新药研发中药物分析方法建立与验证(方案).ppt
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——进一步验证方法的可行性
2020/6/17
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第三节 分析方法 验证的内容与要求
验证步骤： 首先为分析方法的验证 ——特异性、精密度与准确度、回收率 定量限与检测限、溶液稳定性 其次为生物基质中待测药物稳定性的验证 ——室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环
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验证的效能指标与基本要求
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二、分析测定的目的与要求
药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物
要求 ——同时测定原形药物和代谢产物 检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属
性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离) 方法 ——不必强调方法的简便、快速；
2020/6/17
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一、待测药物的理化性质及体内存在状况
准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物 ——预处理——待测物从结合物或缀合物中释放
选择样品预处理方法——首先应考虑 ——待测药物的理化性质 ——药物在生物体内的存在状况 ——药物在生物体内的生物转化(代谢)途径
2020/6/17
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(一)待测药物的理化性质
新药研发中药物分析 方法建立与验证
袁艳娟 2015.04.17
内容提要
分析方法的设计依据 分析方法建立的一般步骤 分析方法验证的内容与要求 药物分析应用示例
2020/6/17
2
第一节 分析方法的设计依据
建立分析检测方法的主要依据 ➢ 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 ➢ 分析测定的目的与要求 ➢ 生物样品的类型与预处理方法 ➢ 实验室条件
——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS 毒代动力学——确定新化合药物预期人用剂量水平与其毒性水平之间的安全范围
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三、生物样品的类型与预处理方法
生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用
以血浆或血清为分析样品 蛋白沉淀 溶剂萃取 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC或HPLC-MS检测
10
一、分析方法的选择
体内药物分析方法的设计
生物样品中的药物浓度——决定分析方法的首要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少
——难以通过增加取样量提高方法灵敏度 ——通过选择适当的分析方法适应样品分析需求
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二、分析方法的建立
➢ 分析方法建立之前 查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所
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2. 空白生物基质试验
空白生物基质 (blank biological matrix) ——如空白血浆
考察目标 ——生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）
——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗” （信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号
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—— 使各物质具有足够Baidu Nhomakorabea方法灵敏度(LOQ)
良好的色谱参数(n、R、T)
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适当的保留时间(tR)
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(二)分离条件的筛选
在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢 产物对分离与检测的干扰，步骤如下：
1．空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验 —— endogenous compounds(方法特异性) 3．模拟生物样品试验 —— 方法效能指标 4．实际生物样品测试 —— 代谢产物(方法特异性)
药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法 具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍
生化后萃取等 具有挥发性——GC测定法 具有光谱或电化学特性——分析检测方法 药物的稳定性——萃取浓缩技术 对酸碱不稳定——避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定——避免高温蒸发溶剂
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(二)待测药物的体内存在状态
与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低 ——分离萃取方法 蛋白结合较强——不宜直接采用溶剂萃取
体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物 ——分析检测技术 浓度较低（尤其有代谢产物共存） ——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 ——采用LC-MS等分析检测技术
空白生物基质和模拟生物样品试验——确定的分析方法及其条件 ——不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定 ——药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物) 或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)
实际生物样品——确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试 考察目标 ——代谢产物对药物、内标物质的干扰情况
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(一)检测条件的筛选
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定
—— 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度
HPLC —— 调整检测器(类型、条件)
色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)
流动相(组分及其配比)及其流速
柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等
拟定的分析方法 ——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
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二、分析方法的建立
➢ 初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件 同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的
分析方法的建立步骤 ➢ 第一步：检测条件的筛选 ➢ 第二步：分离条件的筛选
16
3. 模拟生物样品试验
模拟生物样品(质量控制,QC样品)——空白生物基质中加入待测药物
考察目标 ——方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度 药物的萃取回收率等各项技术指标 ——同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的
其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性
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4. 实际生物样品的测试
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四、实验室条件
在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑 到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪 器装备，合理选择可行的分析方法。
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第二节 分析方法 建立的一般步骤
一、分析方法的选择 二、分析方法的建立
