实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定课件.doc
苯酚降解菌的分离和鉴定
目录目录 (1)摘要 (2)Abstract (3)第一章绪论 (4)1.1 苯酚降解菌的定义及分类 (4)1.2苯酚降解菌的性质及其用途 (4)1.3苯酚降解的研究现状 (5)1.4苯酚降解菌生产菌的筛选 (6)1.5本课题的研究思路及意义 (6)第二章材料与方法 (7)2.1试验材料 (7)2.2试验方法 (8)2.2.2苯酚降解菌的驯化 (8)2.2.3菌种在不同条件下的降解能力 (9)2.2.4最优菌种的鉴定 (9)3.1苯酚降解菌筛选结果及性状初步研究 (11)3.11筛选结果 (11)3.1.1.1初步筛选的结果 (11)3.1.1.2 菌种驯化中的结果 (11)3.1.2 H-1菌株的性状初步结果 (13)3.2 H-1菌株分类鉴定结果 (13)第四章结论 (14)4.1菌种的筛选结果 (14)4.2菌种的鉴定 (14)参考文献 (15)致谢.......................................................................................... 错误!未定义书签。
一株苯酚降解菌的分离和鉴定摘要为了寻找能高效降解苯酚的微生物, 从土壤中筛选得到了一株苯酚降解菌,通过逐渐增加苯酚的浓度,然后驯化出一株高效降解苯酚的细菌H-1. 当在30 ℃培养48h 时其降解率高达92.11%. 经理化特征测定及外观鉴定,将其初步鉴定为假单胞菌属.再经过对比实验测各种因素(碳源、温度、pH、通气) 对该菌生长及降解苯酚能力的影响,得知该菌能以苯酚作为唯一碳源,最适生长温度为32 ℃,最适pH 为7.0. 该菌为好氧菌,在空气充足的条件下可提高降解能力.该菌菌落较小，菌落呈微黄色。
菌体呈直或微弯的杆装，没有菌柄也没有鞘。
不产芽孢。
对该菌做生化鉴定，可知该菌革兰氏染色为阴性，可水解苯酚，生长温度为32℃，生长pH为pH 6.5～7.5。
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性研究
ｔａ ｉ ｎ ｙ Ｗ ｕ ｔＣ ｒ ｔｏ ｓ ｂ ｓ－
２ ４ 固 定 化 Ｗ ｕｔ ． ｓ Ｃ对 苯 酚 的 降解 效 果 －
通 过 比 较 采 用 ２ ５ １ 、 、 ０ ｍＬ 注 射 器 制 作 的 Ｗ ｕｔＣ固定 化 小球 （ 别 记 为 １ ２ ３ ｓ— 分 、 、 小 球 ）
８６ ４ 、 ９ ３ 、 ７． 、 １ 。 ． ５ 。 ４ ６ ４ ．７
茅醇假 单胞 菌 ） 降解 苯酚 的效 率 明显 高 于 其 他 菌
株 ， 选其 作为研 究 菌株 ， 故 其革 兰 氏染 色结 果为 阴
性。
通过 一系列 的降 解 条件 优 化 试 验 发现 ， 酚 含
经 反 复驯化 、 涂板 分离 ， 共得 到 ８株 以苯酚 为
惟 一碳 源 和能源 而高 效生 长 的菌株 。通过 比较 发 现其 中 ３号 菌 株 （ 名 为 Ｗ ｕｔ 初 步鉴 定 为香 命 ｓ Ｃ， —
降解 不 同浓度 的苯 酚 。初 始 苯 酚浓 度 越 低 ， 解 降
所需 时 间越短 。在 初始 苯酚 浓度 为 ３ ０ｍｇ Ｉ 和 ０ ／ ５ ０ｍｇ Ｌ的 试 样 中 ， 酚 完 全 降解 所 需 的 时 间 ０ ／ 苯 分别 为 ８ｈ和 １ ； 初始 苯酚浓 度 为 ｌ ０ ／ ２ｈ 在 ０ｍｇ ０ Ｌ的试样 中， 酚完 全降解 所需 的时 问为 ３ ； 苯 ２ｈ 在 初 始苯 酚浓度 为 １６ ０ｍｇ Ｌ的试样 中 ， ０ ／ 菌体 的生 长 速度和 苯 酚的 降解 速度 均 极 其缓 慢 。培 养 ４ ｈ 时 ， ｓ Ｃ 对 初 始 含 酚 浓 度 分 别 为 ３ ０ ５ ０ Ｗｕ ｔ — ０、 ０、 ８ ０ １０ ０ｍｇ Ｉ 试 样 中的 苯酚 降解 率 分 别 达 到 ０ 、 ０ ／
PPT
谢谢
主要内容
• 苯酚的性质与危害 • 苯酚降解方法 • 苯酚降解菌的筛选与鉴定
苯酚的性质与危害
• 苯酚(C6H5OH)是最简单的酚，外观为白色或无色结晶， 有特殊气味和一定的腐蚀性，显酸性，其分子量为94.11。 • 苯酚是原浆毒物，属于高毒物质。它可以通过与皮肤粘膜 的接触吸收和经口服而侵入体内，与细胞原浆质蛋白能形 成不溶物，使细胞失去活力，高浓度酚可使蛋白质凝固及 引起组织损伤、坏死；而且，酚还能继续向深部渗透，引 起深部组织损伤、坏死，直至全身中毒。
苯酚降解方法
• 物理法 • 化学法 • 生物法
苯酚降解菌的筛选与鉴定
• 苯酚降解菌的筛选：水样采集与处理、菌种的富集、菌种 分离及筛选（初筛和复筛） • 菌种的鉴定：16S rDNA 的 PCR 扩增、16S rDNA课程的学习，我对于如何检索文献尤 其是英文文献有了更全面的认识，了解到很多以 前不知道的东西，并且学会了以前检索文献所不 会的新的方法。 • 本次论文的编写，使我对苯酚的降解方法及苯酚 降解菌有了基本的了解。感谢老师及同学们对我 的帮助。
高效降酚菌的筛选与特性研究
侯蒙蒙 101610051045
背景
• 随经济的发展，石油化工、塑料、合成纤维和焦 化等工业的迅速发展，各种含酚废水也相应增多， 这是目前水体的主要污染源之一。苯酚属于高毒 性物质，直接排放到水体中会引起环境的污染， 大量动植物的死亡，而且对人类的健康构成极大 的威胁。尤其是今年12月22日中石化青岛爆炸事 件造成海水的污染，更加引起了国家以及广大人 民群众对海水排污、苯酚降解的关注，科学家致 力于研究一种生物治理苯酚的方法，在自然界中 筛选出能够降解苯酚的高效菌群，并应用于现实 生活中，减少苯酚对自然环境的污染。
苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究
上海师范大学硕士学位论文苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究姓名：何小丽申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：肖明20090501上海师范大学硕士学位论文摘要论文题目：苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究学校专业：微生物学学位申请人：何小丽指导教师：肖明摘要酚类化合物为细胞原浆毒物，属高毒性物质。
这类物质来源广泛，通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并严重威胁人类的健康。
含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解。
从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性的投加到已有的污水处理系统中的生物强化技术，能够快速提供大量具有特殊作用的微生物，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力。
1、本研究从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到10株能够利用并降解苯酚的菌株P1-P4、P7、P9-P13。
该10株苯酚降解菌能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长，经16S rDNA分子鉴定和生理生化检测，该10株降酚菌分别被鉴定到属或种。
其中降酚菌株P1、P3和P4这3株菌株分别属于劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属（Variovorax）和节杆菌属（Arthrobacter）里的种。
其它7株降酚菌株P2、P7、P9-P13都属于假单胞菌属（Pseudomonas）里的种。
这4个属里的细菌在国内外都已被报道有降解苯酚的特性，其中有关假单胞菌降解环境有机物的报道较多。
2、培养液中的苯酚含量通过4-氨基安替比啉分光光度法测定，通过苯酚降解效率的比较，菌株P2降解苯酚的能力较其它9株菌株要强。
于是将菌株P2作为本研究中进一步研究的对象，研究了不同的环境条件下该菌株降解苯酚和菌体生长的情况。
3、通过苯酚羟化酶特异性引物的设计，从菌株P2扩增出苯酚羟化酶大亚基基因，该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽，催化苯酚代谢的第一步反应；表明菌株P2能降解苯酚是由于细胞具有降解苯酚的遗传基础。
苯酚降解菌的富集筛选及其降解条件分析研究
苯酚降解菌的富集筛选及其降解条件研究摘要：［目的］从炼油厂的活性污泥中分离高效苯酚降解菌，对其进行形态学鉴定，并研究其特性，为含酚废水的处理及环保工程菌株构建奠定基础，具有一定的理论和实际应用价值。
［方法］从南京金陵石化炼油厂的活性污泥中筛选、驯化得到1 株高效苯酚降解菌株P4。
通过形态学对其进行鉴定。
最后，对P4的苯酚降解特性进行研究。
［结果］P4为革兰氏阴性球菌，最适降解苯酚的温度为28℃，最适pH 为5.5。
36h 内对300mg/L的无机培养液苯酚降解率达到56.6%。
［结论］P4 具有较强的适应能力和苯酚降解能力，可用于高浓度含酚废水的生物处理，有较高的研究及应用前景。
关键词:苯酚降解菌。
筛选。
驯化。
最佳降解条件苯酚是有机合成的重要原料，是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药和医药合成等行业生产的原料或中间体[1]，大量用于制造酚醛树脂以及其他高分子材料、药物、燃料和炸药等。
随着树脂、化工和高分子材料等企业对苯酚需求量的日益增加，各企业所排放的含苯酚废水量也日益增加[2]。
由于苯酚是一种原型质毒物，具有很强的毒性，对生态环境和人体健康构成巨大威胁[3, 4]。
在许多国家，苯酚已被环保部门列入优先控制污染物的黑名单之中[5, 6]。
结合国标GB8978-1996的实施，有关工作人员将每升1000毫克以上的含酚废水进行回收处理；每升1000毫克以下的含酚废水浓缩后回收处理；每升300毫克以下的含酚废水才允许采用某种方法清除废水中苯酚，处理达标后排放。
清除工业废水中苯酚的方法主要分为三大类：物理处理方法、高级氧化处理技术、生物治理方法。
常用的物理处理方法包括吸附法、溶剂萃取法、膜萃取技术和膜蒸馏技术等；常用的高级氧化处理技术包括湿式催化氧化技术、光催化氧化技术和电催化氧化技术等；常用的生物治理方法包括活性污泥法、酶处理技术和固定化微生物技术等[7]。
其中利用微生物降解苯酚不仅处理效率高、二次污染少，而且成本低廉、简单方便，因此生物降解法成为经济效益和环境效益俱佳的苯酚清除方法[8]。
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究引言石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。
