免疫组织化学染色

免疫组织化学染色（IHC）

定义：

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

免疫组化原理

抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

免疫组化检测标本

1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；

2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。

免疫组化操作步骤

①石蜡切片制作

1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。

2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，

70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h

3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。

4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45 min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5 h或侵蜡过夜，用石蜡（Ⅲ）包埋组织。

5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7 μm厚度的组织切片。

6、贴片：将组织石蜡切片放在在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上

7、烤片：68℃恒温箱内烤片2-4 h

②免疫组织化学染色（SP三步法）

1、脱蜡

取出烘烤后保存的石蜡切片，室温放置30 min，然后分别在二甲苯I、II、III中浸泡各10 min。

2、复水

无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各5 min→95%乙醇溶液5 min→80%乙醇溶液5 min→70%乙醇溶液5 min→50%乙醇溶液5 min→ddH2O 5 min。

3、PBS冲洗2-3次，每次5min

4、灭活

3% H2O2溶液孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性

5、PBS冲洗2-3次，每次5min

6、抗原修复

将切片置于0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温

7、PBS冲洗2-3次，每次5min

8、封闭

滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体；

9、滴加Ⅰ抗50 μl，室温静置1 h，或者37℃ 1 h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）；

10、PBS冲洗2-3次，每次5min；

11、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50 μl，室温静置1 h，或371

℃ h；

12、PBS冲洗2-3次，每次5 min；

13、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30 min-1h；

14、PBS冲洗2-3次，每次5 min；

15、显色：DAB显色5-10 min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）

（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）

（A：DAB B：H2O2C：磷酸缓冲液）

16、自来水冲洗10分钟终止反应

17、复染：苏木精复染2 min，盐酸酒精分化

18、自来水冲洗10-15min

19、常规脱水、透明、封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检

③结果分析

每张切片选择5个高倍镜视野（400X），应用图像分析系统进行定量灰度扫描后进行分析。

免疫组化常用试剂及设备：

1、PBS：0.01 M磷酸盐缓冲液 (pH 7.4)

2、固定液：4% 多聚甲醛溶液 (pH 7.4)

3、梯度酒精：100%、95%、80%、70%、50%

4、二甲苯

5、包埋剂：石蜡

6、防脱剂：多聚赖氨酸（PLL5g+蒸馏水1000ml）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）

7、抗原修复液：0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0），或0.01M柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）

8、SP超敏免疫组化试剂盒（包括试剂A、B、C、D）

试剂A --阻断剂：3%甲醇-H2O2溶液（30% H2O2和80%甲醇溶液配制）

试剂B --封闭液：正常非免疫动物血清

试剂C --二抗（辣根过氧化物酶标记）

试剂D --SP（链霉亲和素-过氧化物酶）