胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景

胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景作者：王士珍李雪甫陈培来源：《科技视界》2012年第23期【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。

理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。

本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。

【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。

英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。

Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。

同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。

一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称为胚胎干细胞。

饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。

当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。

至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。

这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。

所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。

1诱导ES细胞定向分化的方法目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。

最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。

1.1化学试剂诱导法维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。

Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。

实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。

目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。

一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白 (cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然后复合物进入细胞核内，与染色质上的受体结合，从而调控一系列基因的表达，使细胞的表型发生转变。

二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫的有机化合物，不仅能用于细胞的常规冻存，而且还是一种常用的细胞分化诱导剂，能够诱导ES细胞分化为骨骼肌细胞、心肌细胞等，其作用机制主要是影响c-myc基因表达，降低细胞的内源性聚腺苷二磷酸核苷表达水平。

也有研究证明，DMSO能使细胞内储存的钙释放出来，而细胞内钙离子浓度升高在诱导细胞分化中可能起着重要作用。

除了RA、DMSO外，还有β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，也能诱导ES细胞定向分化为特定类型细胞。

1.2细胞因子诱导法ES细胞在培养过程中对许多细胞因子具有很强的依赖性。

增加或撤销一种或几种细胞因子可影响ES细胞的增殖或分化。

目前研究最深入的细胞因子主要有骨形成蛋白(BMPs)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。

Li等[4]实验证实：BMP-4诱导猴ES细胞分化产生的造血前体细胞集落的数目比未添加的对照组升高了17倍。

FGF-2诱导的信号转导为正常细胞生长发育所必需的，参与骨骼形成、血管再生、胚胎发育等生理过程。

有实验证明FGF-2处理ES细胞后，致使核内2种转录因子（Nkx2.5、d-Hand）表达增强，促进ES细胞向心肌细胞分化。

1.3转基因方法诱导ES细胞分化细胞因子法的优点是操作简便，但其诱导产生的目的细胞数量太少，并且纯度不高。

而转基因法可以弥补细胞因子法的不足，其原理是使某个促分化基因在ES细胞中过度表达，从而调控ES细胞的分化。

应用此方法之前，首先要确定决定该细胞向不同方向分化的关键基因，其次还要确保在正确的时间将此基因插入到ES细胞基因组正确序列上。

Prelle等[5]发现胰岛素生长因子II（insulin growth factor II , IGF II）促进小鼠ES细胞向骨骼肌细胞分化时，超表达IGF II基因的ES细胞与未超表达IGF II基因的ES细胞相比，前者在早期阶段有高水平的骨骼肌特异基因表达（myf5、myoD、myogenin）。

目前许多研究都已证明此方法可使ES细胞定向分化为胰腺细胞、神经细胞、肌细胞等。

1.4共培养诱导法近年来，越来越多的实验研究认为共培养诱导法在ES细胞向各种目的细胞分化过程中具有十分重要的作用。

应用与目的细胞共培养诱导ES细胞向肝细胞、脂肪细胞等成功分化的报道屡见不鲜。

Mummery等[6]将ES细胞和小鼠内胚层样细胞（END-2）共培养10天，共培养的ES细胞出现节律性收缩，并且还表达了一些心肌细胞特异性蛋白。

此实验说明，小鼠内胚层样细胞可能为ES细胞向心肌细胞分化提供了特定的生长因子或微环境，从而促进了ES细胞向目的细胞的分化。

2诱导分化后的细胞类型2.1心肌细胞在特定条件下，ES细胞可定向分化为具有节律性收缩的心肌细胞。

这就为研究心脏基因表达和功能提供了较好的体外模型。

王治等[7]发现神经调节蛋白1诱导心肌细胞分化率显著高于自发心肌分化率，并且神经调节蛋白1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5mRNA表达。

李卫东[8]等的研究结果显示，心肌细胞可诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞定向分化，诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现，并表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、β-actin。

2.2神经细胞ES细胞分化成神经细胞是一个漫长复杂的过程，涉及不同基因在时空的顺序表达，不同的细胞内外信号相结合诱导了神经细胞的分化成熟。

在ES细胞向神经细胞的诱导分化中，RA 担当了重要角色[9,10]。

Dinsmore等[11]发现RA对诱导ES细胞分化为神经细胞有很高的效率。

不论体内还是体外，RA单独作用可诱导ES细胞分化为神经细胞, 经RA诱导得到的神经细胞移植入吡啶-2，3-二羧酸损伤纹状体的大鼠(一种亨廷顿病的大鼠模型)后使得这些大鼠能够生存到6周。

