第二讲_cDNA芯片与基因表达分析
生物芯片针对基因表达的研究
生物芯片针对基因表达的研究生物芯片是一种先进的生物科技应用，通过在芯片上放置不同种类的生物分子，能够快速准确地检测并分析生物样品中的分子水平。
其中，基因芯片是一种广泛应用的生物芯片，可帮助研究者快速分析基因表达水平。
本文将针对生物芯片在基因表达研究中的应用进行深入探讨。
一、生物芯片的基本原理生物芯片是一块微小的平面化材料，可以在其表面上固定不同种类的生物分子，如DNA、RNA、蛋白质等。
通过对样本中的这些生物分子进行杂交反应，可以精确地检测其表达水平，从而了解诸如基因表达、蛋白质相互作用等生物过程的细节。
具体流程如下：首先，在生物芯片上固定待检测的生物分子，例如基因探针。
然后，样本中的生物分子与生物芯片上固定的生物分子进行杂交反应，形成互补配对的分子复合物。
最后，利用染色体或荧光等技术对形成复合物的生物分子进行检测和分析，并通过计算机分析对其水平进行定量和比较。
二、生物芯片在基因表达研究中的应用基因表达分析是生命科学研究的关键性技术之一，可以帮助研究者了解细胞基因表达的变化和调控机制。
在过去，基因表达分析主要依赖于核酸杂交技术、PCR扩增等方法。
通过这些方法，可以检测基因表达的总量，但是无法提供足够的详细信息。
而生物芯片既能快速地、高通量地检测不同基因的表达情况，同时也可以提供基因表达的详细信息。
1. 样品预处理生物芯片在样品预处理中有许多优势。
首先，基于样品的预处理和反应可以减少样品处理中可能引入的偏差。
将样品纯化和标记化可以降低其中多种实验因素所产生的影响。
其次，芯片技术将实现高效的多个反应放置在同一芯片上，缩小整个实验过程的需要，提高检测的准确性。
因此，基于样品预处理的方式是生物芯片在基因研究中最重要的应用之一。
2. 基因表达定量生物芯片的最大优势是可以同时检测高达数万个基因的表达水平。
通过计算机处理可以获得全基因组范围内的基因表达信息，从而揭示基因调控的机制、表达的模式以及在某些疾病中基因表达的差异。
芯片技术及其在基因表达分析中的应用
芯片技术及其在基因表达分析中的应用随着科技的不断进步和社会的不断发展，芯片技术在科学研究中的应用越来越广泛，特别是在生命科学领域中的应用，如基因组学、转录组学、蛋白质组学等。
芯片技术是利用微电子技术在芯片上制造微小反应室和探测器件，用于分析、检测、诊断等。
基因表达分析是基因组学的一个重要分支，它是研究基因在不同生物体、不同组织、不同环境条件下的表达状况及其调控机制的一种技术手段。
基因表达谱的研究可以发现生物的一些基本生理过程、细胞分化的分子机理和相关疾病发生的基因底层机制。
芯片技术在基因表达分析中的应用，可以实现同时检测成千上万个基因的表达情况，明确细胞中基因的表达谱，大幅提高了基因表达研究的效率和精度。
目前，芯片技术在基因表达分析中主要有两种类型：基因芯片和基因组芯片。
基因芯片是一种利用DNA探针检测基因表达水平的芯片技术。
该技术依赖于基因与蛋白质之间的相互作用，蛋白质可以识别并结合于特定序列的DNA，这个相互作用可用于芯片中的探针结合和检测。
基因芯片根据其所检测的基因数目，分为cDNA芯片和oligo芯片两种类型。
cDNA芯片是通过对样品中的mRNA反转录合成cDNA探针，然后用探针与芯片上的基因组DNA进行杂交反应的方式进行基因检测。
而oligo芯片是通过化学合成oligonucleotides作为DNA探针，用探针与芯片上的基因组DNA 进行杂交反应的方式进行基因检测。
基因芯片技术的高通量性和高度自动化优势，使得对大量基因的表达水平同时进行监测成为可能。
基因组芯片则是一种利用对全局基因组水平几乎全部基因进行检测的芯片。
基因组芯片一般采集DNA质控、SNPs筛查、定量PCR验证、克隆DNA库构建和群体遗传结构分析等方面的应用。
细菌材料的芯片早已投入使用，几百个细菌可以在一张芯片上诊断出来。
植物基因组芯片则是，芯片上覆盖了全基因组，几千到数万个拷贝的基因，可以显著快速的筛查基因组中惰性模块和稀释基因等部分。
生物芯片数据分析简介
一、基因芯片与基因表达 二、基因表达谱统计与分类分析 三、Ontology与基因功能注释 四、基于芯片数据的pathway分析
一、基因芯片与基因表达
什么是生物芯片？
一块指甲大小（1cm3 ）的有多聚赖氨酸包被的硅片或其 它固体支持物（如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维 素膜、尼龙膜等 ）。 生物芯片通过微加工和微流体系 统将生化分析中的样品制备、生 化反应、及结果检测有机地结合 集成在一起 。 具有高速度、分析自动化、及高 度并行处理能力 。
Subcellular components where a gene-product is found. Encompasses subcellular structures, locations, and macromolecular complexes
GO example
(Browser at /cgi-bin/go.cgi)
cDNA microarray
microRNA Chip
Biological question
Experimental design Microarray experiment
Image analysis
Normalization
Estimation
Testing
Clustering
Discrimination
13,601 Genes
Signal Transduction Ligand Binding or Carrier Motor Protein
GO Analysis—目标基因群显著性、靶向性基因功能分析。 Go Analysis对目标基因（差异基因等）进行GO分类，而后 对GO进行基于离散分布的显著性分析、误判率分析、富集度 分析，得出与实验目的有显著联系的、低误判率的、靶向性 的基因功能分类，该分类即导致样本性状差异的最重要的功 能差别，其所属基因是进一步验证的重要目标基因。 数据要求：标有上调和下调比值的差异基因列表。
