基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术精品PPT课件
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基因编辑技术PPT课件
GAATTC
AGATCT
CTTAAG
TCTAGA
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT
A
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
CELLECTIS S.A. NASDAQ
2015.11.18 DNA剪切技术治疗1岁女童获成功
基因组编辑技术简介
Genome Editing
2015.11.22 HuangCH @ J208
修改遗传信息的第一步： 按我们的设计来重组DNA
第一节 基 本 概 念
重组DNA技术：
是指在基因水平上，将目 的DNA在体外重组于能自我复制 的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生， 以获得大量的目的DNA片段，或 以此为基础，通过基因的诱导 表达，得到大量相应蛋白质产 物的过程。
植物遗传转化方法和技术
根癌农杆菌介导的植物转基因
图10-1 农杆菌侵染伤口的模式图
基因枪介导法 电转化法 PEG转化法 花粉管通道法
动物遗传转化方法和技术
原核显微注射法 胚胎干细胞介导法 病毒载体法
SUCCESS
THANK YOU
2019/8/9
基因重组/敲除的概念及简史
1980年代初，ES细胞分离和体外培养成功奠 定了基因重组/敲除的技术基础
构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体
技 外显子插有新霉素抗
分子生物学课件：基因敲除
P53 gene P53基因没有被替换
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
CRISPR基因编辑技术ppt课件
2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入 侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转 移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞
23
CRISPR/Cas 9作用机理
24
CRISPR/Cas 9作用机理
PAM（NGG序列） 25
CRISPR/Cas 9系统靶向要求
最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为NGG。在人 类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。
26
CRISPR/Cas 9基因编辑实验流程图
• NI可以识别A
• NN可以识别G或A
通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组
装在一起，就可以构成可以识别目的片
段的Tale蛋白。Fra bibliotek13TALEN原理
TALEN的特异性打靶的原理：
一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域； 然后非特异性核酸内切酶 FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（doublestrand break，DSB）； 再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。 FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。
30
CRISPR/Cas 9系统的优势
操作简单，靶向精确性更高。sgRNA靶向序列和基因组序列 必须完全匹配，Cas9才会对DNA进行剪切。编码sgRNA 的序 列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZENs更简单方便， 用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。 CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修 饰可遗传。 基因修饰率高，CRISPRs基因敲入的效率为51%-79%， TALENs的效率为0%-34%。 基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等 无物种限制,可实现对靶基因多个位点同时敲除。 实验周期短，最快仅需2个月，节省大量时间和成本。(ZFNS 一个靶点成本6000＄)
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 PPT
靶向基因技术
• 经典方法 ：
– 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
• 饱含希望与失望的技术：
– ZFN，被Sigma公司垄断
• 新的里程碑：
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
（一）ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
基因敲除方法专题-郭..55页PPT
生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦
前言
Ø什么是基因？
Ø为什么要研究基因？
Ø如何研究？
位置—分类--结构—功能
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定
真核过表达 转基因
基因敲除
进一步验证
定量表达 表达规律-qPCR
体内蛋白水平 验证
Western blotting
如何获取基因
Ø同源克隆： 已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统 上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除与基因编辑技术
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
《基因敲除技术》PPT课件
16
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
15
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
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2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
15
2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
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2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件
4、转基因大豆、西红柿、玉米等。
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
基因编辑技术和原理讲述 ppt课件
连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN
在基因组编辑中的应用。
PPT课件
9
ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构成 的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂 (DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末 端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位 点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变 或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。
端连接和同源重组修复 两条途径。
PPT课件
4
• 1.非同源末端连接（NHEJ ）是一种低保真度的修
复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随
机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的
基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ
机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的
基因敲入。
录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形
成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点,
在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并
启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的
CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)
PPT课件
6
基因编辑原理
PPT课件
7
基因编辑技术的种类
目前主要有 3 种基因编辑技术， 分别为： 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)
技术； 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
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5
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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Cre/loxP系统作. 用原理示意图
14
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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1
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
转基因、基因克隆与基因敲除技术59页PPT
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
转基因、基因克隆与基因敲除技术
46、法律有权打破平静。——马·格林 47、在一千磅法律里，没有一盎司仁 爱。— —英国
48、法律一多，公正就少。——托·富 勒 49、犯罪总是以惩罚相补偿；只有处 罚才能 使犯罪 得到偿 还。— —达雷 尔
50、弱者比强者更能得到法律的保护 。——
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
转基因、基因克隆与基因敲除技术
46、法律有权打破平静。——马·格林 47、在一千磅法律里，没有一盎司仁 爱。— —英国
48、法律一多，公正就少。——托·富 勒 49、犯罪总是以惩罚相补偿；只有处 罚才能 使犯罪 得到偿 还。— —达雷 尔
50、弱者比强者更能得到法律的保护 。——
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• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
• Cre-LoxP系统的特性
条件性基因敲除法可定义 为将某个基因的修饰限制 于小鼠某些特定类型的细 胞或发育的某一特定阶段 的一种特殊的基因敲除方 法。它实际上是在常规的 基因敲除的基础上，利用 重组酶Cre介导的位点特异 性重组技术，在对小鼠基 因修饰的时空范围上设置 一个可调控的“按钮”， 从而使对小鼠基因组的修 饰的范围和时间处于一种 可控状态。
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
（三）诱导型基因敲除
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统 为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性 或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点， 通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物 的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定 基因的敲除。
• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp 转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因 组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因 动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所 表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动 物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出 现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠 模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技 术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。
• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导 型基因敲除。
• 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个 体中的靶基因活性。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
——基因敲除、基因编辑技术
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
• 传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随 机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于 10-6），增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。
Cre-LoxP重组酶系统
• LoxP（locus ofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是 有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成， 8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化 DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序 列是Cre酶的结合域。其序列如下 ：
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛 应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时 空特异性基因打靶策略的技术核心。
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超 基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp （EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。 Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。它 不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被 删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何 辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环 状甚至超螺旋 DNA。
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空 间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动物 的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲 除的技术。
（一）完全基ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
• Cre-LoxP系统的特性
条件性基因敲除法可定义 为将某个基因的修饰限制 于小鼠某些特定类型的细 胞或发育的某一特定阶段 的一种特殊的基因敲除方 法。它实际上是在常规的 基因敲除的基础上，利用 重组酶Cre介导的位点特异 性重组技术，在对小鼠基 因修饰的时空范围上设置 一个可调控的“按钮”， 从而使对小鼠基因组的修 饰的范围和时间处于一种 可控状态。
条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
（三）诱导型基因敲除
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统 为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性 或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点， 通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物 的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定 基因的敲除。
• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp 转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因 组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因 动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所 表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动 物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出 现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠 模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技 术已经成为研究基因功能最直接、最有效的方法之一。
• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导 型基因敲除。
• 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个 体中的靶基因活性。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
——基因敲除、基因编辑技术
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
• 传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随 机交换，但在体细胞内，基因同源重组的效率特别低（低于 10-6），增加了实际操作的工作量，限制了该项技术的应用。
Cre-LoxP重组酶系统
• LoxP（locus ofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是 有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成， 8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化 DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序 列是Cre酶的结合域。其序列如下 ：
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛 应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时 空特异性基因打靶策略的技术核心。
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超 基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp （EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。 Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。它 不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被 删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何 辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环 状甚至超螺旋 DNA。
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空 间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动物 的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲 除的技术。
（一）完全基ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。