分光光度法

续前
百分吸收系数与摩尔吸收系数之间的关系是：
M 1% ε = 10 E1cm
吸收系数是物质的特性常数，表明物质对某一特 定波长光的吸收能力。不同物质对同一波长的单 色光有不同的吸收系数，吸收系数越大，表明吸 光能力越强，灵敏度越高，所以吸收系数是物质 定性和定量分析的依据。
四、吸收光谱

吸收光谱又称吸收曲线，是在浓度一定的条件下， 以波长（λ）或波数（δ）为横坐标，以吸收度 （A）为纵坐标所描绘的曲线。

仪器
可见分光光度计
721型分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源 单色器 样品室 检测器 显示器
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在350～1000 nm。 紫外区：氢、氘灯。 发射200～360 nm的连 续光谱。
三种分光光度计的比较
721型分光光度计的使用
三、应用
（一）定性鉴别 根据物质的吸收光谱特征，如吸收光谱的形状、 最大吸收波长、吸收峰数目、各Байду номын сангаас收峰的位置， 强度和相应的吸收系数等进行分析。
1、比较光谱的一致性

两个化合物相同，在相同的条件下测出的吸收光 谱应完全相同。 具体做法：

（1）样品与标准品在完全相同的情况下，分别测出 吸收光谱，比较二者光谱是否一致 （2）没有标准品，用标准光谱图对归照比较，二者 吸收光谱一致，可初步断定是同一化合物。
（二）朗伯-比尔定律

当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶 液时，在单色光强度、溶液的温度等条件不变的 情况下，溶液对光的吸收度与溶液的浓度及液层 厚度的乘积成正比。 A=－lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气体 和固体的非散射均匀体系。
（三）吸收系数
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。 A E= C L 当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表 示方法也不同，常用的表示方法有两种： 1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度 为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度，用ε表示。 2、百分吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度 为1%（g/ml），液层厚度为1cm时的吸收度， 1% E1cm 表示。
一、基本原理 物质分子受到紫外-可见光的照射，选择吸收某些适宜能 量的光子后，其原子的外层电子（成键电子、未成键 电子）由基态跃迁至激发态，在相应波长的位置出现 吸收所形成的光谱，称为紫外-可见吸收光谱。 适用范围：

分子中含有芳环或共轭双键的有机药物，在紫外光区 有特征吸收 外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收 都可用紫外-可见分光光度法进行分析。
二、分光光度计的类型 1.单光束
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度 或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光 源和检测器具有很高的稳定性。 2.双光束
自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳 定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合 于结构分析。仪器复杂，价格较高。
3.双波长
将不同波长的两束单色光(λ 1、λ 2) 快速交替 通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。 无需参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获 得导数光谱。
2.单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任 波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；
②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅； ④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光
后所得单色光聚焦至
出射狭缝； ⑤出射狭缝。
3. 样品室
25 ×10-3 C= 1000
1% E1cm 供

-3 (g/100ml) = 2.5× 10
=
0.507 2.5× 10-3 × 1
1% E1cm 1% E1cm 供 标
= 202.8
C68H88CoN14O14P% =
202.8 ×100% = 97.97% ×100% = 207
2、标准曲线法




三、光的吸收定律
（一）百分透光率（T）和吸收度（A）
入射光 I0 → 吸收Ia → 透射It
I0 = I a + I t
透光率（描述入射光透过溶液的程度） T = It/ I0 或 T% = It/I0×100% 透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。 吸光度 A = -lgT =lg I0/ It A愈大，溶液对光的吸收愈多。
1% E1cm
含量 % =
供
1% E1cm 标
× 100%
例2

精密称取维生素B12供试品25.0mg，加水溶解并稀 释制成1000ml，于1cm厚的吸收池中，在361nm处 1% 测得吸收度为0.507，按C68H88CoN14O14P的 E1cm 为 207计算，求维生素B12的含量百分比。 解：

15 5 = 3.75 × 10-3 (mg/ml) C标 = 200 × 100 A供 C标 3.75 × 10-3×0.462 -3 (mg/ml) C供 = = 3.69 = × 10 A标 0.470
C供 供% = C原 3.69 × 10-3 × 100% = 100% = 98.30% -3 × 3.75 × 10
续前