未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。
许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。
目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。
其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。
目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。
本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。
对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。
1 实验材料和方法1.1 菌株来源采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口处污泥进行菌株筛选。
1.2 培养基基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。
以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。
富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。
1.3 研究内容与方法1.3.1 菌株和的驯化和分离在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。
高效苯酚降解菌的分离与降解特性
基金项 目：佳木斯大学学 生创新课题 （课题编号 ：Ｄｚ２０１１—０２１） ＊为通讯作者
· ２５· ２０１１年 ８月
农 业 与 技 术
Ｖｏ１．３１ Ｎｏ．４
荫 种 的甯 集 与驯 化 采用 一 次性 加入 大 剂昂 化 号 】、２、３、４、５、６、７。
合 物 的方法 ［８］。将菌 种在 无菌条 件 下接 种到 ２０ｍＬ
３．１ 结 果
大面积 农 作 物种 植 区 ，利 用 松 花 江 水 进 行 灌 溉 ，
３．１．１ 筛选 出 ７株降解能力强的菌株对苯酚都有 而含酚废水直接排入江中则将对农作物造成毒害 一 定 的点适应 性 ，且对苯 酚有很强的降解能力 ， 作用 ，同时人们适用后有毒物质 在人体 内富集 ，
达 ２５％，血酚浓度为 ０．７４ｍｍｏｌ／Ｌ，１０分钟死亡。 将浓度 为 ｌ０～，１０～，１０～，１０一，ｌ０一 的土样
酚类会对人类的身心健康造成危害，毒害其他生 溶液接种到富集培养基上 ，培养 ４８ｈ后观察。
物 ，破坏了生态系统 的稳定性 ，故我国及其他国
（２）选 择 培 养基［ ］：ＫＮｏ３４．０ｇ，ＮａＣ１ ５．０ｇ，
ｓｏｒｂｅｎｔｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ８Ｏｌ￣ Ｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｏｗａｎｔｓ ｐｈｅｎｏｌ ａｎｄｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ［Ｊ］．ＲＰ￣ｌｃｔｉｖｅ ａｎｄ ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰｏｌｙｍｅｒｓ，２００１，４６ （３）：
２５９—２７１
高 浓度 含 酚污 水 的研 究 仍 有 深 度 可挖 ，因此 必 须 ［８］任源 ，吴超 飞，等 ．苯胺分离菌 的驯化筛选研究 ［Ｊ］．环 境
及不 同苯酚浓度下的生长和苯酚降解情况的考察 ，
苯酚降解菌的筛选及性能评价
少， 可分为单元酚 （ 如苯酚） 和多元酚 。按
其能 否与水蒸气 共沸而挥 发 ． 又分 为挥发
混凝 沉淀 和气浮 法 、 气提 及蒸 酚和不挥 发酚。 因此 ． 酚类不仅指 苯酚 ， 而 有盐析 法 、 馏法 、 吸 附法 、 萃取 法 、 离 子交换 法、 膜技 且还 包括邻位 和间位被烃基 、 卤素 、 烷基、 硝基、 亚硝 基 、 羧基 、 醛基、 苯 甲酞等 取 代
苯 酚 降 解 茵 的 筛 选 及 性 能 评 价
辽 宁阜 新 氟产 业 开发 区 高博
一Hale Waihona Puke 、引 言 苯酚是原生质毒 ， 属于高毒 物质。它 酚废水 。 但是 需要消耗大 量的能源 。离 子
吸收和经 口服 交换 法不 适 用于 处理 数万 毫克每 升的 高 随着石油化工、 塑料、 合成纤维、 焦化 可以通过皮肤粘膜 的接触 、 等 工业的迅速发 展 ． 各种 含酚废 水也相 应 而侵入人体 内部 ， 与细胞 原浆质蛋 白质能 浓度含酚废水 。 增多， 由于 含酚 废水 的毒 性较 大 。 而且 涉 及水 生生物 的生长和繁殖 ， 污染 饮用水 水 源。 因此对 含酚废水 的排 放必须 有严格 的 规定 。一般条 件下 ， 规定 饮用水 的含挥 发
性酚 的浓度为 ０ ． ０ ０ １ ｍｇ ／ Ｌ 。 水源 水体 中含
形成不溶性蛋 白质 ， 使 细胞失去活 力 ， 高 浓度酚可使蛋 白质凝 固及 引起组 织损伤 、
２ 、 含 酚废 水 的化学处理 法
化学处理法主要有化学沉淀法、 化学
