天然药化大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定

天然药化 大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定
大黄是常用中药，具有泻下攻积、清热泻火、解毒止血、活血化淤的功效。大黄种类较 多，药典收载的大黄品种是蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄及药用大黄的根及根茎。大 黄药材中主要含有蒽醌类化合物及其苷， 其中蒽醌苷类化合物是其泻下攻积作用的主要 成分，某些游离的蒽醌如大黄酸、大黄素具有明显的抗菌活性。
NaOH 水溶液 加 HCl 酸化，调 PH=2，抽滤，水洗至中性 沉淀（芦荟大黄素等混合物） （1）将含有游离蒽醌的乙醚溶液置于 500ml 分液漏斗中，加 5% NaHCO3 水溶液 40ml，振 摇提取（缓慢振摇，防止乳化现象发生） ，放置分层，放出下层 NaHCO3 溶液，置于另一三
角烧瓶中，再加 5% NaHCO330ml 萃取两次，合并 NaHCO3 萃取液，小心滴加 HCl，使溶液 PH=2，沉淀析出，抽滤，洗涤沉淀至水洗液呈中性，沉淀Ⅰ（大黄酸）备用。 （2）留在分液漏斗中的乙醚溶液，用 5% Na2CO3 溶液 40ml（30ml2 次）萃取 3 次，合并萃 取液，小心滴加 HCl 至 PH=2，待沉淀析出，抽滤，水洗涤沉淀，至洗涤液呈中性，沉淀Ⅱ （大黄素）备用。 （3）留在分液漏斗中的乙醚溶液，用 2% NaOH 溶液 40ml（30ml2 次）萃取 3 次，小心滴 家加 HCl，使溶液 PH=2，放置待沉淀析出，抽滤，水洗至沉淀呈中性，沉淀Ⅲ（芦荟大黄 素等混合物）备用。 3．鉴别 （1）薄层检查： 取三部分萃取物进行薄层展开。 吸附剂：硅胶 G 湿法铺板，105℃活化 30 分钟。 样品：三种沉淀溶于乙醇， 标准品：大黄酸乙醇溶液，大黄素乙醇溶液 展开剂：石油醚（30~60℃）-醋酸乙酯-甲酸(15：5：1)上层 显色：紫外灯下可观察到黄色荧光，5%KOH 喷雾显红色。 （或者展开剂：环己烷-醋酸乙酯（7：3） ，饱和 20 分钟，展距 10cm，晾干后，氨水熏至斑 点清晰）
OH HO O OH
OH
OH OO
O CH2 OO OH OH OH
OH HO O OH OH O OH
CH3 OH OH
芦丁(rutin)
槲皮素（quercetin）
CH2O H O
OH O
OH
OH
H OH
OH
CH3
H OH
OH OH
葡萄糖
鼠李糖Байду номын сангаас
三、实验内容（12 学时） 1．芦丁的提取、精制 槐花米粗粉（60g） 置 1000ml 烧杯中，加水 600ml，加入石灰乳（大约 2-3g） ，搅拌， 调 PH8-9，加热至微沸，保持 30 分钟（维持 PH8-9）趁热先用脱 脂棉过滤，然后抽滤。
实验三 槐米中芦丁的提取分离、鉴定及槲皮素的制备
芦丁又叫芸香苷，广泛存在于植物中。其中以槐花米和荞麦叶中含量最高，使用最多的 是槐花米。 槐花米为豆科植物槐（Sophora japonica L.）的未开放花蕾。味苦性凉、具有清热凉血、 止血的功效。炒炭常用来治疗各种出血症，如肠风便血、痔血、尿血、崩漏下血等。 槐花米的主要成分为芦丁。 芦丁可降低毛细血管脆性和调节渗透性。 临床上用作毛细血 管脆性引起的出血症，并常作为高血压症的辅助治疗药， 一、实验目的与要求 1．掌握酸碱法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2．掌握化学鉴别实验、苷的水解及薄层检查等方法在苷类化合物鉴定中的作用。 3.