Zhang等[12]将人ES细胞进行悬浮培养以获得拟胚体, 改用神经细胞培养液培养, 然后分离出一部分分化的拟胚体, 在含有bFGF-2的培养液中继续培养, 最终有96%的细胞表达神经元标志。

在国内，胡智兴(2011)、王治（2009)、韦多（2008）、鲍柳君(1998)、申景领(2007)等都有过关于从ES细胞中成功诱导为神经细胞的报道。

2.3造血细胞ES细胞向造血细胞分化的研究开始于20世纪80年代。

研究发现ES细胞具有广泛分化为造血细胞的潜能，在适当的条件下可向各种造血细胞分化，例如巨核系、粒单系、红系、肥大细胞以及淋巴细胞等。

Palacios等[13]将ES细胞置于含IL-3、IL-6和RPO.10的饲养层上培养，并加入培养FLS4.1胎肝饲养层细胞系的上清液，培养5-7 天后，用此诱导后细胞注入已受致死量照射的受体小鼠，15-20天后检测发现，此诱导后细胞能恢复受体鼠红系、髓系和淋巴的造血功能。

Kaufman等[14]于2011年利用人ES细胞与一种小鼠造血基质细胞共培养的方法, 成功诱导分化出造血祖细胞。

2.4肝细胞Chinzei等[15]研究发现：用去除白血病抑制因子的培养液对ES细胞进行悬浮培养，结果在形成的拟胚体中发现了2种肝细胞特异性蛋白（甲胎蛋白和白蛋白），证实ES细胞能在体外分化为肝细胞。

Shirahashi等[16]改进了体外ES细胞分化为肝细胞的培养条件。

他们尝试了多种培养基、生长因子以及诱导因子的组合, 最后发现用DMEM加上20％的胎牛血清, 以及人胰岛素、地塞米松和1型胶原最有利于小鼠ES细胞分化为肝细胞。

小鼠ES细胞用上述培养液处理后, 前白蛋白基因表达量为20%, 白蛋白合成率为7%。

后续研究还表明，和小鼠肝内表达情况类似，此培养条件对人ES细胞亦有同样的诱导效果。

2.5成骨细胞ES细胞作为最有希望成为骨组织工程的种子细胞，其在体外向成骨细胞分化的研究开展的比较晚。

Buttery将小鼠ES细胞进行悬浮培养，然后用胰酶把形成的EB消化成单细胞，并在添加了β-磷酸甘油、维生素C (VC)和地塞米松或RA的培养液中培养，或与小鼠胎儿成纤维细胞共培养。

研究发现，地塞米松能够协同维生素C以及β-磷酸甘油最大程度诱导骨结节的形成，而且此种诱导作用具有时间依赖性[17]。

在国内，曹炜鹏等[18]的研究结果表明：脉冲电磁场可以促进小鼠ES细胞向成骨细胞分化,而且脉冲电磁场和常规化学诱导剂联合应用会产生协同效应，其成骨诱导效果优于两者单独应用。

2.6内皮细胞Levenberg等[19]对人ES细胞进行悬浮培养，将得到的EB用血小板内皮细胞黏附分子-1筛选，然后挑选出抗PE-CAM -1 ( + )的细胞继续培养，研究表明这些细胞表达与人脐静脉内皮细胞类似的内皮细胞标记, 将其注入SCID鼠体内，这些细胞可形成微静脉样结构，并发现其中有小鼠血细胞的存在。

内皮细胞可形成血管的内部“衬里”，是毛细血管的主要组成部分。

基于ES细胞演变为内皮细胞的基因控制机制研究进展，可能会找出新的研究遗传性血管疾病的方法。

2.7胰岛细胞Lumelsky等[20]诱导鼠ES细胞向胰岛素细胞分化，诱导后细胞除了能分泌胰岛素外还能分泌其它的一些内分泌激素；然后将其注入患有糖尿病的模型鼠内，在血糖刺激下可分泌低剂量的胰岛素，且可大大延长模型鼠的生存时间并维持其体重。

Segev等[21]改进了Lumelsky等的实验方法，诱导人ES细胞(H9.2)分化为胰岛素分泌细胞，虽然这些诱导后细胞能够分泌微量的胰岛素，但RT-PCR数据和免疫组织化学检测发现分化细胞与不成熟胰腺细胞的特征相似。

2.8其它分化细胞除上述分化细胞外，ES细胞还可以诱导成生殖细胞、角膜缘干细胞、上皮细胞、色素细胞、黑素细胞、脂肪细胞、淋巴细胞和成纤维细胞等，国内外都曾有过报道。

3应用前景和相关问题3.1应用前景胚胎干细胞最诱人的前景和用途是生产细胞和组织，用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。