酚最高容许浓 度为 ０ ． Ｏ ０ ２ ｍ ｇ ／ Ｌ ［ １ ］ 。 根 据这
（ 一） 、 含 酚 废 水 的 来 源
在水处理 中的利用率较低 。 且 臭氧生产 费 １ ９ ７ ２年 Ｆ ｕ ｊ ｉ ｓ ｈ ｉ ｍ ａ等发现 了 Ｏ ． 电极 上
高效苯酚降解菌的筛选及其特性的研究
鉴定该菌为球 菌， 兰氏染色阴性 。 实验结果表 明 ： 革 降解苯 酚的最佳条件为 ： 温度 ３ 、 Ｈ值 ７ ８ 葡 萄糖 浓度 １５０ｍｇ 、 ０ｏ ｐ Ｃ ～， ０ ／ 接 Ｌ
种 量 ｌ％、 液 量 ５ Ｌ Ｏ 装 ０ｍ 。 关键词 ： 酚 ； 化 ； 苯 驯 筛选 ； 响 因素 影
文章 编 号 ：６ ４ １２ （０ ０ ０ — ０ ５ ０ １ ７— ０ １ ２ １ ）９ ０４ — ３
长所 需 的各种 营 养物 质 。实 际工 业含 酚废 水 中可 能 苯 酚是 一种 重要 的有 机化 工 原料 ，是 丙烯 的重
要 衍 生物 之 一 ， 要用 于 生 产 酚醛 树 脂 、 主 己内酰 胺 、 双 酚 Ａ、 己二 酸苯胺 以及 水杨 酸 等 …， 成 为这 些 工 并
ｄｏ ｅ１ ％ ，ｉ ｉ ｏ ｕ ｅ５ ｍ Ｌ ｓ ０ ｌｑｕ ｄｖ ｌ ｍ ０ Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｈｅ ｏ ； ｃ ｌｍａｔ ａｉ ｎ ｓ ｒ ｅ ｎｇ ｆ ｃｏ ｓ ｐ ｎ ｌａ ｃ ｉ ｉ ｔｏ ； ｃ ｅ ｎｉ ； ａ ｔｒ ｚ
中 图分 类 号 Ａ
Ｋ２ ＨＰＯ４０． Ｌ， Ｓ ５ Ｍｇ Ｏ４‘ ７Ｈ２ ０． ／ Ｃａ ２０． ／ ０ ２ ｇ Ｌ， Ｃ１ １ ｇ Ｌ，
业废 水 中 的主要 污染 物 。 中国等 许多 国家 已将 其列
入重点污染物的名单之中［。 ２ 近年来 ， １ 国内外许多学 者在生物降解苯酚方面进行了广泛的研究 ，已筛选 出多种 降 酚微 生物 菌株 ， 如假 单 胞 菌 （ｓｕｏ ｏａ— Ｐｅｄｍ ｎｓ ｓ． 、 ｐ ） 真养 产碱菌 （ ａｉｅｅ ｕｒ ｈ ｓ …、 Ａｌ ｌ ｎ ｓ ｔ ｐ ｕ ） 醋酸 钙 ｃ ｇ ｅ ｏ
高效苯 酚降解菌 的筛选及其特性 的研究
实验三 高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定
实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定一、实验目的1、掌握微生物分离纯化的基本操作；2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法；3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法；4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。
二、实验原理在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。
这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。
苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。
本实验通过筛选苯酚降解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。
+ COOHCH2CH2COOH CH3COOHCO2+H2O从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。
三、实验器材与试剂1、样品实验土样采自校园污水处理厂。
2、器材恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL 容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸、pH试纸。
3、试剂葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。
苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇匀。
此溶液溶度为1000mg/L。
测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。
Na2B4O7饱和溶液：称取Na2B4O740g，溶于1L蒸馏水中，冷却后使用，此溶液的pH值为10.1。
3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。
2% （NH4）2S2O8溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
苯酚高效降解菌的筛选及其降解特性的研究
从活性污泥中分离到1株苯酚高效降解细菌,初步确定为假单胞菌属(Pseudomonas);该菌株能在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基中生长;可以在20～40 ℃、pH值5.0～9.0范围内较好生长;降解苯酚最适温度为35℃,最适pH值为7.0,最大降解率达到89%.完全降解无机盐培养基中500mg/L、1 000mg/L、1 200mg/L的苯酚分别需要60h、72h、108h.
