第5章 灭菌及空气除菌解析
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第五章灭菌——精选推荐
第五章灭菌第五章灭菌污染杂菌的危害1.消耗营养物质。
2.抑制发酵菌⽣长。
3.改变培养液理化性质。
4.抑制产物⽣物合成。
5.噬菌体污染。
第⼀节灭菌的基本原理⼀、灭菌定义指⽤化学的或物理学的⽅法杀灭或除掉物料或设备中所有的有⽣命的有机体的技术或⼯艺过程。
⼆、常⽤灭菌⽅法1.化学物质灭菌利⽤化学试剂（甲醛、苯酚、⾼锰酸钾等）与微⽣物细胞中某种化学成分反应，如使蛋⽩质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性等杀灭微⽣物。
应⽤：实验室和⽆菌室的空间灭菌，设备、器械、双⼿的消毒灭菌，但不能⽤于培养基的灭菌。
2.辐射灭菌原理：利⽤⾼能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微⽣物常⽤：紫外线、X 射线和γ射线紫外线：诱导了胸腺嘧啶⼆聚体的形成和DNA 链的交联，从⽽抑制了DNA 的复制，导致菌体死亡。
波长为260nm 的杀菌⼒最强穿透⼒差。
应⽤：适于表⾯灭菌。
⽆菌室、接种箱3.⼲热灭菌在⼲燥⾼温条件下，微⽣物细胞内的各种与温度有关的氧化反应速度迅速增加，是微⽣物的致死率迅速增⾼的过程。
常⽤⽅法：灼烧和电热箱加热，160℃ 2⼩时发酵的流程空⽓空⽓净化处理保藏菌种斜⾯活化扩⼤培养主发酵碳源、氮源、⽆机盐等营养物质灭菌成品使⽤范围：需要保持⼲燥的器械、容器的灭菌。
玻璃及⾦属⽤具及沙⼟管灭菌4.过滤除菌原理：利⽤微⽣物不能透过滤膜⽽达到除菌⽬的。
⽅法: 0.01~0.45 m孔径滤膜，使⽤范围：⽤于压缩空⽓、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。
5.湿热灭菌由于蒸汽具有很强的穿透⼒，冷凝时可释放出⼤量潜热，且在⾼温有⽔分条件下，蛋⽩质易变性，使微⽣物死亡。
常⽤⽅法：⽔煮常压灭菌：100℃，40-60min⾼压蒸汽灭菌：⼀般121℃，30分钟使⽤范围：培养基和发酵设备灭菌。
湿热灭菌的优点：蒸汽有强的穿透⼒，灭菌易于彻底；蒸汽来源容易，操作费⽤低，本⾝⽆毒；操作⽅便，易管理。
三、湿热灭菌的理论基础1.灭菌指标的确定⼤多数微⽣物最适温度为25~27℃,维持温度为5~50℃，当温度超过最⾼限温时微⽣物就会发⽣死亡。
空气除菌方法ppt课件
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3
中国药品生产洁净室（区）的空气洁净度标准
洁净度级别
100 10000 100000 300000
尘埃最允许数/立方米
≥0.5um
≥5um
3500
0
350,000
2,000
3,500,000
20,000
10,500,000
61,800
微生物最大允许数
浮游菌个/立方米 沉降菌个/皿.30min
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9
提高压缩前空气的质量
主要措施是提高空气吸气口的位置和加强吸入空气的压缩前过滤。 (1)空气吸气口 提高空气吸气口的高度可以减少吸入空气的微生物含量。吸气口每提高
3.05m，微生物数量减少一个数量级。一般以离地面5~10m为好。在吸气 口处需要设置防止颗粒及杂物吸入的筛网(也可以装在粗过滤器上)，以 免损坏空气压缩机。 (2)粗过滤器 吸入的空气在进入压缩机前先通过粗过滤器过滤，可以减少进入空气压 缩机的灰尘和微生物。常用的粗过滤器有油浸铁丝网、油浸铁环和泡沫 塑料等。
二是用粒子计数器测定空气中的粒子数是否超标，有无 达到洁净度要求。
镜检：采用显微镜直接观察取样中有无杂菌，明显的优 势是快速，但染菌初期或杂菌少时无法确定，一般与肉 汤法配合使用。
试剂盒：近几年出现的快速、高效检测灭菌效果和染菌 的新手段。
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12