检测cDNA芯片中差异表达基因的非转换方法
量 与观测值 之间 比例关系 。 ￣ ＮＯ ） ｋ （， 代表样 品 ｉ － 的
背景的随机误 ； ｋ （， ） 比例 因子 随机误 。 ｒ－ ０ ｋ Ｎ 代表 Ｉ 非转 换检 测方法 在模 型（ ） ， ． ２ Ｉ 中 ｍ 反映 基 因表 达水平 ， 以检测基 因表达水平 的差 异 ， 将用 模型 中其他 项均为“ 噪音 ”从模 型（ ） 以推导 出以下方程 ： ， １可
关键词 ： 、 医科学基础 学科 ； Ｎ 畜牧 兽 ｃ Ａ芯片； Ｄ 对数转换 ； 非转换 方法； 准化 标
中图分类号 ：８３１ ￥１。 文献标识码： Ａ 文章编号： ５ — ０ ３２０ ）３ ０ ０ — ４ ０ ８ ７ ３ （０ ６１ — ０２ ０ ２
ｅＮ Ｄ Ａ芯片技术 已经 广泛 应用于生物学 与 医学研
维普资讯
匪圃
・ ｅ ｔ ｄ ｒｄｇ Ｇｎｉ ａ ｅ ｉ ｅ ｓｎ Ｂ ｅｎ ｃ
２６ ４ ０ 年第 ２ １ ０ 卷第３ 期
检测 ｃ Ｎ Ｄ Ａ芯片中差异表达基 因的非转换方法
张 纪 刚 ， 宗俊 ， 殷 张 勤
（ 农业部畜禽遗传育种重点开放 实验 室， 业生物技术 国家重 点实验 室， 农 北京 １０９ ） ０ ０４
片试验 中的荧光信号包含 了许 多“ 噪音 ｎｉ ｓ”】 ｏ ｅ）［ ｓ １ 。为
了检测不 同细胞和组织 中发生表达变化的基 因，必须
将这些 “ 噪音 ” 以剔除 。 予 目前 ， 常用 的数据转换方法是
对数 ￣ （ ｇ ｒｔ ） ｔ １ —ａｏ 转换闭 在数据转换 之后 ， ｏ ｉ ， 通过标准化
Ｅ ＝Ｏ ｆ ；（ ｔｌ ， ｅ ； ｉＥ ＋ ｍｉ （ ２ ）
其 中 ， （ ｉ和 在模 型 只与样 品 ｉ Ｅｅ Ｉ ｎ） ＇ 有关 ， 因此 可 以将 这两项 合并成 一个 因子 ｂ。由此方程 （ ） 以表示 如 ２可
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现1.表达谱芯片及其应用表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核昔酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片，待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA,并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。
用于硏究基因表达的芯片可以有两种：①cDNA芯片；② 寡核昔酸芯片。
cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核昔酸芯片采用双色荧光系统：U前常用Cy3—dUTP （绿色）标记对照组mRNA, Cy5—dUTP （红色）标记样品组mRNAUl。
用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计•算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值（ratio值），同时计算机还给出直观的显色图。
在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况⑵。
基因芯片因具有高效率，高通量、高精度以及能平行对照研究等特点，被迅速应用于动、植物和人类基因的研究领域，如病原微生物毒力相关基因的。
基因表达谱可直接检测mRNA的种类及丰度，可以同时分析上万个基因的表达变化，来揭示基因之间表达变化的相互关系。
表达谱芯片可用于研究：①同一个体在同一时间里，不同基因的表达差异。
芯片上固定的已知序列的cDNA或寡聚核昔酸最多可以达到30 000多个序列，与人类全基因组基因数相当，所以基因芯片一次反应儿乎就能够分析整个人的基因⑶。
②同一个体在不同时间里，相同基因的表达差异。
③不同个体的相同基因表达上的差异。
采用cDNA芯片对人胃腺癌凋亡相关基因表达谱的研究
ａ ｓ ｇ ａ ｓ ｔ ｉ ｒ ｃ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ）ｄ ｅ ｖ ｅ ｌ ｏ ｐ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ｐ ｏｇ ｒ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ． Ｉ ｔ ｉ ｓ ｎ ｅ ｃ ｅ ｓ ｓ ａ ｒ ｙ ｔ ｏ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ａ ｐ ｏ ｐ ｔ ｏ ｓ ｉ ｓ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ ｇ ａ ｓ ｔ ｉ ｒ ｃ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ 、 Ａｉ ｍｓ ：
Ｃ ｏ ｒ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｇ ａ ｕ ｔ ｈ ｏ ｒ ： Ｇ Ａ Ｏ Ｈ ｅ ｎ ｇ ｊ ｕ ｎ ， Ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｉ ｒ ｎ ｇ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｏ ｒ Ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｉ ｐ ａ ｔ Ｓ ｈ ａ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ ， Ｅ ｍ ａ ｉ ｌ ：
