
一、免疫组织化学染色的概念和原理
免疫组织化学染色是一种通过抗原抗体反应的原理，检测组织切片中特定抗原的表达情况，并将其染色显示出来的技术。
这种技术广泛应用于疾病诊断、病情监测、疾病研究等领域。
二、免疫组织化学染色的方法和步骤
免疫组织化学染色的方法主要包括 LSAB 法和 SP 法。
这两种方法的步骤大致相似，主要包括切片处理、抗原修复、抗体孵育、复合物孵育、染色和核染色等。
1.切片处理：包括切片脱蜡至水、H2O2 甲醇处理切片、水洗等。
2.抗原修复：通过加热或化学方法，使组织切片中的抗原得到修复。
3.抗体孵育：将特异性抗体与组织切片孵育，使其与抗原结合。
4.复合物孵育：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。
5.染色：加入染色剂，如 DAB-H2O2，使免疫复合物呈现颜色。
6.核染色：用苏木素等染料染色，使细胞核呈现颜色。
三、免疫组织化学染色的应用和案例
免疫组织化学染色在临床诊断、疾病研究、肿瘤生物学等领域有着广泛的应用。
例如，通过免疫组织化学染色可以检测肿瘤组织中的癌基因、肿瘤标志物等，帮助医生诊断病情、制定治疗方案。
四、免疫组织化学染色的发展趋势和前景
随着科学技术的发展，免疫组织化学染色技术也在不断发展和完善。
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色免疫组织化学染色（IHC）是一种在组织学检查中使用的技术，通过使用适当的抗体，可以在细胞和组织的切片中检测特定的抗原分子。
因此，IHC 已成为临床病理学和分子生物学中最常用的技术之一。
本文将更深入地介绍 IHC 的原理和过程，并探讨其在医学研究和临床实践中的应用。
1. IHC的原理IHC是通过抗体对靶分子的特异性识别来实现其在组织中的检测的。
IHC 技术需要在切片中实现以下几个步骤:1）在组织切片中暴露特定的抗原2）使用专门的一抗体与抗原靶标结合3）使用与一抗体结合的二抗体，在组织切片中产生荧光信号4）用显微镜观察和分析荧光信号这些步骤是在组织化学方法的基础上开发的。
和化学染色技术不同的是，IHC 不使用化学剂来产生颜色，而是使用特定的荧光剂和相应的光学仪器来检测抗原。
2. IHC的应用IHC技术被广泛应用于病理学中，可用于进行肿瘤诊断和疗效判断。
由于IHC可检测多种分子标记，在病理学上广泛应用，尤其是对于那些无法通过组织学或直接检测技术得到明确诊断的疾病。
除了在癌症诊断中的应用，IHC还被广泛应用于基因科学和生物技术领域。
IHC技术也可用于检测序列变异，并通过组织对不同的基因表达型进行上调或下调检测。
IHC还可以用于评估药物的靶向治疗作用，因为它可以确定药物的分子靶标是否在肿瘤组织中被表达或过度表达。
3. IHC的优缺点虽然IHC技术在医学研究和临床实践中具有许多优点，但在使用时也需要注意到一些问题。
在选择一抗体和二抗体时需要特别谨慎，因为错误的选择可能会导致技术上无效或结果不准确。
另外，IHC技术还需要相对专业的仪器和高昂的成本，大大增加了检测费用。
此外，IHC技术也需要对样本的抗原表达模式和抗原种类有一定的了解，以选择适当的抗体和配对规格。
然而，总体来说，在复杂和多样性的细胞和组织样本中，IHC技术仍然是一种准确和高效的检测方法。
结论总之，免疫组织化学染色是一种强大而有效的技术，可用于检测细胞和组织中特定的抗原分子。
免疫物质化学染色诊断单独温控法
免疫物质化学染色诊断单独温控法一、介绍免疫组织化学染色是一种常用的组织学检测技术，通过发现组织中特定的抗原，用抗体与其结合，并通过染色方式对其进行标记，从而实现对组织中特定抗原的检测。
免疫组织化学染色在病理学、临床医学和生物医学研究中具有重要意义。
而免疫物质化学染色诊断单独温控法是其中的一种重要技术。
二、免疫物质化学染色诊断单独温控法的原理1. 抗原获取：首先需要获取样本组织中的目标抗原。
2. 抗体结合：将特异性抗体与目标抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
3. 标记：将标记物标记在抗体上，通常使用酵素或荧光物质进行标记。
4. 染色：将标记后的抗体与组织样本反应，形成颜色或荧光信号，从而显示出目标抗原在组织中的分布和强度。
5. 观察：根据染色结果进行光学或荧光显微镜观察，并通过图像分析系统进行定量分析。
三、全面评估免疫物质化学染色诊断单独温控法1. 技术优势：- 高灵敏度：能够检测组织中的微量抗原，并在显微镜下清晰显示出来。
- 特异性：能够区分不同类型的抗原，对于病理学诊断具有重要意义。
- 定量分析：通过图像分析系统，能够对染色结果进行定量分析，为研究和临床诊断提供客观数据支持。
- 彩色标记：染色结果可以呈现出不同的颜色，方便对多种抗原同时进行检测和比较。
2. 技术挑战：- 样本处理：需要对组织样本进行严格的脱水、嵌入和切片处理，以保证染色效果和信号清晰度。
- 试剂选择和配比：选择和配比不当可能会影响染色效果。
- 染色条件：温控是影响免疫组化染色结果的重要因素之一，适当的温控有助于保证染色的稳定性和重复性。
3. 个人观点和理解：免疫物质化学染色诊断单独温控法在临床医学和研究领域具有重要意义，通过对特定抗原的检测，可以帮助医生进行病理诊断，指导临床治疗，并且对于疾病的发病机制研究也有着重要的作用。
其中，温控是保证染色效果和信号稳定性的重要因素，单独温控法的使用可以更为准确地控制染色条件，提高染色质量和可重复性。
免疫组织化学染色诊断标本
免疫组织化学染色诊断标本
免疫组织化学染色是一种常用的诊断手段，可以通过特定抗体与组织标本中的特定分子结合，从而揭示组织中的病理变化和疾病的诊断。
常见的免疫组织化学染色标本包括：
1. 组织切片：通过组织切片可以观察组织结构和细胞排列情况，并进行免疫组织化学染色以检测特定蛋白或分子的表达情况。
2. 血液标本：血液标本可以用于免疫组织化学染色，例如对血液中的细胞进行表面抗原的检测，用于诊断血液系统相关的疾病。