空气系统的无菌检测
主要考察过滤器是否失效。过滤器失效的检测方法一是 检测过滤器两侧的压降，压降大说明过滤介质被堵塞；
④进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10-30℃。
⑤压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率
为10-3为指标。也可以把100级作为无菌空气的洁净指标。
第5章-灭菌及空气除菌解析
用蒸汽加热的方法对培养基灭菌的要求: 既要达到一定的灭菌程度。 又要尽量减少营养成分的破坏。
（一）理论灭菌时间
某些分子的分解和分子内部的重新排列 的反应属于单分子反应。
杂菌虽然是一个复杂的高分子体系, 但 其受热被杀死, 主要原因是高温能使蛋 白质变性, 这种反应属于单分子反应, 因此, 杂菌在一定温度下受热死亡也遵 循单分子反应方程。
影响加压蒸汽灭菌效果的因素
（1）灭菌物体含菌量的影响 （2）灭菌锅内空气排除程度的影响 （3）灭菌对象pH的影响 （4）灭菌对象的体积 （5）加热与散热速度
（1）灭菌物体含菌量的影响
天然原料尤其是麸皮等植物性原料配成 的培养基, 一般含菌量较高, 而用纯粹 化学试剂配制成的组合培养基, 含菌量 低。
作分别灭菌, 然后再混合, 就不易形成磷酸 盐沉淀。
（4）对含有在高温下易破坏成分的培养 基（如含糖组合培养基）可进行低压灭 菌（在112℃即0.57kg／cm2或8磅／英寸 2下灭菌15min）或间歇灭菌。
（5）在大规模发酵工业中, 可采用连续 加压灭菌法进行培养基的灭菌。
（四）灭菌设备
1. 高压蒸汽灭菌设备 2. 常压蒸汽灭菌锅
二、几个概念
（一）灭菌 （二）消毒 （三）防腐 （四）化疗
（一）灭菌（sterilization）
灭菌: （p128） 采用理化因素使任何物体内外部的一切微生
物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭 菌。 Sterilization就是失去繁殖力。
例如各种高温灭菌措施等。 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌
体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后， 其细胞发生溶化、消失的现象 。
（二）消毒
从字义上来看, 消毒就是消除毒害, 这 里的“毒害”就是指传染源或致病菌的 意思。
第五章 发酵工程的灭菌与空气除菌-董媛
缺点：1）加热和冷却所需时间较长，增加了发酵的准 备时间，也就相应地延长了发酵周期，使发酵罐的利 用率降低。
2）分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，因而不可
避免地使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏。
150
保温
100 温度/℃ 冷却 加热 50
40
80
120
160
200
240
时间/min
分批灭菌包括升温、保温和冷却3个阶段。
检验学院Байду номын сангаас
第五章 发酵工程的灭菌与空气 除菌
吉林医药学院 董 媛
检验学院
本章内容
1 2 3 4
常用灭菌方法和发酵设备种类 培养基的灭菌 发酵设备的清洗和灭菌
空气的除菌
※※灭菌与消毒
灭菌“ sterilization” ：采用物理或化学方法杀死或 除去物料、空气、容器、器具等环境中所有微生物，
实验室内哪些操 包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
总 过 滤 器
空 气 加 热 器
丝 网 除 末 器
旋 风 分 离 器
检验学院
五、空气过滤除菌流程
（一）空气预处理 空气预处理的主要目的： 1 ．提高压缩空气的洁净度，降低空气过滤器的 负荷。 2 ．去除压缩后空气中所带的油水，以合适的空 气湿度和温度进入空气过滤器。 采风塔: ≥10m ,上风头, 流速8m/s.
