胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景

胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景

作者：王士珍李雪甫陈培

来源：《科技视界》2012年第23期

【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。

【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化

ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。

1诱导ES细胞定向分化的方法

目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。

1.1化学试剂诱导法

维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白 (cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然

后复合物进入细胞核内，与染色质上的受体结合，从而调控一系列基因的表达，使细胞的表型发生转变。二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫的有机化合物，不仅能用于细胞的常规冻存，而且还是一种常用的细胞分化诱导剂，能够诱导ES细胞分化为骨骼肌细胞、心肌细胞等，其作用机制主要是影响c-myc基因表达，降低细胞的内源性聚腺苷二磷酸核苷表达水平。也有研究证明，DMSO能使细胞内储存的钙释放出来，而细胞内钙离子浓度升高在诱导细胞分化中可能起着重要作用。除了RA、DMSO外，还有β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素

K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，也能诱导ES细胞定向分化为特定类型细胞。

1.2细胞因子诱导法

ES细胞在培养过程中对许多细胞因子具有很强的依赖性。增加或撤销一种或几种细胞因子可影响ES细胞的增殖或分化。目前研究最深入的细胞因子主要有骨形成蛋白(BMPs)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。Li等[4]实验证实：BMP-4诱导猴ES细胞分化产生的造血前体细胞集落的数目比未添加的对照组升高了17倍。FGF-2诱导的信号转导为正常细胞生长发育所必需的，参与骨骼形成、血管再生、胚胎发育等生理过程。有实验证明FGF-2处理ES细胞后，致使核内2种转录因子（Nkx2.5、d-Hand）表达增强，促进ES细胞向心肌细胞分化。

1.3转基因方法诱导ES细胞分化

细胞因子法的优点是操作简便，但其诱导产生的目的细胞数量太少，并且纯度不高。而转基因法可以弥补细胞因子法的不足，其原理是使某个促分化基因在ES细胞中过度表达，从而调控ES细胞的分化。应用此方法之前，首先要确定决定该细胞向不同方向分化的关键基因，其次还要确保在正确的时间将此基因插入到ES细胞基因组正确序列上。Prelle等[5]发现胰岛素生长因子II（insulin growth factor II , IGF II）促进小鼠ES细胞向骨骼肌细胞分化时，超表达IGF II基因的ES细胞与未超表达IGF II基因的ES细胞相比，前者在早期阶段有高水平的骨骼肌特异基因表达（myf5、myoD、myogenin）。目前许多研究都已证明此方法可使ES细胞定向分化为胰腺细胞、神经细胞、肌细胞等。

1.4共培养诱导法

近年来，越来越多的实验研究认为共培养诱导法在ES细胞向各种目的细胞分化过程中具有十分重要的作用。应用与目的细胞共培养诱导ES细胞向肝细胞、脂肪细胞等成功分化的报道屡见不鲜。Mummery等[6]将ES细胞和小鼠内胚层样细胞（END-2）共培养10天，共培养的ES细胞出现节律性收缩，并且还表达了一些心肌细胞特异性蛋白。此实验说明，小鼠内胚层样细胞可能为ES细胞向心肌细胞分化提供了特定的生长因子或微环境，从而促进了ES细胞向目的细胞的分化。

2诱导分化后的细胞类型

2.1心肌细胞

在特定条件下，ES细胞可定向分化为具有节律性收缩的心肌细胞。这就为研究心脏基因表达和功能提供了较好的体外模型。王治等[7]发现神经调节蛋白1诱导心肌细胞分化率显著高于自发心肌分化率，并且神经调节蛋白1呈剂量依赖性上调GATA-4、Nkx2.5mRNA表达。李卫东[8]等的研究结果显示，心肌细胞可诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞定向分化，诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现，并表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、β-actin。

2.2神经细胞

ES细胞分化成神经细胞是一个漫长复杂的过程，涉及不同基因在时空的顺序表达，不同的细胞内外信号相结合诱导了神经细胞的分化成熟。在ES细胞向神经细胞的诱导分化中，RA 担当了重要角色[9,10]。Dinsmore等[11]发现RA对诱导ES细胞分化为神经细胞有很高的效率。不论体内还是体外，RA单独作用可诱导ES细胞分化为神经细胞, 经RA诱导得到的神经细胞移植入吡啶-2，3-二羧酸损伤纹状体的大鼠(一种亨廷顿病的大鼠模型)后使得这些大鼠能够生存到6周。Zhang等[12]将人ES细胞进行悬浮培养以获得拟胚体, 改用神经细胞培养液培养, 然后分离出一部分分化的拟胚体, 在含有bFGF-2的培养液中继续培养, 最终有96%的细胞表达神经元标志。在国内，胡智兴(2011)、王治（2009)、韦多（2008）、鲍柳君(1998)、申景领(2007)等都有过关于从ES细胞中成功诱导为神经细胞的报道。

2.3造血细胞

ES细胞向造血细胞分化的研究开始于20世纪80年代。研究发现ES细胞具有广泛分化为造血细胞的潜能，在适当的条件下可向各种造血细胞分化，例如巨核系、粒单系、红系、肥大细胞以及淋巴细胞等。Palacios等[13]将ES细胞置于含IL-3、IL-6和RPO.10的饲养层上培养，并加入培养FLS4.1胎肝饲养层细胞系的上清液，培养5-7 天后，用此诱导后细胞注入已受致死量照射的受体小鼠，15-20天后检测发现，此诱导后细胞能恢复受体鼠红系、髓系和淋巴的造血功能。Kaufman等[14]于2011年利用人ES细胞与一种小鼠造血基质细胞共培养的方法, 成功诱导分化出造血祖细胞。

2.4肝细胞

Chinzei等[15]研究发现：用去除白血病抑制因子的培养液对ES细胞进行悬浮培养，结果在形成的拟胚体中发现了2种肝细胞特异性蛋白（甲胎蛋白和白蛋白），证实ES细胞能在体外分化为肝细胞。Shirahashi等[16]改进了体外ES细胞分化为肝细胞的培养条件。他们尝试了多种培养基、生长因子以及诱导因子的组合, 最后发现用DMEM加上20％的胎牛血清, 以及人胰岛素、地塞米松和1型胶原最有利于小鼠ES细胞分化为肝细胞。小鼠ES细胞用上述培养液处理后, 前白蛋白基因表达量为20%, 白蛋白合成率为7%。后续研究还表明，和小鼠肝内表达情况类似，此培养条件对人ES细胞亦有同样的诱导效果。

2.5成骨细胞