3. 涂片：涂片一般采用刮取或刷取方式收集组织或细胞，然后涂在载玻片上，用于检查炎症、癌变等情况。
4. 空洞液体：空洞液体标本可以用于免疫组织化学染色，例如腹水、胸水等。
通过检测液体中特定蛋白的表达情况，可以辅助诊断液体积聚的原因。
5. 组织脱落细胞：组织脱落细胞可以通过涂片或细胞块的方式收集，用于诊断癌症等疾病。
免疫组织化学染色标本的选择取决于具体的疾病类型和需要检测的蛋白或分子。
免疫组织化学染色 诊断
免疫组织化学染色诊断1.什么是免疫组织化学染色免疫组织化学染色是一种在组织中检测特定分子的方法。
它基于抗体-抗原反应的原理，利用免疫抗原识别的能力快速、定量地确定组织中特定分子的分布与数量。
免疫组织化学染色的主要原理是使用特异性抗体识别并定位组织中感兴趣的分子。
2.免疫组织化学染色的应用领域免疫组织化学染色在医学领域中应用广泛。
它可用于确定细胞或组织中某些蛋白质或抗原的存在、缺失或异常表达等。
此外，它还可以帮助诊断和治疗许多疾病，例如癌症、免疫疾病、感染、自身免疫性疾病等。
免疫组织化学染色可用于检测癌细胞、病毒感染等，从而识别疾病类型、病情严重程度和转移潜力。
同时，它还被广泛应用于生物技术研究和仿生医学领域，如蛋白质研究、药物研发等。
3.免疫组织化学染色的常见方法目前，常用的免疫组织化学染色方法包括免疫荧光染色、酶测定法、免疫过氧化物酶染色、碱性磷酸酶染色、酸性磷酸酶染色等。
4.免疫组织化学染色的基本步骤（1）样本制备：组织样品必须经过切片及染色前的某些处理，如切片、脱水和透明化等。
（2）抗原预处理：为了增强抗体与抗原之间的结合力，必须对组织样品进行预处理。
有许多方法可用于抗原的加热、固定和破裂处理。
（3）抗体处理：抗体是免疫组织化学染色的关键。
它必须与病理组织中的目标抗原特异性结合。
（4）检测染色：检测染色是用于检测所需分子或细胞在组织中分布情况的关键步骤。
检测染色一般可用荧光染色、酶标记染色、过氧化物酶染色等技术。
5.免疫组织化学染色与其他组织化学染色方法的比较相对于传统的组织学和病理学染色方法，免疫组织化学染色具有以下优点：（1）稳定性更好：传统组织学染色易受外部因素影响而导致失真。
而免疫组织化学染色具有更好的稳定性和可靠性。
（2）分辨率更高：免疫染色可以通过选择抗体来检测复杂的具有高度分子异质性的生物标志物分子。
（3）特异性更强：传统组织学染色往往无法区分细胞和组织中的细微差别，而免疫组织化学染色可以通过选择特异性较强的抗体来识别和区分不同的细胞或组织。
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免疫组织化学染色（IHC）
定义：
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化原理
抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化检测标本
1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；
2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。
免疫组化操作步骤
①石蜡切片制作
1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，
70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h
3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。
4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45 min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5 h或侵蜡过夜，用石蜡（Ⅲ）包埋组织。
5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7 μm厚度的组织切片。
6、贴片：将组织石蜡切片放在在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上
7、烤片：68℃恒温箱内烤片2-4 h
②免疫组织化学染色（SP三步法）
1、脱蜡
取出烘烤后保存的石蜡切片，室温放置30 min，然后分别在二甲苯I、II、III中浸泡各10 min。
2、复水
无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各5 min→95%乙醇溶液5 min→80%乙醇溶液5 min→70%乙醇溶液5 min→50%乙醇溶液5 min→ddH2O 5 min。
3、PBS冲洗2-3次，每次5min
4、灭活
3% H2O2溶液孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性
5、PBS冲洗2-3次，每次5min
6、抗原修复
将切片置于0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温
7、PBS冲洗2-3次，每次5min
8、封闭
滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体；
9、滴加Ⅰ抗50 μl，室温静置1 h，或者37℃ 1 h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）；
10、PBS冲洗2-3次，每次5min；
11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50 μl，室温静置1 h，或371
℃ h；
12、PBS冲洗2-3次，每次5 min；
13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30 min-1h；