检验学院
※※第三节 空气的除菌
检验学院
分布规律： 微生物在空气中的分布情况与空气环境因 素有关，空气质量愈好，微生物的种类及 数量愈低。发酵工厂通常采用高空采气的 方法。
检验学院
二、发酵用无菌空气的概念和质量标准
为确保生产在纯种培养状态下进行，严格无菌条件下
2）分批灭菌无法采用高温短时间灭菌，因而不可
避免地使培养基中营养成分遭到一定程度的破坏。
150
保温
100 温度/℃ 冷却 加热 50
40
80
120
160
200
240
时间/min
分批灭菌包括升温、保温和冷却3个阶段。
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第五章 发酵工程的灭菌与空气 除菌
吉林医药学院 董 媛
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本章内容
1 2 3 4
常用灭菌方法和发酵设备种类 培养基的灭菌 发酵设备的清洗和灭菌
空气的除菌
※※灭菌与消毒
灭菌“ sterilization” ：采用物理或化学方法杀死或 除去物料、空气、容器、器具等环境中所有微生物，
实验室内哪些操 包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。
总 过 滤 器
空 气 加 热 器
丝 网 除 末 器
旋 风 分 离 器
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五、空气过滤除菌流程
（一）空气预处理 空气预处理的主要目的： 1 ．提高压缩空气的洁净度，降低空气过滤器的 负荷。 2 ．去除压缩后空气中所带的油水，以合适的空 气湿度和温度进入空气过滤器。 采风塔: ≥10m ,上风头, 流速8m/s.
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※※第三节 空气的除菌
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分布规律： 微生物在空气中的分布情况与空气环境因 素有关，空气质量愈好，微生物的种类及 数量愈低。发酵工厂通常采用高空采气的 方法。
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二、发酵用无菌空气的概念和质量标准
为确保生产在纯种培养状态下进行，严格无菌条件下
课用第五章_发酵工程的灭菌与空气除菌
6、物理法
① 干热灭菌法 ：灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品 在干热灭菌器中，于160℃下保存1h。有纸或棉塞者灭菌不能超过170℃。
②射线灭ห้องสมุดไป่ตู้法：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的γ射线进行 灭菌的方法，波长范围在200～275nm的紫外线具有杀菌作用，杀菌作用 最强的范围是250 ～270nm，波长为253.7nm的紫外线杀菌作用最强。在 紫外灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3 ～5min，芽孢约10min即可 杀灭。但其穿透力较差，一般只适于接种室、超净工作台、无菌培养室 及物质表面杀菌。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，对杆菌杀灭力强， 对球菌次之，对酵母菌、霉菌等较弱，因此常与化学灭菌结合使用。 ③ 过滤除菌：使用适当的过滤材料或介质对液体或气体进行过滤，出去微 生物的方法。主要适用于：热敏感物质（生长因子、抗生素、培养基） 的灭菌和发酵用无菌空气的制备。
臭氧灭菌在药品生产中具有广泛的用途。 ①对管道容器的灭菌；
②与HVAC相结合，利用中央空调净化系统对洁净 区的灭菌；
③对原辅助材料和工作器具的灭菌； ④对密闭空间的灭菌； ⑤对药厂用水的灭菌处理。
3、辐射灭菌
辐射灭菌是利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭 微生物。 α射线、X射线、β射线、γ射线、紫外线、超 声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物 质，从而起到杀菌作用。 X射线、γ射线，波长0.1~1.4Å，含有极高的能量，使 菌体内的水和有机物产生强烈的离子化反应，产生自 由基，进一步与氧作用，产生一些具强氧化性的过氧 化物，如HO2 、H2O2，使细胞内某些蛋白质和酶发生 变化，阻碍微生物的代谢活动而导致菌体损伤或迅速 死亡。 X射线的穿透力极强，但不经济，并且向四面八方辐射， 不适于发酵生产使用。
5第五章 灭菌与空气的净化
• 培养基中的含菌数以1mL培养基的含菌数 来计算，计算公式如下： • t=2.303/klg(c0/ct)
• C0－单位体积培养基灭菌前的含菌个数，个/mL • Ct－单位体积培养基灭菌后的含菌个数，个/mL
例 题
• 有一发酵罐内装40m3培养基，在131℃温度下进行 连续灭菌。原污染程度为每1mL有2×105个耐热细 菌芽孢，131 ℃时灭菌速度常数为1.5min-1。求灭 菌失败几率为0.001时灭菌所需要的维持时间。
