《组织化学染色》PPT课件
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免疫组织化学染色技术
03 免疫组织化学染色技术的 操作流程
样本的收集与处理
01Βιβλιοθήκη 0203样本类型
免疫组织化学染色技术可 应用于各种组织样本，如 石蜡切片、冰冻切片、细 胞涂片和组织块等。
样本处理
在染色前，需要对样本进 行适当的固定、脱水、包 埋和切片等处理，以确保 抗原的完整性和活性。
样本标记
在切片过程中，需对组织 进行标记，以便后续的定 位和观察。
04 免疫组织化学染色技术的 优化与改进
抗体选择与优化
总结词
抗体选择是免疫组织化学染色技术的关键步骤，直接影响到染色结果的特异性和敏感性。
详细描述
在选择抗体时，应考虑抗体的来源和生产过程，以确保其质量和可靠性。同时，应选择针对目标抗原具有高亲和 力的抗体，以提高染色结果的特异性。此外，可通过实验验证抗体的最佳工作浓度，以实现最佳的染色效果。
染色结果的检测与评估
染色结果的检测与评估是免疫组织化学染色技术的最后步 骤，也是最为关键的一步。检测方法包括显微镜观察、图 像分析等。评估染色结果时，需要综合考虑染色强度、阳 性细胞的数量和分布等因素，以得出准确的结论。
染色结果的检测与评估对于病理诊断、肿瘤研究等领域具 有重要意义。通过免疫组织化学染色技术，可以检测组织 中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病的诊断和治疗提供 有力支持。
抗原修复与阻断
抗原修复
通过加热或化学方法使抗原从组织中 暴露出来，以便抗体能够与其结合。
阻断
为了防止非特异性染色，需要用阻断 剂对组织进行阻断，以消除内源性过 氧化物酶和生物素等物质的干扰。
抗体孵育与洗涤
抗体选择
根据研究目的选择特异性抗体，确保其能够与目 标抗原特异性结合。
抗体孵育
《组织化学染色》课件
科学研究
通过染色技术，研究人员可 以观察和研究细胞的结构和 功能。
药物开发
染色技术也可以用于药物开 发过程中的药效评估和分析。
组织化学染色的原理
组织化学染色的原理是利用化学反应将染料分子与组织或细胞结构中的特定 成分结合，从而产生颜色反应。
组织化学染色的步骤
1
标本制备
将组织标本收集、固定和包埋，以便进行 Nhomakorabea一步的染色过程。
2
染料选择
根据需要染色的组织或细胞成分特点选择合适的染料。
3
固定和染色
将标本与染料处理，使染料与目标结合，并增强染色效果。
优点和限制
优点
组织化学染色可以提供直观的视觉信息，用 于研究和诊断。
限制
染色结果可能受到多种因素影响，例如标本 质量和染色剂的稳定性。
常见问题和解决方法
1 染色结果不明显
可能因为染料浓度不足，可以尝试增加染料浓度。
常用的染色方法
1 酸性染料
酸性染料常用于染色细胞核和某些细胞器，例如血液涂片中的噬菌体。
2 碱性染料
碱性染料主要用于染色胞浆和细胞骨架，如组织切片中的嗜酸性细胞。
3 特殊染料
特殊染料用于特定类型的细胞或组织元素，例如肿瘤标志物的染色。
染色技术的应用
医学诊断
组织化学染色在病理学中广 泛应用于疾病的诊断和鉴定。
《组织化学染色》PPT课 件
欢迎来到《组织化学染色》的课程！在本课程中，我们将深入探讨组织化学 染色的基本原理、常用方法以及应用领域。准备好扩展您的知识，并让我们 一起开始这个令人兴奋的旅程吧！
染色的定义和作用
染色是一种在组织学和生物学研究中常用的技术，通过使用染料将细胞和组织的特定结构染色，以显示 其形态、组织类型和功能特点。
免疫组织化学染色SP技术课件
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
武汉大学病理教研室
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
（迈新）；或60℃过夜
实验名称
链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法
(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称S-P法)
检测胃癌组织CK／Vimentin的蛋白表达
武汉大学病理教研室
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S-P法原理示意图
链酶亲和素 生物素化二抗
过氧化物酶 生物素
待测抗原
特异性一抗
武汉大学病理教研室
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免疫组织化学基本实验流程
组织、细胞标本
抗原修复
滴加二抗
滴加特异性一抗
阻断内源性过 氧化物酶
正常血清封闭
滴加三抗
显色
复染
封片 武汉大学病理教研室
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具体步骤如下： 1．石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 2．所有组织均采用微波修复抗原； 3．室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 4．滴加50μl过氧化物酶阻断液（试剂A），37℃湿盒 孵育 10min； 5．0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×5min； 6．滴加非免疫性动物血清（试剂B），37℃湿盒孵育 10min；
实验流程中的注意事项
内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间 检测及显色系统 复染
武汉大学病理教研室