维普资讯
・
４ ５ ６・
Ｃｈ ｉ ｎ Ｊ Ｇａ ｓ ｔ ｒ ｏ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｌ ， ２ ０ ｏ ７ ．Ｖｏ １ ． １ ２ ． Ｎｏ ． ８
采用 ｃ Ｄ Ｎ Ａ芯片对 人 胃腺癌凋 亡 相关基 因表达谱 的研 究
汤 晓怀 王 亚 东 钱 南萍 侯俊 民 朱 家沂 胡 莺ｚ 胡远 皆 ２ 郜 恒骏 ｚ
Ｔ ｏ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｐ ｏｆ ｒ ｉ ｌ ｅ ｓ ｏ ｆ ａ ｐ ｏ ｐ ｔ ｏ ｓ ｉ ｓ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ ｇ ａ ｓ ｔ ｉｃ ｒ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ．Ｍｅ ￣ｏ ｄ ｓ ： ｃ Ｄ ＮＡ ｍｉ ｃ ｏａ ｒ ｒａ ｙ ｒ ｅ ｌ ｅ ｖ ａ ｎ ｔ ｔ ｏ ｈ ｕ ｍａ ｎ ａ ｐ ｏ ｐ ｔ ｏ ｓ ｉ ｓ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｉ ｎ ｖ ｅ ｓ ｔ ｉ ｇ ａ ｔ ｅ ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｐ ｏｆ ｒ ｉ ｌ ｅ ｓ ｏ ｆ ｇ ａ ｓ ｔ ｉ ｒ ｃ ａ ｄ ｅ ｎ ｏ ｃ ａ ｒ ｃ ｉ ｎ ｏ ｍａ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｏｕ ｒ ｓ ｔ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ ． Ｉ ＧＦ Ｂ Ｐ ４ ｇ ｅ ｎ ｅ ｗａ ｓ ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｔ ｏ ｖ ａ ｌ ｉ ｄ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｔ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｂ ｙ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｉｎ ｒ ｇ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｏ ｆ
cDNA测序和表达谱研究课件
参考文献
总结词
介绍了cDNA测序的基本原理和技术方法。
详细描述
相关的技术方法和应用 领域。
总结词
综述了cDNA测序在基因表达谱研究中的应用。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
06 结果和讨论
实验结果展示和分析
展示内容
展示cdna测序和表达谱研究的主要实验结果，包括基因表达谱、差异表达基因分析、功能注释等。
分析方法
采用生物信息学方法对展示结果进行分析，包括聚类分析、主成分分析、差异表达基因的统计和可视 化等。
结果解释和讨论
结果解释
对实验结果进行详细解释，包括基因表达谱的特征、差异表达基因的功能和调控机制等。
04 cDNA测序在表达谱研究 中的应用
基因表达的检测和定量
基因表达的检测
cDNA测序技术能够检测到基因转录 本的序列信息，从而确定哪些基因在 特定条件下表达。
基因表达的定量
通过比较不同条件下的测序数据，可 以对基因表达水平进行定量分析，了 解基因表达的差异和变化。
基因差异表达分析
差异表达基因的筛选
cdna测序和表达谱研究课件
目 录Leabharlann • 引言 • cDNA测序技术概述 • 表达谱研究概述 • cDNA测序在表达谱研究中的应用 • 实验设计和实施 • 结果和讨论 • 参考文献
01 引言
研究背景和意义
基因表达谱研究是理解生物体复杂生 命过程的关键，对于疾病诊断、药物 研发和生物进化等领域具有重要意义 。
cDNA测序的基本原理是利用合成互补DNA（cDNA）的引物， 通过PCR扩增获得大量cDNA序列，然后对这些序列进行测序， 从而了解基因的表达情况。
第二讲 cDNA芯片与基因表达分析
收缩各类的均值
x ik x i mk ( si s0 )d ik
' x x i mk ( si s 0 )d ik
' d ik sign(d ik )( d ik )
' ik
LOGO
判断新样本类别
(x x )2 k (x* ) 2 log k 2 i 1 ( s i s 0 )
c(A) 为M vs A的拟合函数 标化后的数据
LOGO
(3) 点样针依赖的标化(Within-print-tip-group
normalization) 为什么 一张芯片的不同区域运用不同的点样针点样，从 而引入点样针带来的系统误差。
method
LOGO
(4) 尺度调整(Scale adjustment)
LOGO
(一) 多重假设检验问题
Ⅰ型错误（假阳性）即在假设检验作推断结论时，拒绝了 实际上正确的检验假设，即将无差异表达的基因判断为差 异表达。 Ⅱ型错误（假阴性）即不拒绝实际上不正确的，即将有差 异表达的基因判断为无差异表达。 在进行差异基因挑选时，整个差异基因筛选过程需要做成 千上万次假设检验，导致假阳性率的累积增大。对于这种 多重假设检验带来的放大的假阳性率，需要进行纠正。常 用的纠正策略有Bonferroni效正，控制FDR（False