14、PBS冲洗2-3次，每次5 min；
15、显色：DAB显色5-10 min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）
（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）
（A：DAB B：H2O2C：磷酸缓冲液）
16、自来水冲洗10分钟终止反应
17、复染：苏木精复染2 min，盐酸酒精分化
18、自来水冲洗10-15min
19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检
③结果分析
每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。
免疫组化常用试剂及设备：
1、PBS：0.01 M磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)
2、固定液：4% 多聚甲醛溶液 (pH 7.4)
3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%
4、二甲苯
5、包埋剂：石蜡
6、防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）
7、抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0），或0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）
8、SP超敏免疫组化试剂盒（包括试剂A、B、C、D）
试剂A --阻断剂：3%甲醇-H2O2溶液（30% H2O2和80%甲醇溶液配制）
试剂B --封闭液：正常非免疫动物血清
试剂C --二抗（辣根过氧化物酶标记）
试剂D --SP（链霉亲和素-过氧化物酶）
9、一抗（特异结合底物）
10、显色剂：DAB试剂盒、苏木素染液
11、封固液：中性树胶，或50%缓冲甘油，或液体石蜡等
12、恒温箱（水浴锅）、冰箱、切片机、载玻片和盖玻片、高压锅或微波炉、染色缸、显微镜、计算机图像分析系统
常用固定液
1、醛类固定剂：作用是使组织之间相互交联，将抗原保存在原位。
（1）3%中性甲醛固定液液：30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml
（2）4%多聚甲醛缓冲液：40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml，加热搅拌（注意不要沸腾）至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS，使总容量为1000ml
（3）戊二醛－多聚甲醛缓冲液：在上述溶液中加入1％的戊二醛
（4）Bouin液：40％甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.
（5）PLP液(过碘酸－赖氨酸－多聚甲醛固定液)
2、丙酮及醇类固定剂：原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀
（1）AAA液：纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml
（2）Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰冻切片的后固定
（3）Carnoy液：纯酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原的固定保存
（4）丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定，用前在4℃冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5～10min
3、其他固定剂
（1）Zenker液：适合免疫球蛋白抗原的检测
（2）四氯化锇液：是电镜研究中所必需的固定液
抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片，原因：
a.福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭；
b. 甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好是进行反应。
①抗原热修复
（1）高压热修复：
在沸水中加入0.5 mol/L EDTA缓冲液（pH 8.0）或0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。
本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复：
电炉或者水浴锅加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
（3）微波热修复：
在微波炉里加热0.01 M枸橼酸钠缓冲溶液（pH 6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。
适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
②酶消化法：
常用0.1%胰蛋白酶、0.4%胃蛋白酶液、皂素（Saponin）。
胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5-30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。
适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。