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
染色前处理 －取材、脱水、浸蜡
组织及时固定
固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛
常规下固定8-24小时 取材厚度：2mm
（迈新）；或60℃过夜
免疫组织化学染色技术PPT课件
• 抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
6
2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
10
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
17
尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系 统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物 质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性 结合反应的物质。抗原具有两种性能：
（1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子 具有诱导机体产生免疫应答的特性。
（ 2 ） 反 应 原 性 （ reactogenicity ） 指 抗 原 分 子 与 抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反 应的特性。
6
2. 抗原的分类
免疫学分类
完全抗原、半抗原 胸腺依赖抗原与非依赖抗原
临床分类
外源性抗原：微生物、花粉等 内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿
瘤相关抗原等 同种异型抗原：人类白细胞抗原、
血型抗原 异嗜性抗原：人与其他动物、植物
等之间存在的共同抗原7
• 抗体（antibody）
1. 定义：机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答， B淋巴细胞活化、增殖，分化为浆细胞，由浆细胞 合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白， 称为抗体。
间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和 性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。
间接法中所用的一抗是针对组织或细胞中某种抗原的特
异性抗体，多数抗体是由家兔制备的多克隆抗体或由小鼠
制备的单克隆抗体。
10
第二抗体是第一抗体的抗体，所以只要不同的 第一抗体均来自同一种属动物，与标记的第二抗 体结合就能用来显示不同特异性抗原的存在。这 样可避免直接法中标记每一种第一抗体的麻烦。 通过某种技术增加第二抗体上标记酶的含量， 可提高免疫组织化学染色的敏感度。
17
尸检组织 由于取材时一般均已超过死亡后2小时以上，组织有不同
免疫组织化学染色技术
❖将蛋白转移到膜上进行定性及半定量检测 （蛋白印记）---免疫印记技术（Westernblot）
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强
原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
癌可能的起源
❖较常见的临床情况：
▪ 淋巴结或其它部位不明起源的转移癌 ▪ 卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移 ▪ 膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌 ▪ 有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转
移还是新的肺原发性肿瘤？
卵巢腺癌：原发还是肠起源
CK7 CK20 CDX-2
卵巢起源
肠起源
+
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
免疫胶体金技术
1.标记物：特殊的 金属颗粒-胶体金
2.特性：特别适用 于电镜的单标记 或多标记。也适 用于光镜研究。
电子显微镜胶体金包埋后染色
四、免疫组化技术特点：（熟悉）
3.形态、代谢和功能三结合 4.定性、定位和定量三位一体 5特异性强
原始位置的反应：细胞层面—膜、核、浆 细胞器层面
根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术—光镜、电镜均显色
癌可能的起源
❖较常见的临床情况：
▪ 淋巴结或其它部位不明起源的转移癌 ▪ 卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移 ▪ 膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌 ▪ 有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转
移还是新的肺原发性肿瘤？
卵巢腺癌：原发还是肠起源
CK7 CK20 CDX-2
卵巢起源
肠起源
+
两大特性：免疫原性、免疫反应性。
外源性抗原：微生物、花粉等
抗
内源性抗原：隐蔽的自身抗原、
原 处
肿瘤相关抗原等
处
同种异型抗原：人类白细胞抗原
免疫组化及特殊染色ppt课件
免疫组化及特殊染色
6
与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。
免疫组化及特殊染色
20
IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
免疫组化及特殊染色
5
抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
免疫组化及特殊染色
3
2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
免疫组织化学染色技术
第十六页，共93页。
（二）各染色(rǎnsè)步骤的具体操作及注意事项
1. 组织材料的采取
活检(huójiǎn)组织
组织标本 手术切除标本
尸检标本
实验组织或培养细胞
活检(huó jiǎn)组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内 窥镜钳取的组织
体积小，因活检(huó jiǎn)钳直接钳取，常受压过度而
1. 免疫酶细胞化学(huàxué)技术 2. 免疫荧光细胞化学(huàxué)技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学(huàxué)技术
第五页，共93页。
一、免疫组织化学染色方法的原理
抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机 体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫 应答产生的效应物质（抗体和效应细胞） 在体内或体外发生特异性结合(jiéhé)反 应的物质。抗原具有两种性能：
PB (pH 7.2-7.4)，搅拌、加热至60 ºC，同时滴入1N NaOH 至溶液 完全透明。冷却后用1N HCl 调PH 值至7.2-7.4，再用0.1mol/L PB将 溶液加至1000ml。 ¶ 固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。 ¶ 固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生(chǎnshēng)固定 作用。
第二十三页，共93页。
4. 石蜡切片的制作 （1）载玻片涂片的制作
防脱片剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚赖氨酸 （Poly-L-lysine）、甲醛(jiǎ quán)-甘油明胶。
（1）免疫原性（immunogenicity） 指 抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的 特性。
（2）反应原性（reactogenicity）指抗 原分子与抗体或效应 T 细胞等免疫应答
（二）各染色(rǎnsè)步骤的具体操作及注意事项
1. 组织材料的采取
活检(huójiǎn)组织
组织标本 手术切除标本
尸检标本
实验组织或培养细胞
活检(huó jiǎn)组织：宫颈、鼻咽、口腔、喉、皮肤和内 窥镜钳取的组织
体积小，因活检(huó jiǎn)钳直接钳取，常受压过度而
1. 免疫酶细胞化学(huàxué)技术 2. 免疫荧光细胞化学(huàxué)技术 3. 免疫铁蛋白技术 4. 免疫金-银细胞化学(huàxué)技术
第五页，共93页。
一、免疫组织化学染色方法的原理
抗原（antigen）
1. 定义：是一类在适合条件下能激发机 体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫 应答产生的效应物质（抗体和效应细胞） 在体内或体外发生特异性结合(jiéhé)反 应的物质。抗原具有两种性能：
PB (pH 7.2-7.4)，搅拌、加热至60 ºC，同时滴入1N NaOH 至溶液 完全透明。冷却后用1N HCl 调PH 值至7.2-7.4，再用0.1mol/L PB将 溶液加至1000ml。 ¶ 固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。 ¶ 固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生(chǎnshēng)固定 作用。
第二十三页，共93页。
4. 石蜡切片的制作 （1）载玻片涂片的制作
防脱片剂：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚赖氨酸 （Poly-L-lysine）、甲醛(jiǎ quán)-甘油明胶。
（1）免疫原性（immunogenicity） 指 抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的 特性。
（2）反应原性（reactogenicity）指抗 原分子与抗体或效应 T 细胞等免疫应答
(上课用) 特殊染色和组织化学PPT课件
(二)特殊染色
1．定义 专门用于显示某些特定目的物的染色 方法称为“特殊染色”，它又可以理解为 “选择性染色”。
特殊染色对目的物的选择性是相对的。有 些方法具有相对的特异性，如油红O等脂质 染色，显阳性者可以肯定为脂质；有些则显 示的是一类物质，如PAS呈阳性反应者有糖 原、粘蛋白、网织纤维、软骨、阿米巴原虫、 霉菌等许多物质和组织结构，并不能确定是 哪一种具体成分。
2．Lillie固定液(AFF) 无水乙醇85ml，冰醋酸5ml，甲醛 (38%一40%)10ml。此液为优良的固定液。配制及使用方 法与Gendre固定液相同。固定后组织可直接用95％乙醇开 始脱水。
3．Rossman固定液 苦味酸无水乙醇饱和液90ml，甲醛 (38％一40％)10ml。临用前配制，取小块新鲜组织于4℃ 冰箱内固定1—2d，更换2—3次新液，然后在室温下用95 ％乙醇浸洗数次，经无水乙醇脱水。