基本思想 每类样本的质心向所 有样本的质心进行收 缩，即收缩每个基因 的类均值，收缩的数 量由值决定。当收缩 过程发生时，某些基 因在不同类中将会有 相同的类均值，这些 基因就不具有类间的 区别效能。
基因1 基因2
LOGO
分析步骤 计算统计量 对公式经过变换得到
LOGO
基因芯片和基因表达谱分析
基因芯片和基因表达谱分析在人类基因测序技术不断发展的背景下，基因芯片和基因表达谱成为了研究生物学和医学领域的重要工具。
本文将重点探讨基因芯片和基因表达谱分析的原理、应用以及未来发展方向。
一、基因芯片基因芯片（Gene chip）又称为微阵列芯片（microarray）是一种将数万个DNA序列可控地捕捉在一个硅片上的生物技术产品。
其原理基于同位素标签法和荧光标记法，用来研究生物大分子（包括DNA、RNA和蛋白质）在细胞周期、转录和翻译等生物活动过程中的表达差异和变化规律。
基因芯片的操作过程分为如下几步：1. DNA序列打印和固定。
通过免疫印刷技术，将已知的DNA序列按照一定的规则打印到芯片上，并使用化学方法将其固定在芯片上，作为反应体系中的探针。
2. 样品准备和反应。
将待测样品中的RNA提取、反转录成cDNA，再将其标记为荧光分子，加入到含有探针的芯片反应体系中。
其中，标记为红色和绿色的荧光分子分别代表着样品RNA在两种不同条件下的表达水平。
3. 芯片扫描和数据统计。
将芯片送入扫描仪中扫描，获得荧光信号强度。
通过芯片上探针的位置、荧光信号的强度以及探针序列的注释信息等，对数据进行分析和解读，得到各种基因的表达信息。
基因芯片在各个领域有着广泛的应用。
在医学领域，它可以用于疾病诊断、治疗效果预测、药物靶点筛选等方面的研究。
在生物学研究中，它可以分析基因调控、遗传变异和发育过程等生物学领域的课题。
二、基因表达谱分析基因表达谱分析是以生物体内mRNA的转录活性水平为信号，分析在不同条件下各种基因的表达水平差异。
常见的基因表达谱分析方法有RT-qPCR、Northern blot、Western blot、RNA-seq等。
其中，RT-qPCR方法是一种基于荧光信号检测的技术，可以非常精确地检测出RNA的拷贝数。
其操作过程分为三步：反转录、定量PCR和数据分析。
反转录过程中，RNA被逆转录酶逆转录成DNA。
基因表达数据分析
第8章基因表达数据分析基因芯片或DNA微阵列等高通量检测技术的发展，可以从全基因组水平定量或定性检测基因转录产物mRNA，获取基因表达的信息。
由于生物体中的细胞种类繁多，同时基因表达具有时空特异性，因此，基因表达数据要比基因组数据更为复杂、数据量更大、数据的增长速度更快。
基因表达数据中蕴含着基因调控的规律，可以反映细胞当前的生理状态，例如（？？）是否恶化、（？？）是否对药物有效等。
对基因表达数据的分析是生物信息学的重大挑战之一，也是DNA微阵列能够推广应用的关键环节之一。
基因表达数据分析的对象是在不同条件下，全部或部分基因的表达数据所构成的数据矩阵。
通过对数据矩阵的分析，回答一些生物学问题，例如，基因的功能是什么？在不同条件或不同细胞类型中，哪些基因的表达存在差异？在特定的条件下，哪些基因的表达发生了显著改变，这些基因受到哪些基因的调节，或者调控哪些其它的基因？哪些基因的表达是条件特异性的，根据它们的行为可以判断细胞的状态（正常或癌变）？？？？等等。
对这些问题的回答，结合其他生物学知识和数据有助于阐明基因的调控路径和基因之间的调控网络。
揭示基因调控路径和网络是生物学和生物信息学共同关注的目标，是系统生物学(Systems Biology，在附录中增加解释条目！)研究的核心内容。
目前，对基因表达数据的分析主要是在三个逐渐复杂的层次上进行：1、分析单个基因的表达水平，根据在不同实验条件下，该基因表达水平的变化，来判断它的功能，例如可以确定肿瘤类型特异基因。
采用的分析方法可以是统计学中的假设检验等。
2、考虑基因组合，将基因分组，研究基因的共同功能、相互作用以及协同调控等。
多采用聚类分析等方法。
3、尝试推断潜在的基因调控网络，从机理上解释观察到的基因表达谱。
多采用反工程的方法。
本章首先介绍基因表达数据的来源和预处理方法；然后介绍基因表达数据分析的主要方法，即表达差异分析和聚类分析；最后简单介绍从基因表达数据出发研究基因调控网络的一些经典模型。
组织芯片 cdna芯片
组织芯片 cdna芯片组织芯片（cDNA芯片）是一种用于研究基因表达的技术工具。
cDNA（亦称为复制DNA）是由反转录过程中合成的DNA分子，其序列和信使RNA（mRNA）相对应。
cDNA芯片则是将这些cDNA分子固定在基质上，用于检测和量化不同基因在特定条件下的表达水平。
cDNA芯片的制备过程包括样品处理、RNA提取、反转录和标记、芯片制备、杂交和信号检测等步骤。
首先，需要提取待研究的组织或细胞中的总RNA。
然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，其中可以选择使用特定的引物来合成cDNA，以检测特定基因的表达。
接下来，通过标记技术，将反转录合成的cDNA标记上荧光染料，以便在芯片上进行检测。
随后，将标记后的cDNA分子均匀地固定在芯片上，形成cDNA芯片。
最后，将待测样品和芯片进行杂交，通过检测芯片上荧光信号的强度和位置来确定基因的表达水平。
cDNA芯片的主要应用领域是基因表达谱研究。
通过比较不同组织、不同生理状态或不同疾病条件下的基因表达谱，可以揭示基因在生物体内的功能和调控机制。
同时，cDNA芯片也可以用于筛选和鉴定新的基因，并研究基因在发育、分化和疾病中的作用。
此外，cDNA芯片还可用于药物研发和个体化医学等领域。
cDNA芯片相比于传统的杂交技术具有许多优势。
首先，cDNA芯片可以同时检测和量化成千上万个基因的表达水平，大大提高了研究效率。
其次，cDNA芯片具有较高的灵敏度和特异性，可以检测到低丰度的基因表达变化。
此外，cDNA芯片还具有高通量、高重复性和可靠性的特点，可以进行大规模的高通量筛选和分析。