了解 UV 在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 二、实验原理 芦丁（rutin）C27H30O16：浅黄色针状结晶 mp174~178℃（含三分子结晶水） ；188℃（无 结晶水） 。难溶于冷水，可溶于热水、热甲醇、冷甲醇、热乙醇、冷乙醇，不溶于乙醚、氯 仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液，酸化后析出。全水解得槲皮素和葡萄糖及鼠 李糖。 槲皮素（quercetin）C15H10O7﹒2H2O:黄色结晶,mp313~314℃（2 分子结晶水） 。316℃ （无水物） 。能溶于冷乙醇、易溶于沸乙醇，可溶于甲醇、乙酸乙脂、冰醋酸、吡啶、丙酮 等，不溶于水、苯、乙醚、氯仿、石油醚等。
OH
O
OH
CH3O O
CH3
大黄素-6-甲醚（Physcion） 4．大黄酚（Chrysophanol） 本品六方形或单斜形结晶（乙醇或苯） ，熔点 196℃；具升华性，几乎不溶于水，略溶 于冷乙醇，易溶于沸乙醇，溶于苯、氯仿、乙醚及丙酮等。
OH
O
OH
CH3 O
大黄酚（Chrysophanol） 5．芦荟大黄素（Aloe emodm） 橙色针状结晶（甲苯） ，熔点 223-224℃。易溶于热乙醚中。在乙醚及苯中呈黄色，氨 水及硫酸中呈绯红色。
滤液（作糖份鉴定用）
沉淀 水洗，粗品用 95%乙醇大 约 20ml 回流溶解，趁热 过滤，放置，加水至浓度为 50%左右，放置。 黄色细针状结晶（槲皮素） 抽滤，60~70℃下干燥
3．芦丁的定性反应 取芦丁 3-4mg，加入甲醇 5-6ml 使溶解，分成 3 份做下述实验。 （1）盐酸-镁粉反应 取上述溶液 1~2ml，加少量镁粉，再加 2 滴浓盐酸，振摇，观察颜色变化（逐渐出现红 至紫红色） 。 （2）锆盐-枸橼酸反应 取上述溶液 1~2ml，然后滴加 2%的 ZrOCl2 的甲醇溶液，观察颜色变化（生成黄色的络 合物） 。然后向试管中加入 2%的枸橼酸甲醇溶液，观察颜色变化（黄色溶液显著褪色） 。 （3）Molish 反应 取上述溶液 1~2ml，置于试管中，加 10%等体积的α-萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴
残渣
滤液 在 60~70℃下浓盐酸调至 PH4~5，静置 1 小时， 抽滤，洗涤沉淀至中性。
滤液
沉淀（粗制芦丁） 将沉淀悬浮于 300ml 蒸馏水中，加热煮 沸 15 分钟趁热抽滤。
残渣
滤液 充分静置过滤，60~70℃下干燥。 芦丁（精制品）
2．芦丁的酸水解 称取精制品芦丁约 2g 研细，加 1%H2SO4150ml，投入 500ml 锥形瓶中，放沸石，直火沸 腾后，保持 2 小时，放冷后抽滤。
OH
O
OH
CH2OH O
芦荟大黄素（Aloe emodm）
三、实验内容（8 学时） 1．大黄中总蒽醌类成分的提取、分离 大黄粗粉（50g） 置于 500ml 的圆底烧瓶中，加 95%乙醇至约高于液面为度， 水浴加热回流 2 次，第一次 40 分钟，第二次 30 分钟，保持 乙醇微沸，取下圆底烧瓶，趁热抽滤，合并提取液。
一、实验目的与要求 1．了解蒽醌及蒽醌衍生物的理化性质及提取方法 2．掌握热回流提取中草药的方法及注意事项 3．掌握蒽醌类化合物应用 PH 梯度萃取的方法进行分离的原理及操作 4．熟悉蒽醌类成分的性质及鉴定方法（羟基位置及呈色之间的关系） 二、实验原理 利用乙醇作为提取溶剂， 可以把不同性质的游离蒽醌及其苷提取出来。 蒽醌苷元乙醚中 溶解度较大，用乙醚进行萃取，得到总蒽醌苷元。根据蒽醌衍生物的酸性强弱，用不同 的碱液进行梯度萃取分离，最后得到不同的蒽醌苷元。 1．大黄酸（Rhein） 本品为黄色针状结晶（升华法） ，熔点 321-322℃，330℃分解。几乎不溶于水，溶于碱 和吡啶，溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚。