3．生成的反应产物必须在原位沉淀，着色深， 且不溶，为细小沉淀或小结晶。能保证定位的 精确性及稳定性，便于反复观察。
1.虽然形成了许多显示细胞化学的方法及一 些特殊染色。但发展的速度比较缓馒。这是因 为每一种方法都有自己不相同的试剂、底物和 方法，在发展上既没有系统的经验可以遵循， 在学习使用上也比较困难。
二、染色目的
未加染色的任何组织切片在镜下只能辨 认细胞和胞核的轮廓，看不清楚其他任何 结构。染色的目的就是将组织切片浸入染 色剂内，经过一定的时间，将组织或细胞 及其他异常成分染上不同深浅的颜色，便 于在光学显微镜下进行观察。
三、染色原理
染色过程是染色剂和组织细胞相结合的过程。其 机理尚未完全清楚。
(三)糖原染色应用
1．细胞内泡状变性的鉴别 在常规石蜡切 片的HE染色中，如胞浆内出现大小不等的 空泡，应考虑可能是脂肪变性，经脂溶剂 的脱水透明过程溶解而形成的空泡；也可 能是糖原在经水溶液固定过程中的脱失所 致；或可能是单纯的水样变性。为了鉴别 其性质，则需要用显示糖原或脂质染色法 加以证明。
《细胞化学染色》PPT课件 (2)
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2
• 细胞化学染色一般包括固定、显示、复染等步 骤。
• 主要用于：
• 显示细胞或组织的酶、蛋白质、糖类、脂类、 无机盐（如铁）等化学成分的含量及分布状况；
• 研究细胞组织来源及分化程度；为疾病的诊断、 鉴别诊断及治疗提供重要的依据。
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3
中性粒细胞碱性磷酸酶染色 （NAP）
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13
• ㈢.临床意义：
• ⒈类白血病反应与慢性粒细胞白血病的鉴别诊断：前 者显著增高，阳性率常达90%以上，积分常高于200分； 后者显著减低，积分可感染 时多为正常或稍低。
• ⒊淋巴细胞白血病时常增高；单核细胞白血病时正常 或增高；慢性中性粒细胞白血病时增高，其它各型粒 细胞白血病时减低；白血病伴感染时增高。
Ⅰ级 + 胞浆呈浅灰色，细小蓝 黑色颗粒占胞浆面积的25%～ 50%。
Ⅱ级 ++ 胞浆呈棕色片状沉淀， 小到中等颗粒约占胞浆面积 的50%～75%。
完整版课件ppt
9
Ⅱ级 ++ 胞浆呈棕色片状沉淀，小 到中等颗粒约占胞浆面积的50% －75%。
• Ⅲ级 +++ 胞浆充满棕黑色沉淀， 分布均匀，中到大颗粒占胞浆面 积的75%－100%。
• 2. 也可用新鲜配制的六偶氮副品红为重氮盐，配方为： 10ml a-磷酸萘酚钠溶液中加六偶氮副品红50μl，其 NAP阳性反应呈红色颗粒状。六偶氮副品红：4%副品 红（2N盐酸）溶液与4%亚硝酸钠溶液1∶1混合，静置 1min。
• 3. 重氮盐应适量，过量会导致染色失败，出现假阴性； 量不足，则阳性反应较弱。
• ㈠.原理： • 方法一（偶氮偶联法）：在PH9.2~9.8的碱性溶
组织化学染色
方法步骤：
结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈黄色或 黄褐色，细胞核呈灰褐色或灰黑色。
3、Foot染色法 原理同Gomori染色法，用Foot碳酸银溶液着
色。
较复杂，所需时间长，易脱片，但染色结果较 稳定。
方法步骤：
结果：网状纤维呈黑色或黑褐色，其他组织 呈复染颜色。
网状纤维染色的应用
染色剂 （溶解或吸收） 组织、细胞
例如脂肪染色:
苏丹类染色剂在脂质中的溶解度＞酒精 中的溶解度
溶解于酒精的苏丹类染色剂与组织中 的脂质接触时，染色剂就从溶液中“转 移”到脂质中，从而使脂质着色。
2 、化学机制（Chemical mechanism):
染色剂和组织细胞的化学结合
（1）
染料 ﹤ 阳性离子 ﹥ 组织 阴性离子
网状纤维染色方法
1 、氢氧化银氨染色法Ⅰ（改良GordonSweets）
原理：胺银液被组织吸附，与组织的蛋白质结合，经甲
醛作用后还原成黑色或棕黑色的金属。
结果：网状纤维呈黑色，细胞核呈红色，胶原纤 维呈黄色至棕黄色，胞质呈淡黄色。
2、氢氧化银氨染色法Ⅱ（改良Gomori） 原理：
此法简单可靠，染色时间短，常用于活检病理 组织检查。
苏木素是一种天然染料，是由中、南美洲等地产 的一种称为“洋苏木树”的树芯木抽提出来。
苏木素本身无染色能力，只有经过氧化，使其分 子结构失去两个氢原子，将一个苯环转化成具有 醌型结构的苯环而成为苏木红（hematein）。
苏木素的化学结 构已为大家熟悉， 但其染色机制还 不很明确。
1、苏木素经过氧化转 化成苏木红染料
ห้องสมุดไป่ตู้还原剂
银盐溶液附着于嗜银颗粒
金属银
例如：类癌的嗜银反应。
《组织化学染色》PPT课件
结果： 酸性粘蛋白（硫粘蛋白和唾液酸蛋白）： 蓝色 蛋白多糖和透明质酸： 蓝色 细胞核：红色
编辑ppt
39
糖类物质染色——2、AB染色
应用
• 用于一般黏液性病变的观察。 • 在肿瘤诊断与研究中：
①用于肿瘤类型的鉴别，如黏液腺癌与未分化癌的鉴别， 黏液表皮样癌与鳞癌的鉴别； ②黏液染色还可以证明癌细胞是否浸润间质； ③观察胃黏膜腺体的肠上皮化生等
编辑ppt
43
脂类物质染色
染色方法和结果： 苏丹Ⅲ染色法：脂肪染橙红色，细胞核淡蓝色（切片染 色后不能长期保存)。 Lillie油红－O染色法：脂类物质呈鲜红色或橘红色，细 胞核呈淡蓝色。 以上两种染色的原理：是染料在脂质中的溶解度大于所 用溶液的溶解度，染料被移入脂质中。均需要冰冻切片， 甘油或甘油明胶封固。 锇酸染色：锇酸与脂肪形成不溶于有机质的氢氧化锇； 黑色脂肪呈黑色，类脂质颗粒呈褐色。应用组织块浸染。
• 黏蛋白：是由糖和蛋白质结合而构成，故又称糖蛋白， 见于各种组织上皮和腺体导管的分泌物中。