最后，cDNA芯片的数据分析方法和数据库资源也相对成熟，有助于研究人员进行数据解读和功能注释。
然而，cDNA芯片也存在一些局限性。
首先，由于基因组复杂性和多样性，cDNA芯片上不能覆盖所有基因的表达情况。
其次，由于芯片制备过程中的技术限制和设计限制，cDNA芯片的信号动态范围相对较窄。
此外，cDNA芯片的结果需要经过严格的数据分析和验证，才能得出可靠的结论。
第二讲 基因表达数据分析
（一）基因芯片数据
cDNA微阵列芯片荧光信号
➢ 定性信息提取：P/A/M（Present/Absent/Marginal） ➢ 定量信息提取：基于探针集汇总后的基因水平的荧光信号强度值
数据转换
对数转换前
对数转换后
对芯片数据做对数化转换后，数据可近似正态分布 。
数据过滤
➢ 数据过滤的目的是去除表达水平是负值或很小的数据或者明显的噪声数据。 ▪ 过闪耀现象 ▪ 物理因素导致的信号污染 ▪ 杂交效能低 ▪ 点样问题 ▪ 其他
常用基因表达数据库
常用基因表达数据库名称
数据库内容
Gene Expression Omnibus （GEO）目前最常用的基因表达数据（NCBI）
Expression Atlas SMD RNA-Seq Atlas GEPdb GXD EMAGE AGEMAP
欧洲生物信息学中心的基因表达数据库 Stanford基因表达数据库 正常组织的基因表达谱数据 基因型、表型和基因表达关系 老鼠发育基因表达信息 老鼠胚胎的时空表达信息 老鼠老化的基因表达数据
由于RNA-seq是基于reads量化获得的基因表达水平，因此差异表达基因的分析 方法是基于泊松或负二项分布的离散型分布。常用的R分析软件包有DESeq、 DESeq2、edgeR和baySeq等。筛选出来的差异表达基因可以进一步作基因的 功能分析，如GO（Gene Ontology）或KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。
签署协议，发邮件后等半 天~1天就会收到SEER发 过来的用户名和密码。
SEER 数据库 SEERStat软件
双击SEERstat图标
链接下载的数据库
cDNA基因芯片技术分析三聚氰胺肾毒性的相关基因表达
成年 ｓ Ｄ大 鼠 ，（０ ４ ）ｇ 雄性 ， 自北 京大 学医 学部 实验 动物 中心 ．实 验 时将 Ｓ ２０－ － ５ ， 购 Ｄ大 鼠 随机分
为３ ， 组 每组 ６ 只． 第一组每天灌 胃三聚氰胺 １５ｍ ／ ｇ 第二组每天灌 胃５ｍ ／ ｇ 第三组为对照组 ， ２ ｇｋ ， ｇｋ ， 每 天灌 胃生 理盐水 ．喂养 １ 个月后 ，处死 ， 取其 左 肾 ， 迅速 液氮冻存 ．
摘要
利用基 因芯片技术筛查不 同剂量的三聚氰胺干预大 鼠肾脏的差异表达 基因 ， 并对筛 查的差异 基因进
行生物信息学分析 ， 推测三聚氰胺 肾毒性 的分子作 用机制．结果表 明，高剂量三聚氰胺干预的大鼠肾脏差异 表达基 因数多于低剂量干预 的肾脏差异表达基 因 ， 并且 涉及到更多重要 的分子功 能和代谢途径 ，表 明三 聚 氰胺 。 肾毒性具有剂量依赖性 ， 比低剂量而言 ， 相 高剂量三聚氰胺干预对 肾脏的危 害更为严重． 关键词 三聚氰胺 ；基因芯 片；肾毒性 ；肾结石
时 美 ，范 雪梅 ，李 雪 王 铮 ， ，王 义 明 ，罗 国安 ，
（ ．华 东 理 工 大 学 药 学 院 ， 海 ２０ ３ ； ．清 华 大 学 中药 现 代化 研 究 中心 ， 京 １０ ８ ； １ 上 ０２７ ２ 北 ００ ４ ３ ．南 开 大 学 药 学 院 ， 津 ３ ０７ ） 天 ０ ０ １
提取 的总 Ｒ Ａ用 Ｎ ｃ ｏ ｐｎＲ Ａ ｃ ａ —ｐ纯 化试剂 盒纯 化 ， Ｎ ｕ ｌ Ｓ ｉ Ｎ ｌ ｎｕ ｅ ｅ 用分光 光度 计测 其浓 度 ， 甲醛变 性凝胶 电 泳检 测其 纯度 ．
cdna芯片
cdna芯片CDNA芯片是一种常用于基因表达分析的生物芯片技术。
CDNA芯片利用反转录酶将mRNA转录成cDNA，再将其标记并杂交到芯片上的探针上，通过探针与标记的cDNA的杂交程度来测定基因的表达水平。
以下是关于CDNA芯片的一篇1000字的详细介绍：CDNA芯片是一种常用于基因表达分析的生物芯片技术，其原理是将mRNA转录成cDNA，并通过探针与标记的cDNA 进行杂交，从而评估基因的表达水平。
这种技术在基因研究、疾病诊断和药物开发中都具有重要的应用价值。
CDNA芯片制备的首要任务是获取组织或细胞的总RNA，然后利用反转录酶将其转录成cDNA。
通常，反转录酶首先合成一条cDNA链，然后通过DNA聚合酶合成第二条链，形成双链cDNA。
这一步骤包括了寡聚体引物、反转录酶、dNTPs和缓冲液的反应，反应温度一般为42°C。
接下来，将cDNA标记并纯化，以便后续的杂交分析。
在标记反应前，需要通过PCR或其他方法增加cDNA浓度，以提高标记效率。
标记反应通常使用具有光反应性的杂交标记物，如生物素、荧光染料等。
标记反应采用文库建立的PCR产物为模板，引物序列包含有荧光染料、生物素或核酸情况下可以与特定的PCR产物结合的带有打靶位点的荧光染料标签。
标记的cDNA往往需要通过纯化来去除非特异性杂交物质。
纯化过程中可以使用各种方法，如离心柱、酸性酚/氯仿提取和凝胶纯化等。
纯化后的标记cDNA通常进行定量测定，以保证后续的杂交反应的有效性。
制备好的标记cDNA可以与芯片上的探针进行杂交，以评估基因的表达水平。
芯片上的探针可以是具有已知序列的cDNA、荧光引物或其他与基因相关的序列。
杂交反应一般在高温下进行，以保证探针与标记cDNA的特异性结合。
杂交后，芯片上的探针与标记的cDNA之间的结合程度可以通过检测标记物的荧光强度来评估。
荧光信号的强弱可以反映基因的表达水平。
CDNA芯片的分析结果可以通过图像处理软件进行分析和解释。
基因表达谱分析技术