作者：刘广金张袖丽作者单位：安徽农业大学应用化学系,安徽合肥,230036 刊名：现代农业科技英文刊名：XIANDAI NONGYE KEJI 年，卷(期)：2007 ""(11) 分类号：X7 关键词：苯酚生物降解假单胞菌属。
降解苯酚微生物的选育
降解苯酚微生物的选育一、实验目的1. 学习从含酚工业污水、活性污泥中筛选苯酚降解菌。
2. 学习通过活性污泥驯化分离耐酚菌。
二、实验原理酚类化合物是化工、造纸、钢铁等工业废水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死鱼虾、危害庄稼、严重危害人类健康，是各国研究关注的污染物之一。
含酚废水中分离出的生物降解酚能力强的菌为：假单胞菌、白乳杆菌、假丝酵母和野丝膜菌等。
含酚废水生物处理目前主要采用活性污泥法。
三、实验材料1.菌源含酚工业废水或含酚废水曝气池中的活性污泥。
2.培养基耐酚真菌培养基(固体、液体和斜面)，耐酚细菌培养基(固体、液体和斜面) ，碳源对照培养液a，苯酚培养液b。
3.试剂2% 4-氨基安替比林溶液，8%铁氰化钾溶液，氯仿，氨性氯化铵缓冲液，溴酸钾-溴化钾溶液，硫代硫酸钠溶液, 1%淀粉溶液。
4.其他稀释分离所用的无菌水，无菌培养皿，无菌移液管，测定酚所用的移液管，容量瓶，试剂瓶，酸式滴定管等。
四、实验方法1.采样自焦化厂、钢铁公司化工厂、造纸厂处理含酚工业污水的曝气池中取活性污泥和含酚污水，装于无菌瓶中，带回实验室，记录采样日期、地点，曝气池的水质分析包括：挥发酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化学需氧量、焦油、硫化物、氰化物、总氮、氨态氮、磷、pH、水温等。
采集的样品应迅速稀释分离。
2.分离纯化一般微生物在含酚培养基上不能生长。
苯酚耐受菌株的筛选，可采用药物抗性菌株一样的梯度平板法。
即在培养基中加入一定量的药物，使大量细胞中的少数抗性细胞在平板上的一定剂量药品的部位长成菌落，从而判定该菌耐受酚的能力。
1、梯度平板制备：在无菌培养皿中，先倾倒7～l0mL不含苯酚的无菌细菌或真菌固体培养基，将培养皿一侧置于木条上，使皿中培养基倾斜成斜面，且刚好完全盖住培养皿底部，待培养基凝固后，将培养皿放平，再倒入无菌7～l0mL(刚好完全盖住下层斜面)含70mL/l00mL苯酚的无菌耐酚细菌或耐酚真菌固体培养基，刚好完全盖住下层斜面，放置过夜。
苯酚降解菌的筛选及其降解特性初探
苯酚降解菌的筛选及其降解特性初探周倩倩;丁丛;王志平;蔡伟民【摘要】In order to investigate the biodegradation mechanisms of phenol by aerobic granular sludge, 18 strains were isolated from the sludge using basal medium with phenol as sole carbon source and strain 1# which have high degradation efficiency was studied. This strain could endurance concentration of phenol up to 2000 mg/L when inoculated in medium with phenol as the sole energy and carbon source. The optimization experiments of phenol degradation with strain 1 showed that, with inoculum amount 3% .temperature 30 ℃ ,pH value 6. 85, liquid volume in flask 100 mL and rate of shaking incubator 120 r/min, phenol with initial concentration 1000 mg/L could be degraded up to 95% after 24 h. Moreover, it was revealed that addition of glucose with low concentration (0.5 ～ 1.0 g/L) could promote growth of strain, thus increase the phenol removal. The colony morphology of strain 1* was circular,smooth and pinkish, and it was identified as Candida tropicalis according to the 23 Sr DNA sequence analysis.