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42
糖类物质染色——2、AB-PAS染色
AB与PAS共同染色，亦称套染，对于显示和区别酸性 黏液物质与中性黏液物质均有较好效果。
结果： 酸性黏液物质呈蓝色，中性黏液物质呈红色，混合性黏液 物质呈紫红色；细胞核呈浅蓝色。
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44
脂类物质染色
应用： 证实和区别脂肪变性。 显示病变的脂质沉着，如动脉粥样硬化斑块内 胆固醇沉积；显示脂肪栓塞；显示先天性类脂质 沉积病，如戈谢病（Gaucher disease），尼 曼－皮克病（Niemann-Pick disease ）等。 脂肪源性肿瘤的诊断和鉴别
特殊染色在临床病理学中的应用
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39
糖类物质染色——2、AB染色
应用
• 用于一般黏液性病变的观察。 • 在肿瘤诊断与研究中：
①用于肿瘤类型的鉴别，如黏液腺癌与未分化癌的鉴别， 黏液表皮样癌与鳞癌的鉴别； ②黏液染色还可以证明癌细胞是否浸润间质； ③观察胃黏膜腺体的肠上皮化生等
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43
脂类物质染色
染色方法和结果： 苏丹Ⅲ染色法：脂肪染橙红色，细胞核淡蓝色（切片染 色后不能长期保存)。 Lillie油红－O染色法：脂类物质呈鲜红色或橘红色，细 胞核呈淡蓝色。 以上两种染色的原理：是染料在脂质中的溶解度大于所 用溶液的溶解度，染料被移入脂质中。均需要冰冻切片， 甘油或甘油明胶封固。 锇酸染色：锇酸与脂肪形成不溶于有机质的氢氧化锇； 黑色脂肪呈黑色，类脂质颗粒呈褐色。应用组织块浸染。
• 黏蛋白：是由糖和蛋白质结合而构成，故又称糖蛋白， 见于各种组织上皮和腺体导管的分泌物中。
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42
糖类物质染色——2、AB-PAS染色
AB与PAS共同染色，亦称套染，对于显示和区别酸性 黏液物质与中性黏液物质均有较好效果。
结果： 酸性黏液物质呈蓝色，中性黏液物质呈红色，混合性黏液 物质呈紫红色；细胞核呈浅蓝色。
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44
脂类物质染色
应用： 证实和区别脂肪变性。 显示病变的脂质沉着，如动脉粥样硬化斑块内 胆固醇沉积；显示脂肪栓塞；显示先天性类脂质 沉积病，如戈谢病（Gaucher disease），尼 曼－皮克病（Niemann-Pick disease ）等。 脂肪源性肿瘤的诊断和鉴别
特殊染色在临床病理学中的应用
组织切片染色技术ppt课件
2．特殊染色
特殊染色就是为了显示特定的组织结构或其他的特殊成分，是常 规染色的必要补充，也是染色技术中不可缺少的部分。它在病理 诊断中起到辅助作用。
3．单一染色
选用一种染料进行的染色，如用铁苏木素染睾丸生精细胞等。
4．复染色
用两种不同性质的染料进行染色的方法，如用苏木素和伊红分别 使细胞核及胞质染成两种颜色。
精选ppt课件2021
38
* 苏木素是碱性染料，蓝紫色，可以使细胞核等着色。被苏木 素着色的结构本身为酸性，具有嗜碱性。
有橘黄G、刚果红、俾士麦棕和许多苏丹类的脂质染色剂。
（4）醌亚胺类：含有两个发色团，一个是印胺基（-N=）、一个 是醌型苯环，如硫堇、美蓝、甲苯胺蓝O、硫酸尼罗蓝、中性红和 碱性藏红花O、焦油紫等。
（5）苯甲烷染料：发色团是醌型苯环，如孔雀缘、浅绿、碱性品 红、酸性品红、结晶紫和甲基缘等。
（6）山叮染料：发色团是醌型苯环，如派罗宁和伊红Y等。
精选ppt课件2021
25
六、染色前后处理
（二）染色后的处理
1．脱水 95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min。 2．透明 二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min透明。 3．封固 通常用中性树胶或加拿大树胶加盖玻片封固。
精选ppt课件2021
26
七、染色的注意事项
1．切片脱蜡应彻底。
2．常规染色、特殊染色等，组织要进行固定处理，做酶 反应的组织固定更应严格。凡用含升汞固定液固定的组织， 切片脱蜡后，应经脱汞处理，同时要慎防切片脱落。
5．多种染色
选用两种以上的染料的染色，如Mosson三色染色法。
精选ppt课件2021
21
六、染色前后处理
（一）染色前处理 1．脱蜡至水
特殊染色就是为了显示特定的组织结构或其他的特殊成分，是常 规染色的必要补充，也是染色技术中不可缺少的部分。它在病理 诊断中起到辅助作用。
3．单一染色
选用一种染料进行的染色，如用铁苏木素染睾丸生精细胞等。
4．复染色
用两种不同性质的染料进行染色的方法，如用苏木素和伊红分别 使细胞核及胞质染成两种颜色。
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38
* 苏木素是碱性染料，蓝紫色，可以使细胞核等着色。被苏木 素着色的结构本身为酸性，具有嗜碱性。
有橘黄G、刚果红、俾士麦棕和许多苏丹类的脂质染色剂。
（4）醌亚胺类：含有两个发色团，一个是印胺基（-N=）、一个 是醌型苯环，如硫堇、美蓝、甲苯胺蓝O、硫酸尼罗蓝、中性红和 碱性藏红花O、焦油紫等。
（5）苯甲烷染料：发色团是醌型苯环，如孔雀缘、浅绿、碱性品 红、酸性品红、结晶紫和甲基缘等。
（6）山叮染料：发色团是醌型苯环，如派罗宁和伊红Y等。
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25
六、染色前后处理