基因表达谱分析技术1、微阵列技术( microarray) 这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA 序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。
其原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术,在固相表面合成成千上万个寡核苷酸探针”(cDNA、ESTs或基因特异的寡核苷酸)，并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA 或mRNA 反转录生成的第一链cDNA 进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。
其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。
包括cDNA芯片(cDNA microarray)和DNA 芯片( DNA chips)。
cDNA 芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。
当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cmxi8cm的膜上。
尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA 片段。
要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。
杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。
杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。
如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。
杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。
洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA 的点受到激发后会发出荧光。
通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。
对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。
一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。
使用尼龙膜为载体制作cDNA 芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。
基因表达分析技术
28S
2604
3kb
18S
623
0.4 kb
RNA琼脂糖凝胶电泳 Northern blot hybridization
分子杂交实验
放 射 自 显 影 照 片
目录
2．核糖核酸酶保护实验
ribonuclease protection assay,RPA
➢ 是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法
酶联免疫吸附分析
特点：
1、具有特异性； 2、灵敏度很高； 3、稳定、操作简便,标本用量少,适于大规模筛查,
尤 其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原； 4、既可以做定性试验也可以做定量分析.
三免疫组化实验对组织/细胞 表达的蛋白质进行原位检测
免 疫 组 织 化 学 immunohistochemistry 是 利 用 标 记 的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应,在组织或 细胞原位检测特定抗原即目标蛋白质的方法,简称为免 疫组化实验.近年来由于荧光标记抗体的广泛应用,这两 种方法又被统称为免疫荧光法.
3、原位PCR技术
原位ＰＣＲ
原位聚合酶链式反应In Still PCR,Is－PCR是 由Haase等于1990年首创.它是利用完整的细胞作为 一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在 不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来 检测细胞内的扩增产物.
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细
目录
非特异性的嵌入荧光染料评价
• 优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物
• 缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的,它可以和所有的双链DNA包括引物和非 特异性扩增产物结合,不能真实反映目 的基 因的扩增情况.
TaqMan探针 评价
基因芯片和高通量测序技术在医学生物学中的应用-精
因）。
3
基因芯片的原理
DNA Microarray Hybridized Array
Labeled Target Detection Reagents
4
应用原则
良好的模型(除比较因素外,其他尽量相同)，时 间点的选择
60-mer寡核苷酸序列可代表超过 41K 人类基因及转录本
实际上所有的基因都有相关公共数据库 的注解
13
The general cycle of oligo synthesis via phosphoramidite （亚磷酰胺）
chemistry. The process is repeated 60 times.