ψ通常必要的灭菌条件是110～130℃，5～ 20min。 ψ芽孢对热耐受强，并不始终符合对数残留定 律。 ψ培养液灭菌多采用高温短时间加热的方式。 ψ一般以芽孢细菌和细菌芽孢的数量合作为依 据来计算灭菌时间。 ψ在实际操作中，要达到Nt＝0，即t为∞，是 不可能的，因此，在设计时常采用
(1)/(2)
ln(k' /k' ) 2 1
E’
>1
灭菌时活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E’
ln(k2/k1 ) ln(k'2/k'1 )
>1
ℓ所以，随温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养 成分分解的速率常数的增加 ℓ 灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高超过了培养基营养成分破 坏的速度 ℓ 温度升高时，微生物死亡的速度更快
氧化剂
过氧化氢 过氧乙酸
卤素类 醇类
碘液 乙醇 石炭酸
酚类 来苏 表面活性剂 酸碱类 新洁尔灭 生石灰
染料
龙胆紫
2～4
表浅创伤消毒
二.湿热灭菌的原理及影响因素
1. 湿热灭菌的原理
湿热灭菌：就是直接用高温蒸汽灭菌。蒸汽在冷凝时 释放出大量潜能，蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热 破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失活，微生物 因代谢障而死亡。
第五章_发酵工程的灭菌与空气除菌
分批灭菌设备示意图
三路进汽：蒸汽从通风、 取样和出料口进入罐内 直接加热，直到所规定 的温度，并维持一定的 时间。这就是所谓的 “三路进气”。 四路出汽：在液面以上 的管道口则应排放空 气，即蒸汽从排气、接 种、进料和消沫剂管排 气连续灭菌(continuous sterilization)
成的组合培养基。
（6）冷空气排除情况
冷空气不但导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌的物品，还 会降低蒸汽分压，使罐内实际温度低于压力表所对应的温 度，造成灭菌温度不够。
（7）泡沫
泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，需加消 泡剂。
（8）搅拌
避免局部过热或形成灭菌死角。
二、培养基的灭菌
无菌的标准：
根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌
• 培养基中不同营养成分间的相互作用；
• 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4、灭菌的方法
（1）化学法（化学药品灭菌法）： 化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。消毒剂 与防腐剂的区分并不严格。 灭菌机理： 化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）与微生物细胞中 的某些成分产生化学反应，如蛋白质变性、核酸的破坏、
（三）发酵对空气无菌程度的要求
各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同： 不同菌种的生产能力、生长速度、发酵周期、产物性质、
培养基营养成分和pH的差异等不同，对空气质量有不同
的要求； 如：氨基酸和抗生素因发酵周期长短的不同；对无菌空气 要求不同。 发酵工业的“无菌空气”；一般按染菌机率为10-3来计算， 即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许1~2次染菌。
优点：无需专一灭菌设备，操作简便。 缺点：加热和冷却时间较长，易发生过热破坏营养分 的现象，发酵罐利用率低。 灭菌流程：包括：加热、维持、冷却3阶段。
灭菌及无菌空气的制备
pH值对灭菌时间的影响
温度 （℃）
120 115 110 100
孢子数 （个/mL) pH6.1
10000
8
10000
25
10000
70
10000
740
灭菌时间（min）
pH5.3
pH5.0
pH4.7
7
5
3
25
12
13
65
35
30
720
180
150
pH4.5
3 13 24 150
影响灭菌效果的因素
升温
4、冷却保压：把培养基降低到接种的温度
分批灭菌过程包括：升温、保温和冷 却等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%。应当避免长时间的 升温加热阶段，因为加热时间过长， 不仅破坏营养物质，而且也有可能引 起培养液中某些有害物质的生成，从 而影响培养过程的顺利进行。
0
80 120 160
分批灭菌的时间计算
若不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看成在保 温阶段被杀死，可粗略计算灭菌所需时间。
例：发酵罐内装40m3培养基，在温度121℃下进行实罐灭菌。原 污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢， 121℃时灭菌速率常数 为-1，求灭菌失败概率为时所需要的灭菌时间。