（二）染色后的处理
1．脱水 95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min。 2．透明 二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min透明。 3．封固 通常用中性树胶或加拿大树胶加盖玻片封固。
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26
七、染色的注意事项
1．切片脱蜡应彻底。
2．常规染色、特殊染色等，组织要进行固定处理，做酶 反应的组织固定更应严格。凡用含升汞固定液固定的组织， 切片脱蜡后，应经脱汞处理，同时要慎防切片脱落。
5．多种染色
选用两种以上的染料的染色，如Mosson三色染色法。
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21
六、染色前后处理
（一）染色前处理 1．脱蜡至水
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肌组织染色，神经组织染色 按染色对象种类分类：切片染色法，组织块
染色法，大体标本染色法
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12
染色方法的命名
按发明者姓名命名：如Van. Gieson（VG） 染色
按所有染料分类：如苏丹IV染色，锇酸染色 按所染组织分类：如网状纤维染色 其他分类：
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13
染色中易出现的问题和对策
从而使脂质着色。
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7
染料和染色的原理
三、染料的原理
化学机制： 组织和细胞中含有碱性和酸性物质，分别与染料中的阳
离子和阴离子结合。 如HE染色：细胞核主要由核酸构成，与碱性染料-苏木素
结合，而胞浆主要由碱性物质构成，与酸性染料-伊红结普通染色：又称常规染色，即指HE染色（haematoxylin and eosin HE）
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3
染料和染色的原理
一、染料的特点：
组织病理学染料是生物学染色剂
对所染组织成分具有亲和力
染色剂中同时具备发色团和助色团才具有染色功 能
发色团是使染料显色的化学团（色原），一种染 料由一个或多个发色团，染料颜色取决于发色团 多少和强弱。
助色团指使色原产生电离成为盐类，对被染物产
生亲和力的原子团 编辑ppt
4
染料和染色的原理
二、染料的分类
染料的来源分类：天然和合成染料 化学反应分类：碱性染料、酸性染料、中性染料 用途分类：
细胞核染料：苏木素，核固红，结晶紫等 细胞质染料：伊红，酸性复红，苦味酸等 脂肪染料：油红O，苏丹III，苏丹IV 纤维结缔组织染料：苦味酸，亮绿等
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5
染料和染色的原理
• 必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或严 重的误诊，如在网染时把胶元纤维误以为网状纤维。
• 应做阳性切片作对照，保证染色结果的可靠性。 • 染色所用的器皿都必须清洗。
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15
常用染色方法和应用
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16
结缔组织染色
结缔组织由细胞和细胞间的骨架成分构成， 分为无定形的间质（如硫酸盐和非硫酸盐黏多 糖）和定形或纤维型间质（如胶原纤维，弹力 纤维。网状纤维）。各种纤维成分的识别有助 于病理学的诊断和鉴别诊断。
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18
结缔组织染色——网状纤维染色
网状纤维染色的原理
网状纤维染色方法很多，但基本原理相同，即经过 氧化剂的氧化使网状纤维对银离子具有选择性的亲和 能力（嗜银性），并在媒染剂的作用下网状纤维吸附 二氨合银离子，在经甲醛将其还原为黑色金属银而显 示出网状纤维。
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19
结缔组织染色——网状纤维染色
特殊染色：除HE以外的所有染色，显示特定的组织结构 和成分。
单一染色：用一种染料进行的染色，如甲苯胺蓝染幽门螺 杆菌
多色染色：用两种以上染液染色的方法，如三色染色 对比染色：又称复染或衬染，先将某一成分或结构染色后
，再用另一种染料染其他成分，如苏木素衬染细胞核
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9
染色的常用术语
进行性染色：渐进性染色，采用低浓度的染液，使 组织成分着色自浅入深，直到达到合适强度，
三、染料的原理
物理机制： 毛细管渗透作用：染色剂沿组织间微孔渗透到组织中。 吸收或溶解作用：组织吸收或溶解染料而着色，如脂肪染
色 吸附作用：染料的色素粒子浸润组织中，因分子引力，色
素粒子被吸附而染色
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6
• 例如脂肪染色:
苏丹类染色剂在脂质中的溶解度＞酒精中的溶 解度
溶解于酒精的苏丹类染色剂与组织中的脂质 接触时，染色剂就从溶液中“转移”到脂质中，
特殊染色在临床病理学中的应用
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1