是分光光度法中最经 典的方法。
特点：对仪器要求不 高，是分光光度法中 简便易行的方法。
A Ax

0
Cx
C
3、对照品比较法

在相同条件下配制标准对照品和供试品溶液，在选 定的波长处分别测定吸收度A标和A供。 根据： A标=EC标L A供=EC供L 标准对照品与供试品是同一种物质，在同一仪器、 同一波长下测定，因此L和E相等。
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。
4. 检测器
利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行 仪器自动控制和结果处理
一、光的性质与波长范围
光的性质

光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和 粒子性。 光在传播时表现了光的波动性

一定的光波具有一定的波长、频率、光速c等参数 来描述：
c=
续前：
波长：相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位 可用纳米（nm），微米（um）表示： 1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m 频率（ ）：是每秒内光波的振动次数，单位是赫 兹（Hz）
续前
优点：对照法采用对照品与供试品平行操作的方 式，具有消除仪器与方法误差的优点，是中国药 典中采用较多的方法。
四、比色法

测定能吸收可见光的有色溶液的方法，通常称为 光电比色法或比色法 。 应用：有色物质、无色但经显色反应可以生成有 色的物质都可以采用本法在适宜的条件下进行分 析，无色而在紫外光区吸收弱或无吸收的化合物 通过适宜的显色反应，生成有色化合物进行测定， 可以提高测定的灵敏度。 目视比色法是用眼睛辨别、比较供试品溶液与标 准溶液的颜色深浅，以确定被测物质的含是。
吸收峰 最大吸收波长λmax 吸收谷 最小吸收波长λmin 肩峰λsh 末端吸收
续前

λmax、λmin、λsh及整个吸收光谱的形状取决于 物质的分子结构，可作为定性分析的依据。

同一物质的吸收光谱应有相同的λmax、λmin、 λsh；而且在相同浓度时，同一物质的吸收曲线应 相互重合。
第二节
紫外-可见分光光度法
用分光光度法进行鉴别时的要求: 仪器必须按要求严格校正合格后方可使用 样品的纯度必须达到要求才能测定
（二）纯度检查

药物的吸收光谱与所含杂质的吸收光谱有差异时， 可用紫外-可见分光光度法检查杂质。 检查对象：药物在紫外光区或可见光区无吸收而 杂质有吸收，或在杂质吸收峰处药物无吸收，则 杂不质可被检查出来。 例如：肾上腺素中肾上腺酮的检查。
0.414 C= A 1% L = 207 × 1 E1cm = 0.00200 (g/100ml)

即该溶液的浓度为0.002%（g/ml），即100ml维 生素B12水溶液中含维生素B120.002g。
1、吸收系数法：

（2）按各品种项下的方法配制供试品溶液，在 规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定 条件下的吸收系数计算含量。
物质对光的吸收具有选 择性，若溶液选择性地 吸收了某种颜色的光， 则溶液呈吸收光的互补 光。
波长范围：


可见光区：400-760 nm
复合光
紫外光区：近紫外区200 - 400 nm
远紫外区100 - 200 nm

红外光区：0.76~500um 近红外区：0.76~2.5um 中红外区：2.5~50um 远红外区：50~500um


（三）含量测定
1、吸收系数法：
（1）利用待测物质的吸收系数与测得的一定浓度时 的吸收度比较计算含量的方法，又称绝对法。 根据朗伯-比尔定律A=ECL，得：
A C = 1% E1cm L
例1

已知维生素B12在361nm处的E值是207，现测得维 生素B12水溶液的吸收度为0.414，吸收池厚度为 1cm，求该溶液的浓度。 解：
A标 C标 A供 = C供
C供 = A供 C标 A标
例3

精密称取奥沙西泮供试品与对照品各15mg，加乙醇溶解 并稀释至200ml，再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加乙 醇稀释至刻度，在229nm波长处测定吸收度分别为：A供 =0.462，A标=0.470，求奥沙西泮的含量。 解：供试品与标准品在相同条件下配制与测定，C标=C原