解：N0=40 ×106 × 2×105（个） Nt（个）
连续灭菌时间的计算：
连续灭菌的时间的计算，含菌数应改为每毫升培养基的含菌数。
例：发酵罐内装40m3培养基，在温度131℃下进行连续灭菌。 原污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢， 131℃时灭菌速 率常数为15min-1，求所需要的灭菌时间。
解：c0= 2×105（个/ml） ct=1 /40 ×106 ×103 =2.5 ×10-11 （个/ml） k=15min-1
温度 （℃）
120 115 110 100
孢子数 （个/mL) pH6.1
10000
8
10000
25
10000
70
10000
740
灭菌时间（min）
pH5.3
pH5.0
pH4.7
7
5
3
25
12
13
65
35
30
720
180
150
pH4.5
3 13 24 150
影响灭菌效果的因素
升温
4、冷却保压：把培养基降低到接种的温度
分批灭菌过程包括：升温、保温和冷 却等三个阶段。各阶段对灭菌的贡献： 20%、75%、5%。应当避免长时间的 升温加热阶段，因为加热时间过长， 不仅破坏营养物质，而且也有可能引 起培养液中某些有害物质的生成，从 而影响培养过程的顺利进行。
0
80 120 160
分批灭菌的时间计算
若不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看成在保 温阶段被杀死，可粗略计算灭菌所需时间。
例：发酵罐内装40m3培养基，在温度121℃下进行实罐灭菌。原 污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢， 121℃时灭菌速率常数 为-1，求灭菌失败概率为时所需要的灭菌时间。
解：N0=40 ×106 × 2×105（个） Nt（个）
连续灭菌时间的计算：
连续灭菌的时间的计算，含菌数应改为每毫升培养基的含菌数。
例：发酵罐内装40m3培养基，在温度131℃下进行连续灭菌。 原污染程度为每毫升2×105感染耐热细菌芽孢， 131℃时灭菌速 率常数为15min-1，求所需要的灭菌时间。
解：c0= 2×105（个/ml） ct=1 /40 ×106 ×103 =2.5 ×10-11 （个/ml） k=15min-1
第5章 灭菌
5.2.3 连续灭菌的设计
1.连消塔连续灭菌流程
2、喷射加热连续灭菌流程
3、薄板换热器连续灭菌流程
4.连续灭菌设备的结构
套管式连消塔（加热）
蒸汽导入管
外套管
喷嘴式连消塔（加热）
维持罐（保温）
薄板换热器（冷却、加热）
5.3 空气的除菌
氧气 氮气 气态物质的混合物 惰性气体 二氧化碳 水蒸汽 空气（即大气） 空气（即大气） 悬浮在空气中的灰 尘
可穿透玻璃、陶瓷和薄塑料等物质，但不能穿透金属表面。 可穿透玻璃、陶瓷和薄塑料等物质，但不能穿透金属表面。 主要用于食品、非金属器械、检验室用品、无菌室和病室中食品用具、 主要用于食品、非金属器械、检验室用品、无菌室和病室中食品用具、 药杯及其他用品的消毒。 药杯及其他用品的消毒。
5.1.3 干热灭菌
5.2.2 培养基的分批灭菌
1. 分批灭菌的设计 在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过 程包括升温、保温、降温三个过程。
灭菌
2. 保证分批灭菌成功的要素
内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠， 蛇管无穿孔现象； 压力稳定的蒸汽； 合理的操作方法。
发酵罐体积越大， 发酵罐体积越大，培养基 中高温下持续的时间也越 长，其营养成分遭受破坏 也越严重。 也越严重。
干热灭菌的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性。 干热灭菌的杀菌作用是通过脱水干燥和大分子变性。
1. 焚烧 用于废弃物品或动物尸体等； 用于废弃物品或动物尸体等； 2. 烧灼 用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。 用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌。 3. 干烤 烤箱灭菌（ ），适用于高温下不变质 烤箱灭菌（160~170ºC，2h），适用于高温下不变质、不损坏、不蒸 ， ），适用于高温下不变质、不损坏、 发的物品 4. 红外线 红外线是一种0.7~1000µm波长的电磁波， 尤以 波长的电磁波，尤以1~10µm波长的热效应 红外线是一种 波长的电磁波 波长的热效应 最强，热效应只能在照射到的表面产生，多用于医疗器械的灭菌。 最强，热效应只能在照射到的表面产生，多用于医疗器械的灭菌。
五章灭菌与空气的净化共32页文档
⑷ 新洁尔灭 新洁尔灭是表面活性剂类洁净 消毒剂。它在水溶液中以阳离子形式与菌体 表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白变性。 10 min能杀死营养细胞，但对细菌芽孢几乎 没有杀灭作用。一般用于器具和生产环境的 消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝 制品。