染色的意义和目的
用染料对组织切片进行处理，使组织中的不同 成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以 利于光镜观察和分析。病理染色属于生物性染色 的范畴。
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2
特殊染色（special staining）
应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显 色剂，显示组织或细胞的正常结构或病理过程中出现 的异常物质、病变及病原体等，称特殊染色（Special staining） 。
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17
结缔组织染色——网状纤维染色
网状纤维的特性
网状纤维是构成组织的网状支架 广泛分布于实质器官内，其中最丰富的区域是肝脏、脾脏、
淋巴结、骨髓、基膜、血管等 形态学上为交织成网的纤细纤维 化学成分为网状蛋白，一种特殊的胶原蛋白，抗酸 病理状态下可转化为胶原纤维 具有嗜银性，又称嗜银纤维 HE染色着色淡，特殊染色可显示
淋巴瘤内存在大量网状纤维 脑膜瘤和胶质瘤：脑膜瘤有网状纤维。胶质
选择适当的组织处理方法：包括固定液和切 片的选择，如脂肪和酶类染色需冰冻切片
染色液的有效期和保存方式 染色液的浓度和pH值 染色时间的控制 染色前切片的预处理：如脱甲醛色素，脱汞
盐固定液的汞结晶等
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14
染色中易出现的问题和对策
• 注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才能 达到目的，一般根据HE切片所见，选择适当的特染方法 。
退行性染色：又称后退性染色，先使组织着色过度， 再用某些溶液脱去多余染液，达到合适染色强度
媒染剂：具有促进染色能力，对染料和组织都有亲 和力并与染料和组织结合在一起的试剂。如硫酸铝 钾等
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10
染色的常用术语
促染剂：促使染料着色，增强染色能力，但本身不 参与染色反应，如乙酸
异染性染色：组织经过盐基性染料染色后，出现与 染料不同的颜色
常用网状纤维的染色方法 Gomori染色法
结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈黄色或黄 褐色，细胞核呈灰黑色。
特点：此法简单可靠，染色时间短，常用于活 检病理组织检查。
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20
结缔组织染色——网状纤维染色
网状纤维染色的应用 肿瘤的诊断和鉴别诊断： 癌和肉瘤的鉴别：癌巢周围存在网状纤维；
肉瘤中网状纤维围绕每个细胞 尤文氏瘤和淋巴瘤：尤文氏瘤无网状纤维，
分化：指用某种溶液选择性脱去过深的着色，并使 不应着色的组织细胞成分脱色的过程，HE染色时的 盐酸酒精分化
蓝化作用（返蓝）：苏木素在酸性条件下呈红色， 碱性条件下呈蓝色，HE染色时在酸分化后，再用碱 性水使核变蓝，称蓝化
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染色方法的分类
按照染色方法分类 一般方法分类：常规染色，特殊染色等 按主要组织和细胞成分分类：结缔组织染色，
染色法，大体标本染色法
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染色方法的命名
按发明者姓名命名：如Van. Gieson（VG） 染色
按所有染料分类：如苏丹IV染色，锇酸染色 按所染组织分类：如网状纤维染色 其他分类：
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染色中易出现的问题和对策
从而使脂质着色。
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染料和染色的原理
三、染料的原理
化学机制： 组织和细胞中含有碱性和酸性物质，分别与染料中的阳
离子和阴离子结合。 如HE染色：细胞核主要由核酸构成，与碱性染料-苏木素
结合，而胞浆主要由碱性物质构成，与酸性染料-伊红结普通染色：又称常规染色，即指HE染色（haematoxylin and eosin HE）
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染料和染色的原理
一、染料的特点：
组织病理学染料是生物学染色剂
对所染组织成分具有亲和力
染色剂中同时具备发色团和助色团才具有染色功 能
发色团是使染料显色的化学团（色原），一种染 料由一个或多个发色团，染料颜色取决于发色团 多少和强弱。
助色团指使色原产生电离成为盐类，对被染物产
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染料和染色的原理
二、染料的分类
染料的来源分类：天然和合成染料 化学反应分类：碱性染料、酸性染料、中性染料 用途分类：
细胞核染料：苏木素，核固红，结晶紫等 细胞质染料：伊红，酸性复红，苦味酸等 脂肪染料：油红O，苏丹III，苏丹IV 纤维结缔组织染料：苦味酸，亮绿等
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染料和染色的原理
• 必须掌握各种特殊染色的结果，避免导致错误的结论或严 重的误诊，如在网染时把胶元纤维误以为网状纤维。
• 应做阳性切片作对照，保证染色结果的可靠性。 • 染色所用的器皿都必须清洗。