%为深入了解好氧颗粒污泥降解苯酚的内在机制,采用苯酚选择性培养基从颗粒污泥中筛选出了18株苯酚降解茵,并从中找到一株高耐酚能力和强降酚能力的1 #菌株,试验结果表明,该菌株有高苯酚耐受能力,在以苯酚为惟一碳源的培养条件下能够耐受2 000 mg/L的苯酚；该菌株也有高效的苯酚降解率,在接茵量为3％,温度为30℃、pH值为6.85、装液量为100 mL/250 mL、恒温振荡速度120 r/main的条件下,可使初始质量浓度为1000 mg/L的苯酚在24h内降解95％以上；且通过投加0.5～1.0 g/L的葡萄糖可进一步有效促进该菌株的增殖及对苯酚的利用.该菌株在培养基上形成圆形凸起的茵落,其表面光滑湿润,呈淡粉红色,容易挑起；经23Sr DNA测序鉴定,此菌株为热带假丝酵母( Candida tropicalis)属.【期刊名称】《哈尔滨商业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(027)004【总页数】7页(P544-549,560)【关键词】生物降解;热带假丝酵母;苯酚;降解特性【作者】周倩倩;丁丛;王志平;蔡伟民【作者单位】上海交通大学环境科学与工程学院,上海200240;上海交通大学环境科学与工程学院,上海200240;上海交通大学环境科学与工程学院,上海200240;上海交通大学环境科学与工程学院,上海200240【正文语种】中文【中图分类】X172苯酚(C6H6O)，又名石炭酸、羟基苯，是最简单的酚类有机物，其密度为1.071g/cm3，熔点42～43℃，沸点182℃，在常温下微溶于水、乙醚、氯仿、甘油和二硫化碳，几乎不溶于石油醚［1－2］.作为重要的化工原料，苯酚及其衍生物被广泛应用于酚醛树脂、造纸、炼油、焦炭、染料、纺织、杀虫剂、农药和医药合成等行业生产中［3－4］，并成为这些工业废水中的主要污染物，其在焦化厂和煤气厂废水中含量(挥发酚)可达1600～3200mg/L［5］.酚类化合物是原型质高毒类物质，具有三致效应，美国环境保护署(EPA)把苯酚列入129种优先控制污染物和65种有毒污染物之列，我国也把苯酚列入中国环境优先污染物“黑名单”之中［6］.我国污水综合排放标准(GB8978－1996)规定，挥发酚的一级标准、二级标准和三级标准分别为0.5、0.5、2.0mg/L.含酚废水的处理方法有很多种［7］，微生物降解法因其效果好、成本低、无二次污染等优点而在应用中发挥着日益重要的作用［8］.为此，近些年来，研究人员在含酚废水微生物处理方面进行了大量研究［9－11］，明确了生物法的关键在于高效破酚菌的驯化与应用.在降酚微生物菌种的研究中，热带假丝酵母因其高效降解性逐渐成为国内外的研究热点［12］.本文以实验室前期培养的苯酚降解好氧颗粒污泥为主体，采用选择性培养基从中分离出了一株降酚菌，它的高苯酚耐受度与高效的苯酚降解率，在其他文献很罕见.针对影响其降解苯酚的因素开展了系列研究，以明确好氧颗粒污泥的降酚机理及其操作工艺优化，为好氧颗粒污泥工艺用于含酚废水处理提供理论支持.1 材料和方法1.1 菌源实验室前期培养的苯酚降解颗粒污泥，经粉碎、悬浮后于YEPD培养基中培养.1.2 培养基的制备1.2.1 固体培养基1)虎红琼脂培养基(Rose Bengal medium)虎红琼脂培养基31 g/L(含13 g/L琼脂)，补至琼脂质量分数为1.8%.培养基在121℃湿热灭菌20min后制成平板，倒置晾干于超净工作台备用.2)PDA固体培养基(Potato Dextrose Agar medium)马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂18 g/L.培养基在121℃湿热灭菌20min后制成平板，倒置晾干于超净工作台备用.1.2.2 富集培养基富集培养基采用YEPD培养基(YEPD medium):酵母提取物(Yeast extract)10 g/L，蛋白胨(peptone)20 g/L，葡萄糖(Dextrose)20 g/L.培养基在121℃湿热灭菌20min后备用.1.2.3 无机盐培养基无机盐培养基(NMS medium):(NH4)2SO40.5 g/L，NH4NO31.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，K2HPO41.5 g/L，CaCl20.01g/L，微量元素1mL/L.121℃湿热灭菌20min后备用.