4. 背景修正Background correction: local or global
21
3) 基因芯片的其它类型
研究的对象和用途
microRNA 芯片 DNA 启动子芯片 (ChIP on chip) SNP 芯片 CGH 芯片 （比较基因组 芯片）Comparative
Genomic Hybridization :
为了提高实验的可靠性，对于同一样本，有两 次或更多次的独立重复实验
适当的统计方法来分析数据
5
2, 基因芯片的类型
•制备方法：
1. cDNA arrays (Microspotting) cDNA芯片 2. Oligonucleotide arrays (Photolithographic synthesis, Ink-
TTCCO
REPEAT
CATAT AGCTG TTCCG
cDNA名词解释
cDNA名词解释cDNA是“互补DNA”（complementary DNA）的简称。
它是一种由反转录（reverse transcription）过程合成的DNA，它是在mRNA的模板上，使用逆转录酶（reverse transcriptase）将mRNA中的信息逆转录为DNA的产物。
cDNA具有一些特殊的特点：1. 互补性：cDNA与原始mRNA相比，具有完全互补的碱基序列。
这是因为在线粒体的转录过程中，先形成了一个互补的cDNA链，然后才与引物结合形成完整的单链DNA。
2. 反转录：cDNA的合成过程是通过反转录，即将mRNA的信息转录为DNA。
在反转录过程中，mRNA的麻痹酸残基作为DNA链的合成起始点，并用逆转录酶将其转录为DNA链。
这种反转录过程是基于酵母-RNA聚合酶H +的反转录酶活性。
3. 编码转录：cDNA合成时使用的反转录酶具有一定的识别性，只能合成编码转录（coding transcript）的cDNA。
编码转录是指能够转译成蛋白质的mRNA序列，与非编码转录（non-coding transcript）相对。
通过cDNA合成，可以从总RNA中选择性地合成编码转录的cDNA。
cDNA在生物科学和生物技术领域具有广泛的应用：1. 基因克隆：cDNA的合成可以克隆并表达感兴趣的基因。
由于cDNA具有与mRNA相对应的互补性，因此cDNA库可以作为DNA库用于筛选和克隆目标基因。
2. 基因表达分析：cDNA可以用于检测和分析基因的表达水平。
通过合成cDNA，可以转录为RNA，然后使用PCR或其他技术将其扩增，用于测定基因在不同组织、不同发育阶段或不同生理状态下的表达水平。
3. 基因功能研究：cDNA可以用于研究基因的功能。
通过将特定基因的cDNA转录和过表达到细胞或生物体中，可以研究该基因在生理和病理过程中的功能和调控机制。
4. 药物研发：cDNA可以用于筛选和鉴定药物靶点。
通过合成和表达特定基因的cDNA，可以用来验证药物与该基因的相互作用，为药物研发提供目标和靶点。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
五、信息熵
LOGO
运用信息熵进行差异基因挑选时，不需要用到样本的类别 信息，所以运用信息熵找到的差异基因是指在所有条件下 表达波动比较大的基因。
H pi log pi
i 1
m
数据的聚类分析
LOGO
一、聚类目的
基于物体的相似性 将物体分成不同的 组
二、基因表达谱数据的聚类
LOGO
对基因进行聚类
缺点：
当寡核苷酸序列较短时，单一的序列不足以代表整个 基因，需要用多段序列
cDNA芯片的优缺点 cDNA芯片的优点
序列长度长，可直接检测待检mRNA 结合敏感性强 信号强度大
LOGO
cDNA芯片的缺点
探针退火温度差异大 存在非特异性交叉杂交
cDNA芯片应用领域 基因表达分析 等位基因探查 基因多态性分析
LOGO
3、染色互换实验(dye-swap experiment ) 的标化
芯片1 芯片2
实验组 cy5(R) cy3(G)
对照组 cy3(G ’) cy5(R ’)
前提假设：c︽c’ 方法:
LOGO
LOGO
log2 ( R / G)
log2 RG
M = log2R - log2G A = (log2R + log2G)/2
收缩各类的均值
x ik x i mk (si s0 )dik
' x x i mk ( s i s 0 )d ik
' dik sign(dik )( dik )
' ik
LOGO
判断新样本类别
2 ( x x ) k (x* ) 2 log k 2 i 1 ( s i s 0 ) p * i ' ik
Discovery Rate）值等。
LOGO
(二) 分析步骤
计算统计量
d x1 x2 s s0
扰动实验条件，计算扰动后的基因表达的相对差异统计量
dp
计算扰动后的平均相对差异统计量
dE 1 P
d
p
LOGO
确定差异表达基因阈值：以最小 的正值和最大的负值作为统计阈 值，运用该阈值，统计在值中超 过该阈值的假阳性基因个数，估 计假阳性发现率FDR值。 通过调整FDR值的大小得到差异 表达基因。
(四)双向聚类
LOGO
双向聚类就是识 别基因表达谱矩 阵中同质的子矩 阵，运用特定的 基因子类识别样 本子类。
基因芯片数据的分类分析
一、线性判别分类器
LOGO
0, L1 g ( x) w x b 0, L2
T
二、k近邻分类法
LOGO
基本思想
三、PAM分类法 （Prediction Analysis for Microarray）
寡核苷酸芯片的特点
原理：
LOGO
通过碱基互补配对原则进行杂交，检测对应片段是否 存在、存在量的多少
优点：
可以通过原位合成法制备； 探针长度小，减少二级结构形成 ； 减少非特异杂交，能有效区分有同源序列的基因； 无需扩增，防止扩增失败影响实验； 杂交温度均一，提高杂交效率