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常用染色方法和应用
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结缔组织染色
结缔组织由细胞和细胞间的骨架成分构成， 分为无定形的间质（如硫酸盐和非硫酸盐黏多 糖）和定形或纤维型间质（如胶原纤维，弹力 纤维。网状纤维）。各种纤维成分的识别有助 于病理学的诊断和鉴别诊断。
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结缔组织染色——网状纤维染色
网状纤维染色的原理
网状纤维染色方法很多，但基本原理相同，即经过 氧化剂的氧化使网状纤维对银离子具有选择性的亲和 能力（嗜银性），并在媒染剂的作用下网状纤维吸附 二氨合银离子，在经甲醛将其还原为黑色金属银而显 示出网状纤维。
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结缔组织染色——网状纤维染色
特殊染色：除HE以外的所有染色，显示特定的组织结构 和成分。
单一染色：用一种染料进行的染色，如甲苯胺蓝染幽门螺 杆菌
多色染色：用两种以上染液染色的方法，如三色染色 对比染色：又称复染或衬染，先将某一成分或结构染色后
，再用另一种染料染其他成分，如苏木素衬染细胞核
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9
染色的常用术语
进行性染色：渐进性染色，采用低浓度的染液，使 组织成分着色自浅入深，直到达到合适强度，
三、染料的原理
物理机制： 毛细管渗透作用：染色剂沿组织间微孔渗透到组织中。 吸收或溶解作用：组织吸收或溶解染料而着色，如脂肪染
色 吸附作用：染料的色素粒子浸润组织中，因分子引力，色
素粒子被吸附而染色
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6
• 例如脂肪染色:
苏丹类染色剂在脂质中的溶解度＞酒精中的溶 解度
溶解于酒精的苏丹类染色剂与组织中的脂质 接触时，染色剂就从溶液中“转移”到脂质中，
特殊染色在临床病理学中的应用
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1
染色的意义和目的
用染料对组织切片进行处理，使组织中的不同 成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以 利于光镜观察和分析。病理染色属于生物性染色 的范畴。
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特殊染色（special staining）
应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显 色剂，显示组织或细胞的正常结构或病理过程中出现 的异常物质、病变及病原体等，称特殊染色（Special staining） 。
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结缔组织染色——网状纤维染色
网状纤维的特性
网状纤维是构成组织的网状支架 广泛分布于实质器官内，其中最丰富的区域是肝脏、脾脏、
淋巴结、骨髓、基膜、血管等 形态学上为交织成网的纤细纤维 化学成分为网状蛋白，一种特殊的胶原蛋白，抗酸 病理状态下可转化为胶原纤维 具有嗜银性，又称嗜银纤维 HE染色着色淡，特殊染色可显示
淋巴瘤内存在大量网状纤维 脑膜瘤和胶质瘤：脑膜瘤有网状纤维。胶质
选择适当的组织处理方法：包括固定液和切 片的选择，如脂肪和酶类染色需冰冻切片
染色液的有效期和保存方式 染色液的浓度和pH值 染色时间的控制 染色前切片的预处理：如脱甲醛色素，脱汞
盐固定液的汞结晶等
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染色中易出现的问题和对策
• 注意特染的应用范围，如某种病变应用什么方法染色才能 达到目的，一般根据HE切片所见，选择适当的特染方法 。
退行性染色：又称后退性染色，先使组织着色过度， 再用某些溶液脱去多余染液，达到合适染色强度
媒染剂：具有促进染色能力，对染料和组织都有亲 和力并与染料和组织结合在一起的试剂。如硫酸铝 钾等
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10
染色的常用术语
促染剂：促使染料着色，增强染色能力，但本身不 参与染色反应，如乙酸
异染性染色：组织经过盐基性染料染色后，出现与 染料不同的颜色
常用网状纤维的染色方法 Gomori染色法
结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈黄色或黄 褐色，细胞核呈灰黑色。
特点：此法简单可靠，染色时间短，常用于活 检病理组织检查。
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20
结缔组织染色——网状纤维染色
网状纤维染色的应用 肿瘤的诊断和鉴别诊断： 癌和肉瘤的鉴别：癌巢周围存在网状纤维；
肉瘤中网状纤维围绕每个细胞 尤文氏瘤和淋巴瘤：尤文氏瘤无网状纤维，
分化：指用某种溶液选择性脱去过深的着色，并使 不应着色的组织细胞成分脱色的过程，HE染色时的 盐酸酒精分化
蓝化作用（返蓝）：苏木素在酸性条件下呈红色， 碱性条件下呈蓝色，HE染色时在酸分化后，再用碱 性水使核变蓝，称蓝化
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染色方法的分类
按照染色方法分类 一般方法分类：常规染色，特殊染色等 按主要组织和细胞成分分类：结缔组织染色，