(微量元素液:FeSO40.1 g/L，ZnSO40.1g/L，AlK(SO4)20.01 g/L，Na2MoO40.01 g/L，CoCl20.1 g/L，CuSO40.01 g/L，H3BO40.01 g/L)1.3 仪器与设备主要仪器设备包括荧光相差显微镜(Nikon E400)、高速台式冷冻离心机(德国SIGMA 3－18K型)、低速台式离心机(Anke KA－1000型)、超净工作台(哈尔滨市东联公司FLC－3型)、紫外－可见分光光度计(Unico UV－2102PCS型)、恒温振荡培养箱(上海常思工贸有限公司)、微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司XW－80A型)、精密pH计(上海雷磁仪器厂 PHS－3C)、生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司 SHP－250型)等.苯酚(Phenol，crystalline，ultra pure)购于上海生工生物工程有限公司.1.4 实验方法1.4.1 苯酚降解优势菌的选育1)菌种富集取活性颗粒污泥50mL到含有200mg/L苯酚的150mL无机盐液体培养基中，并加入5粒玻璃珠，于30℃、120 r/min摇床中培养，24 h后取50mL转移至含有400mg/L苯酚的150mL无机盐液体培养基中，同样条件下继续培养24 h，依次逐步提高培养基中的苯酚质量浓度至1200mg/L，共5个周期，120 h.最后取培养液进行一系列稀释后涂布于苯酚质量浓度为1000mg/L的无机盐固体培养基平板上，置于生化培养箱中30℃培养.2)菌种的纯化分离.将驯化后所得混合菌株采用平板划线和涂布法进行纯化分离.在无菌操作条件下挑取菌落，划线及以10－3、10－4和 10－5的质量浓度梯度涂于虎红琼脂培养基和PDA培养基上，通过比较菌落特征(包括菌落大小、形状、颜色，隆起形态，边缘特征等)将菌株初步分类，再通过荧光相差显微镜(Nikon E400)将菌株进行进一步区分.将分离出来的菌种反复纯化3次后，挑取高度分散的单菌落至培养基斜面上划线培养，待斜面上形成菌苔后置于4℃的冰箱中保存备用.3)菌种的筛选先将菌种在无菌条件下接种到50mL富集培养基中，在温度为30℃，转速为120 r/min的恒温振荡摇床中培养12 h;取培养液3mL转接于100mL富集培养基中，继续振荡培养12 h.取菌液90mL，在10000 r/min条件下离心5min，弃上清液后用无机盐培养基洗脱菌体3次，以去除菌体表面吸附的YEPD培养基.再将得到的菌体用无机盐培养基配成菌悬液，以3%(V/V，下同)的接菌量接种到含1000mg/L苯酚的无机盐培养基中，于30℃、120 r/min恒温摇床中继续振荡培养.通过检测菌株细胞生长量和苯酚残余质量浓度的变化考察菌体对苯酚的降解利用状况.筛选出1株苯酚降解优势菌并进行菌种鉴定.1.4.2 优势菌的苯酚耐受试验配制分别含 500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250mg/L苯酚的无机盐固体培养基，将筛选出的苯酚降解优势菌分别在这8个梯度的培养基上划线，后置于生化培养箱中培养.1.4.3 分析与检测1)菌株生长量的测定采用比浊法以波长为560 nm处的光吸收值(OD560)代表培养液中的浊度，即微生物量，表征菌株的生长状况［13］.2)苯酚质量浓度的测定培养液中苯酚质量浓度采用4－氨基安替吡啉直接吸光光度法［14］测定.酚类化合物于pH值为10.0～10.2介质中，在铁氰化钾存在下，与4－氨基安替比林反应，生成橙红色的跺酚安替比林染料，其水溶液在510 nm波长处有最大吸收.3)苯酚降解率的计算1.4.4 环境因子对菌株生长及其降酚效果的影响1)接菌量的影响将配制的菌悬液分别以1%、3%、5%、7%的接菌量接种到含1000mg/L苯酚的无机盐培养基中，于30℃、120 r/min恒温振荡摇床中培养.间隔6 h取样，测其菌浊(菌株生长量)以及剩余苯酚质量浓度.2)苯酚初始质量浓度的影响根据苯酚耐受实验结果，将配制的菌悬液以3%的接菌量分别接种到苯酚含量为750、1000、1250、1500、1750mg/L的无机盐培养基中，于30℃、120r/min恒温振荡摇床中振荡培养.分别于24 h和36 h取样，测其菌浊以及剩余苯酚质量浓度.3)pH值的影响将配制的菌悬液以3%的接菌量接种到苯酚质量浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，调pH值分别为 4.00、6.00、8.00、10.00，再以一组不调pH(已测pH=6.85)为对照，于30 ℃、120 r/min恒温振荡摇床中振荡培养.