为什么 调整不同栅格(grids)间的数据离散度 方法：计算不同栅格的尺度因子
Hale Waihona Puke LOGO2、片间标化(Multiple-slide normalization)
线性标化法(Linear scaling methods) 与芯片内标化的尺度调整(Scale adjustment) 方法类似 非线性标化法(non-linear methods) 分位数标化法(Quantile normalization) 两张芯片的表达数据的分位数标化至相同，即分 布于对角线上。
LOGO
表达谱数据库 基因表达仓库
Gene Expression Omnibus，GEO
LOGO
斯坦福微阵列数据库
The Stanford Microarray Database，SMD
其他常用基因表达数据库
ArrayExpress、CGED
第二部分 cDNA表达芯片数据预处理
c(A) 为M vs A的拟合函数 标化后的数据
LOGO
(3) 点样针依赖的标化(Within-print-tip-group
normalization) 为什么 一张芯片的不同区域运用不同的点样针点样，从 而引入点样针带来的系统误差。
method
LOGO
(4) 尺度调整(Scale adjustment)
LOGO
K近邻法
选择与具有缺失值基因的k 个邻居基因 用邻居基因的加权平均估 计缺失值 参数: 邻居个数 距离函数
LOGO
回归法
数据标准化
LOGO
数据标准化的原因
存在不同来源的系统误差 1. 染料物理特性差异(热和光敏感性，半衰期等) 2. 染料连接效能 3. 点样针差异 4. 数据收集过程中扫描设施误差 5. 不同芯片差异 6. 实验条件差异
SS 总 ( xij x)
i j 2
MS组间
SS 组间 v组间
SS 组间 ni ( xi x)
i
2
MS组内
2
SS 组内 v组内
SS组内 ( xij xi )
i j
F
MS组间 MS组内
四、SAM （Significance Analysis of Microarrays)
基本思想 每类样本的质心向所 有样本的质心进行收 缩，即收缩每个基因 的类均值，收缩的数 量由值决定。当收缩 过程发生时，某些基 因在不同类中将会有 相同的类均值，这些 基因就不具有类间的 区别效能。
基因1 基因2
LOGO
分析步骤 计算统计量 对公式经过变换得到
LOGO
x ik x i d ik mk ( si s 0 )
(四)决策树的修剪
LOGO
消除决策树的过适应问题 消除训练集中的异常和噪声
所涉及的方法很多，比如先剪枝算法（print）与 后剪枝（sprint 算法）等等
五、分类效能评价
LOGO
(一)构建训练集和检验集
n倍交叉验证（n-fold cross validation） Bagging（bootstrap aggregation） 无放回随机抽样 留一法交叉验证（leave-one-out cross validation，LOOCV）
第二讲 cDNA芯片与基因表达分析
基因芯片数据提取
LOGO
Ratio (CH1I CH1B) /(CH 2I CH 2B)
对数转换
LOGO
对芯片数据做对数化转换后，数据可近似正态分布
数据过滤
LOGO
数据过滤的目的是去除表达水平是负值或 很小的数据、或者明显的噪声数据
过闪耀现象 物理因素导致的信号污染 杂交效能低 点样问题 其它
通常以2倍差异为阈值，判断基因是否差异表达
二、t检验法
LOGO
t
x1 x2 s1 / n1 s2 / n2
2 2
运用t检验法可以判断基因在两不同条 件下的表达差异是否具有显著性
三、方差分析
LOGO
方差分析可用于基因在两种或多种条件间的表达量的比较 它将基因在样本之间的总变异分解为组间变异和组内变异 两部分。 通过方差分析的假设检验判断组间变异是否存在，如果存 在则表明基因在不同条件下的表达有差异。
LOGO
LOGO
LOGO
前面提及的标准化方 法仅效正了数据分布的 中心，在不同的栅格间 log-Ratios 的方差也 不同。
LOGO
第三部分 cDNA表达芯片数据分析
第二讲 cDNA芯片与基因表达分析
差异表达分析 一、倍数法
实验条件下的表达值
LOGO
xI f xc
对照条件下的表达值
LOGO
数据补缺
(一)数据缺失类型
非随机缺失 基因表达丰度过高或过低 随机缺失 与基因表达丰度无关，数据 补缺主要针对随机缺失情况
LOGO
数据补缺方法
简单补缺法
missing values = 0 expression missing values = 1 expression (arbitrary signal) missing values = row (gene) average (median) missing values = column (array) average (median)
LOGO
施加标准化处理的基因
芯片上大部分基因(假设芯片上大部分基因在不同 条件下表达量相同) 不同条件间稳定表达的基因(如管家基因) 控制序列(spiked control ) 合成DNA序列或外源的DNA序列，在不同条件下表 达水平相同。
LOGO
cDNA芯片数据标准化处理
1、片内标化(Within-slide normalization)
LOGO
在对含非单独对象的类进行合并或分裂时，常用 的类间度量方法
LOGO
2000年Alizadeh等运 用基因芯片数据， 基于层次聚类算法 证实了DLBCL肿瘤 病人在mRNA层面 确实存在两种亚型
(二)k均值聚类 基本思想
LOGO
(三)自组织映射聚类
LOGO
基本思想：在不断 的学习过程中，输 出层的神经元根据 输入样本的特点进 行权重调整，最后 拓朴结构发生了改 变
C( x ) l
*
* * ( x ) min ( x ) l k k 当