(一) 检测条件的筛选 (二) 分离条件的筛选
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第三节 分析方法 验证的内容与要求
验证步骤： 首先为分析方法的验证 ——特异性、精密度与准确度、回收率 定量限与检测限、溶液稳定性 其次为生物基质中待测药物稳定性的验证 ——室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环
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验证的效能指标与基本要求
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二、分析测定的目的与要求
药代动力学——研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程 ——血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物
要求 ——同时测定原形药物和代谢产物 检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属
性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离) 方法 ——不必强调方法的简便、快速；
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一、待测药物的理化性质及体内存在状况
准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物 ——预处理——待测物从结合物或缀合物中释放
选择样品预处理方法——首先应考虑 ——待测药物的理化性质 ——药物在生物体内的存在状况 ——药物在生物体内的生物转化(代谢)途径
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(一)待测药物的理化性质
新药研发中药物分析 方法建立与验证
袁艳娟 2015.04.17
内容提要
分析方法的设计依据 分析方法建立的一般步骤 分析方法验证的内容与要求 药物分析应用示例
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第一节 分析方法的设计依据
建立分析检测方法的主要依据 ➢ 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 ➢ 分析测定的目的与要求 ➢ 生物样品的类型与预处理方法 ➢ 实验室条件
——大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS 毒代动力学——确定新化合药物预期人用剂量水平与其毒性水平之间的安全范围
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三、生物样品的类型与预处理方法
生物样品的类型与预处理方法——决定分析方法的应用
以血浆或血清为分析样品 蛋白沉淀 溶剂萃取 ——分析样品较为“干净”，可用HPLC或HPLC-MS检测
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一、分析方法的选择
体内药物分析方法的设计
生物样品中的药物浓度——决定分析方法的首要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少
——难以通过增加取样量提高方法灵敏度 ——通过选择适当的分析方法适应样品分析需求
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二、分析方法的建立
➢ 分析方法建立之前 查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所
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2. 空白生物基质试验
空白生物基质 (blank biological matrix) ——如空白血浆
考察目标 ——生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性）
——在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗” （信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号
2020/6/17
—— 使各物质具有足够Baidu Nhomakorabea方法灵敏度(LOQ)
良好的色谱参数(n、R、T)
2020/6/17
适当的保留时间(tR)
14
(二)分离条件的筛选
在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢 产物对分离与检测的干扰，步骤如下：
1．空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验 —— endogenous compounds(方法特异性) 3．模拟生物样品试验 —— 方法效能指标 4．实际生物样品测试 —— 代谢产物(方法特异性)
药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法 具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍
生化后萃取等 具有挥发性——GC测定法 具有光谱或电化学特性——分析检测方法 药物的稳定性——萃取浓缩技术 对酸碱不稳定——避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定——避免高温蒸发溶剂
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(二)待测药物的体内存在状态
与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低 ——分离萃取方法 蛋白结合较强——不宜直接采用溶剂萃取
体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物 ——分析检测技术 浓度较低（尤其有代谢产物共存） ——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 ——采用LC-MS等分析检测技术
空白生物基质和模拟生物样品试验——确定的分析方法及其条件 ——不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定 ——药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物) 或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)
实际生物样品——确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试 考察目标 ——代谢产物对药物、内标物质的干扰情况
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(一)检测条件的筛选
标准物质 —— 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定
—— 确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度
HPLC —— 调整检测器(类型、条件)
色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)
流动相(组分及其配比)及其流速
柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等
拟定的分析方法 ——避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定
2020/6/17
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二、分析方法的建立
➢ 初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作——选择最佳分析条件 同时验证分析方法的可行性——确认是否适用于实际生物样品
分析方法的建立和验证过程——是不可截然划分的
分析方法的建立步骤 ➢ 第一步：检测条件的筛选 ➢ 第二步：分离条件的筛选
16
3. 模拟生物样品试验
模拟生物样品(质量控制,QC样品)——空白生物基质中加入待测药物
考察目标 ——方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度 药物的萃取回收率等各项技术指标 ——同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的
其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性
2020/6/17
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4. 实际生物样品的测试
2020/6/17
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四、实验室条件
在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑 到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪 器装备，合理选择可行的分析方法。
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第二节 分析方法 建立的一般步骤
一、分析方法的选择 二、分析方法的建立
(一) 检测条件的筛选 (二) 分离条件的筛选
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