乙醚液 （2） 5% Na2CO3 水溶液萃取 3 次
NaHCO3 水溶液 加 HCl 酸化，调 PH=2,抽滤，水洗至 中性 沉淀（橙红色结晶） （大黄酸）Na2CO3 水溶液
乙醚液 加 HCl 酸化，调 PH=2 抽滤，水洗至中性 沉淀 （主要含有大黄素）
（3）加 2% NaOH 水溶液，萃取 3 次
加少量浓硫酸，观察现象（两液界面处产生紫红色的环） 。 4．芦丁和槲皮素的薄层色谱鉴别 样品：5%的槲皮素的乙醇溶液 5%的芦丁的乙醇溶液 对照品：5%的槲皮素标准品的乙醇溶液 5%的芦丁标准品的乙醇溶液 薄层板：硅胶 G 以 0.4%CMC-Na 为黏合剂制板，105℃活化 1 小时。 展开剂：CHCL3-MeOH-HCOOH（15：5：1） 显色剂： 喷 1%AlCl3 的乙醇溶液， 显黄色斑点 （紫外灯下观察显更加明显的黄色荧光） 。 5．糖的纸层析鉴别 层析滤纸：中速（5×20cm） 样品： 取水解芦丁之后的滤液 10ml， 水浴加热， 且在搅拌下加适量碳酸钡细粉至中性， 过滤，取滤液并浓缩至 2ml 左右，放冷后，供纸层析。 对照品：1%葡萄糖标准品水溶液 1%鼠李糖标准品水溶液 展开剂：正丁醇：醋酸：水（4：1：5 上层） 显色剂：喷邻苯二甲酸苯胺溶液后，105℃烘烤 5 分钟，显棕红色斑点。 6.光谱测定 芦丁溶液的配制 精密称取的芦丁纯品 1g，用无水甲醇溶解，并稀释至 10ml，从中吸取 5ml，置 50ml 容量瓶 中，用甲醇稀释至刻度。 A. 甲醇光谱：取样品液置石英杯中，至 200～500nm 内进行扫描，重复一次，观察紫外光 谱。 B. 甲醇钠光谱：取样品液置石英杯中，加入甲醇钠溶液 3 滴后，立即测定，放置 5 分钟后 再测一次。 C. 三氯化铝光谱， 在盛有样品液的石英杯中， 加入三氯化铝 6 滴， 放置 1 分钟后进行测定。 测定后加入 3 滴盐酸溶液（盐酸：水＝1：1）再进行测定。 D. 醋酸钠光谱：取样品溶液约 3ml，加入过量的无水醋酸钠固体，摇匀（杯底剩有约 2mg 的醋酸钠） ，加入醋酸钠后两分钟内测定，5 分钟到 10 分钟后再测定一次。 E. 醋酸钠硼酸光谱：方法一：在测定用的盛有样品液和醋酸钠溶液的石英杯中加入足够量 的硼酸使成饱和溶液进行测定。本法适用于在加入醋酸钠 5 分钟后有分解现象者，方法 二：于 3ml 样品中加入 5 滴硼酸饱和溶液后，快速加入醋酸钠，立即测定。
1
2
3
标
1 号极性大，高度小，为大黄酸；2 号与标准品高度一致，为大黄素；3 号为混合物 （2）呈色反应 a. 碱液反应 分别取三部分萃取物的乙醇溶液少量，置于有穴白瓷板孔穴中加 2%NaOH 溶液数滴，观察 颜色变化。 b.醋酸镁反应 分别取三部分萃取物的乙醇溶液少量， 置于白瓷板孔穴中， 滴加 0.5%醋酸镁乙醇溶液数滴， 观察颜色变化。
滤渣
滤液 滤液移入 500ml 的蒸馏烧瓶中，体积勿超 过瓶容积的 1/2， 常压下回收乙醇至糖浆状 （勿太稠厚） ，得乙醇总提物。加入乙醚 60ml（丙酮 10ml） ，时时振摇，将上层乙 醚液倾入另一三角烧瓶中，残渣加乙醚 40ml（丙酮 2ml） ，合并乙醚提取液。 总游离蒽醌
2．游离蒽醌的分离 乙醚提取物 （1）5%NaHCO3 水溶液萃取 3 次
OH
O
OH
COOH O
大黄酸（Rhein）
2．大黄素（Emodin） 本品为橙黄色结晶（丙酮） ，几乎不溶于水，溶于乙醇及 NaOH，NaCO3，NH4OH 水溶 液中，在乙醚中溶解度为 0.14%（25℃w/w） 。
OH
O
OH
HO O
CH 3
大黄素（Emodin）
3．大黄素-6-甲醚（Physcion） 为金黄色针晶， ，几乎不溶于水熔点 207-209℃。溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯、乙醇、 冰醋酸等。