【CN109810185A】一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910276004.5
(22)申请日 2019.04.08
(71)申请人 北京蛋白质组研究中心
地址 102206 北京市海淀区中关村生命科
学园生命园路38号
(72)发明人 钱小红　张养军　余谦　张普民　
高方圆　焦丰龙　夏朝双　张汉卿　
(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限
公司 11245
代理人 关畅
(51)Int.Cl.
C07K 14/765(2006.01)
C07K 1/36(2006.01)
C07K 1/18(2006.01)
C07K 1/20(2006.01)
C07K 1/30(2006.01)
(54)发明名称
一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法
(57)摘要
本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分
离纯化方法。

该方法首先采用热乙醇沉淀法从转
基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利
用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先
用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用
反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。

结
果表明，本发明能从转基因猪血浆中分离纯化出
高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清
白蛋白用于临床用药和生化研究中。

权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 109810185 A 2019.05.28
C N 109810185
A
权　利　要　求　书1/2页CN 109810185 A
1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括：
1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液；
2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液；
3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有重组人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得；
具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L；
所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液；
具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃；
所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃；
所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至
5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L；
所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同；
所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％；
所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h；
所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水；
所述一次离心和二次离心步骤中，离心力为4500-5000×g；具体为5000×g；时间为50-70min；具体为60min。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/L Tris-HCl，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl+0.3mol/L NaCl；
所用阴离子交换色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱；流速为1mL/min；柱温为室温；检
2。