⑸ 甲醛 甲醛(HCHO)是强还原剂，它能与 蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨 基和蛋白质的变性有较强活性，这是用甲 醛作为灭菌剂的根据。使用时可以以2份37 ％甲醛溶液与1份KMnO4混合，或者将37％甲 醛溶液直接加热，产生气态甲醛用于灭菌。 甲醛灭菌的缺点是穿透力差。
热困难，热难穿透过去杀灭微生物
⒊ 分批灭菌和连续灭菌比较 连续灭菌与分批灭菌比较的优点： ① 可采用高温短时灭菌，培养基受热时间
短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产 率；
② 发酵罐利用率高； ③ 蒸汽负荷均衡； ④ 采用板式换热器时，可节约大量能量； ⑤ 适宜采用自动控制，劳动强度小。
培养基配料 配料罐 加热器 维持罐 冷却器 无菌培养基
连续灭菌流程
⑵ 间歇灭菌
间歇灭菌即实消，是在每批培养基全部流 入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭 菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温 度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭 菌。
其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备 十分耐压，则可采用较高的温度，但必须 注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸 汽不能到达的部位。
微生物与发酵工艺
第五章 灭菌与空气的净化
第五章 灭菌与空气的净化 第一节 灭 菌 第二节 空气的净化
第一节 灭 菌
一、灭菌的方法 灭菌指利用物理和化学的方法杀灭或除去
物料及设备中一切生命物质的过程。 消毒是指用物理或化学的方法杀死物料、
⑸ 甲醛 甲醛(HCHO)是强还原剂，它能与 蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨 基和蛋白质的变性有较强活性，这是用甲 醛作为灭菌剂的根据。使用时可以以2份37 ％甲醛溶液与1份KMnO4混合，或者将37％甲 醛溶液直接加热，产生气态甲醛用于灭菌。 甲醛灭菌的缺点是穿透力差。
热困难，热难穿透过去杀灭微生物
⒊ 分批灭菌和连续灭菌比较 连续灭菌与分批灭菌比较的优点： ① 可采用高温短时灭菌，培养基受热时间
短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产 率；
② 发酵罐利用率高； ③ 蒸汽负荷均衡； ④ 采用板式换热器时，可节约大量能量； ⑤ 适宜采用自动控制，劳动强度小。
培养基配料 配料罐 加热器 维持罐 冷却器 无菌培养基
连续灭菌流程
⑵ 间歇灭菌
间歇灭菌即实消，是在每批培养基全部流 入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭 菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温 度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭 菌。
其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备 十分耐压，则可采用较高的温度，但必须 注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸 汽不能到达的部位。
微生物与发酵工艺
第五章 灭菌与空气的净化
第五章 灭菌与空气的净化 第一节 灭 菌 第二节 空气的净化
第一节 灭 菌
一、灭菌的方法 灭菌指利用物理和化学的方法杀灭或除去
物料及设备中一切生命物质的过程。 消毒是指用物理或化学的方法杀死物料、
灭菌与空气除菌
缺点：
对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批
灭菌好，防止灭菌不彻底。 不适合含有大量固体物料培养基灭菌。
第32页，共56页。
分批灭菌优点：不需其他设备，操作简单易行； 不需设备进行加热冷却； 适合小型发酵罐中培养基灭菌； 适合含固体颗粒或较多泡沫培养基灭菌。 缺点：对培养基营养成分破坏较大； 培养基反复冷却耗能增加发酵周期延长； 降低发酵罐利用率。
冷空气排除情况
第23页，共56页。
（二）分批灭菌（实罐灭菌）
1.灭菌工艺过程
分空气过滤器灭菌
并用空气吹干
夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀， 达70℃左右 空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽
取样管 放料管
通蒸汽 120℃，1×105pa
保温
保温阶段，凡液面以下各管道 都应通蒸汽，液面上其余各管 道则应排蒸汽，不留死角，维 持压力、温度恒定
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4. 影响培养基灭菌的因素
培养基成分
油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物 等增加微生物的耐热性
低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随 着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以 上，则减弱微生物的耐热性。
微生物细胞含水量。含水量越少，灭菌时间越长。
培养基在灭菌之前存在各种微生物，他们的k不相同， 上式可写成
lg k
E
lg A
同一微生物在不2同.灭3菌03 温R 度下T，k不同，灭菌温度越低，k
越小；灭菌温度越高，k越大。
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(2) 非对数残留定律
某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些微生物
第五章 培养基灭菌及空气除菌
第5章培养基灭菌和空气除菌教研室：生物工程教师姓名：余有贵教学过程一、灭菌的意义和方法1、灭菌的意义采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等。
保证纯种发酵，防止杂菌和噬菌体污染。
消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施。
2、灭菌的方法（1）火焰灭菌：接种时使用, 灼烧是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用于接种环、接种针等少数对象的灭菌（2）干热灭菌法：适于灭菌后要求保持干燥状态的物料，将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内，在150～170℃下维持1～2小时后，即可达到彻底灭菌的目的。
在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。
（3）湿热灭菌法：多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即可杀死；酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死；而细菌的芽孢最耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。
工业生产上广泛使用，常用120℃，20-30min。
（4）射线灭菌法：适于表面灭菌，紫外线波长在2600埃左右灭菌效力最强，一般用30瓦紫外灯照射20-30min（5）化学药剂灭菌：1）0.1%-0.25%的高锰酸钾溶液:皮肤消毒2）2%-5%漂白粉:用具和车间环境的灭菌3）70%-75%酒精溶液:皮肤和玻璃器皿表面灭菌4）0.25%新洁尔灭: 皮肤、小器皿表面和车间的灭菌5）0.5%甲醛:用于无菌室、空罐和车间空间的灭菌，10ml/m3,6-12h（6）高压静电灭菌：应用于空气的灭菌(7）介质过滤除菌：滤除血清和抗生素溶液内的微生物和空气过滤除菌。
二、培养基和设备的湿热灭菌1、湿热灭菌的原理1.1概念致死温度：杀死微生物的极限温度。
致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。
热阻：微生物在某一特定的条件下的致死时间性，表示微生物对热的抵抗力。
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几个问题
1、灭菌对发酵的意义 2、灭菌的原理 3、灭菌的方法 4、灭菌的对象 5、空气的灭菌
灭菌的目的及内容
目的：为了保证纯种并安全发酵 内容： 培养基 补料液（流加料） 发酵过程的无菌控制 空气系统 直接关系到 发酵罐 生产的成败! 管道系统 环境：需要消毒
（2）加压法
常规加压灭菌法:将盛有适量水的加压蒸汽灭
菌锅加热煮沸，彻底驱尽气体后将锅密闭。 分为两种具体的方法： ①再继续加热至121℃（压力为1kg／cm2或15 磅／英寸2），时间维持15～20min； ②或采用在较低的温度115℃，（即压力为 0.7kg／cm2或10磅／英寸2）下维持35min。 用途：一切微生物学实验室、医疗保健机构或发 酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。
连续加压灭菌法——“连消法”
用途：只在大规模的发酵工厂中作培养 基灭菌用。 主要操作：将培养基在发酵罐外连续不 断地进行加热、维持和冷却，然后才进 入发酵罐。 方法：培养基一般在135～140℃下处理 5～15秒钟以达到灭菌的目的。
连续加压灭菌法优点：
①因采用高温瞬时灭菌，故既可杀灭微生物，又 可最大限度减少营养成分的破坏，从而提高了原 料的利用率，比“实罐灭菌”（121℃，30min） 提高产量5～10％； ②由于总的灭菌时间较分批灭菌注明显减少，所 以缩短了发酵罐的占用周期，从而提高了它的利 用率； ③由于蒸汽负荷均匀，故提高了锅炉的利用率； ④适宜于自动化操作； ⑤降低了操作人员的劳动强度。
1．干热灭菌法
干热灭菌法： 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电 热干燥箱内，在160～170℃下维持1～2h后，即可 达到彻底灭菌的目的。 原因：在这种条件下，可使细胞膜破坏、蛋白质变 性、原生质干燥，以及各种细胞成分发生氧化。 适用对象：玻璃器皿、金属材料、耐高温物品。 灼烧：是一种最彻底的干热灭菌方法，但它只能用 于接种环、接种针等少数对象的灭菌。
第一节 消毒与灭菌
一、控制有害微生物的主要措施
二、几个概念
（一）灭菌 （二）消毒 （三）防腐 （四）化疗
（一）灭菌（sterilization）
灭菌： （p128） 采用理化因素使任何物体内外部的一切微生 物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭 菌。 Sterilization就是失去繁殖力。 例如各种高温灭菌措施等。 灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌 体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后， 其细胞发生溶化、消失的现象 。
（1）常压法
巴氏消毒法： 用于牛奶、啤酒、果酒和酱油 等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法， 其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛 奶中的结核杆菌或沙门氏菌），而又不影响它 们的风味。它是一种低温消毒法。 低温维持法：在63℃下保持30min可进行牛奶 消毒； 高温瞬时法：用于牛奶消毒时只要在72℃下保 持15秒钟即可。
一、高温杀菌
（一）高温致死原理 （二）高温灭菌的方法 （三）高温对培养基成分的有害影响及其防止 （四）灭菌设备
（一）高温致死原理
高温使微生物的蛋白质和核酸等重要生 物高分子发生变性、破坏。 例如它可使核酸发生脱氨、脱嘌呤或降 解，以及破坏细胞膜上的类脂质成分等。
（二）高温灭菌的方法
（1）低温 （2）缺氧 （3）干燥 （4）高渗 （5）高酸度 （6）防腐剂
（四）化疗（chemotherapy）
化疗:即化学治疗。它是利用具有高度选择 毒力（即对病原菌具有高度毒力而对宿主 无显著毒性）的化学物质来抑制宿主体内 病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该 传染病的一种措施。 用于化疗目的的化学物质称化学治疗剂。 最重要的化学治疗剂如各种抗生素、磺胺 类药物和中草药中的有效成分等。
第五章 发酵工业的灭菌及 空气除菌
第一节 第二节 第三节 第四节
消毒与灭菌 发酵工业的无菌技术 培养基与发酵设备的灭菌 空气的除菌
目的要求：
了解灭菌对发酵工业的意义，灭菌的原 理及常用的方法。 掌握培养基及发酵设备的灭菌方法。 了解生产中空气除菌的基本方法、原理 及设备。理解空气净化流程。
间歇灭菌法：又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。 方法：将待灭菌的培养基在80～100℃下蒸煮 15～60min，以杀死其中所有微生物的营养细 胞，然后置室温或37℃下保温过夜，诱导残留 的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜， 如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻 底灭菌的效果。 用途：适用于不耐热培养基的灭菌。
（二）消毒
从字义上来看，消毒就是消除毒害，这 里的“毒害”就是指传染源或致病菌的 意思。 消毒:是一种采用较温和的理化因素，仅 杀死物体表面或内部一部分对人体有害 的病原菌，而对被消毒的物体基本无害 的措施。
（三）防腐（antisepsis）
防腐:就是利用某种理化因素完全抑 制霉腐微生物的生长繁殖，从而达 到防止食品等发生霉腐的措施。
第二节 发酵工业的无菌技术
常用的除菌方法（p128-129） 一、高温灭菌：干热灭菌和湿热灭菌。火焰灭 菌：接种时用。 二、射线灭菌：用紫外线、高能电磁波或放射 性物质产生的高能粒子进行灭菌的方法。 三、化学药剂灭菌：一些化学药剂能与微生物 反应而具杀菌作用。适用于环境、设备等方面 的消毒，一般不用于培养基的灭菌。 四、过滤除菌：利用过滤方法阻留微生物，达 灭菌目的。适用于澄清流体（如气体和液体） 的除菌以及热敏性培养基的除菌。
2．湿热灭菌法
湿热灭菌法：利用饱和蒸汽进行灭菌的方法。 湿热灭菌法与干热灭菌法的比较：湿热灭菌法比 干热灭菌法更有效，这一方面是由于湿热易于传 递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白 质稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。 方法：常压和高压。
微生物的耐热情况： 多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理5～10min后即 可杀死； 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些，要用80℃以上的温度处理 才能杀死； 细菌的芽孢最耐热，一般要在121℃下处理15min才能杀死。