间隔6 h取样，测其菌浊以及剩余苯酚质量浓度.4)温度的影响将配制的菌悬液以3%的接菌量接种到含1000mg/L苯酚的无机盐培养基中，分别放置于温度为20、25、30、35、40 ℃，振荡速率均为 120 r/min恒温振荡摇床中振荡培养.于36 h取样，测其剩余苯酚质量浓度.5)装液量的影响将配制的菌悬液以3%的接菌量接种到苯酚质量浓度为1000mg/L的无机盐培养基中，置于培养基体积分别为50、75、100、125、150mL 的250mL三角瓶中，在30℃、120 r/min恒温振荡摇床中振荡培养.于24 h取样，测其剩余苯酚质量浓度.1.4.5 外加碳源对菌株生长及其降酚能力的影响选葡萄糖为外加碳源.将配制的菌悬液以3%的接菌量接种到含1000mg/L苯酚的无机盐培养基中，分别加入质量浓度为 0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L的葡萄糖，再以一组苯酚为惟一碳源为对照，置于温度为30℃，振荡速率为120r/min恒温振荡摇床中振荡培养.间隔4 h取样，测其菌浊以及剩余苯酚质量浓度.2 结果与分析2.1 降酚菌的选育及鉴定经过驯化和反复涂布分离，从实验室前期降酚好氧颗粒污泥中分离出了18种苯酚降解菌株，分别标记为1#至18#.用虎红琼脂培养基和PDA固体培养基划线以及涂布后于4℃的冰箱中保存备用.选取其中降解苯酚效果最好的1#菌株进行苯酚耐受性试验，发现其在苯酚质量浓度低于2000mg/L的培养基内均能生长良好，经大连宝生物工程公司采用23S rRNA测序鉴定，该菌株为热带假丝酵母属(C.tropicalis).2.2 接菌量的影响接菌量对菌株生长及苯酚降解的影响如图1、2.从图1可以看出，当接菌量为1%时，菌株需要比较长的适应期，在12 h之后菌浊(生物量)才有比较明显的增长，而当接菌量≥3%时，菌株只需要很短的适应期即能进入对数增长期.随着微生物的增长，其中的苯酚被逐渐降解，各接种量下的试验水样均有近似的菌浊，表明由培养基质确定的微生物增长量基本相同.试验中各接种样的剩余苯酚质量浓度如图2所示.从图2可以看出，实验初期由于微生物量较低，各试验样的剩余苯酚质量浓度相差不大，而由于菌株进入对数生长期有所差异，其剩余苯酚质量浓度出现明显差别.接菌量高的试样苯酚去除效率越高.接菌量≥3%的试样在24 h内均已基本完成试样内的苯酚降解，而接种1%的试样则明显延迟.在后续试验中，确定3%为最佳接菌量.2.3 苯酚初始质量浓度的影响微生物降解有毒有机化合物时需考虑化合物质量浓度本身对降解性能的影响［15］.在初始苯酚质量浓度对菌株利用苯酚的试验中发现，初始苯酚质量浓度越高对微生物毒害越大，导致苯酚的降解越慢(图3).24 h时，初始质量浓度为750mg/L的苯酚降解已完全结束，质量浓度为1000mg/L的苯酚降解率也已达到95%;而初始苯酚质量浓度≥1250mg/L的试样中，苯酚降解率急剧降低，1250mg/L的降解率仅为70%，1500mg/L和1750mg/L的更小于20%.36 h后，初始质量浓度为1250mg/L的苯酚降解率也能达到98%，而1500mg/L的降解率仅76%，1750mg/L的降解率仍不及20%.因为对2000mg/L质量浓度的苯酚降解率几乎为零，因此判断此菌株对2000mg/L的高质量浓度苯酚有耐受而无降解.在后续试验中，选取初始苯酚质量浓度1000mg/L为该菌株降解苯酚的最适宜降解质量浓度.图3 苯酚质量浓度对苯酚降解的影响2.4 pH值的影响pH值是影响微生物降解苯酚的主要因素［16］，不仅会直接影响微生物的生长增殖，同时可能改变水体中苯酚的存赋形态［17］;它通过显著影响苯酚降解过程中的一系列生化反应，从而影响苯酚降解速率及效果［18］.不同pH值对菌株生长及利用苯酚的结果如图4、5.当pH值介于4.00到8.00之间，菌株均能较好的生长，且对苯酚都有较好的降解.其中，不调pH(pH=6.85)时菌株生长最快，适应期最短，24 h即完成了95%以上苯酚的降解;pH值为8.00时菌株生长情况和苯酚降解效果好于pH值为4.00和pH值为6.00时;而当pH值达到10.00时，菌株基本没有增殖，其中的苯酚也基本未被利用.这是因为高pH值导致苯酚电离形成弱酸根离子，对微生物产生了严重的毒害作用.降解24 h后重新测定pH值，发现除pH值初始为10.00的试样以外，其他试样均有所降低，这可能是由于苯酚降解过程中产生的中间产物，如某些有机酸而引起的.在36 h后，pH值又有所上升，但未能恢复到pH值初始值，这与Ucun等人的研究结果一致［19］.由于苯酚利用过程中pH值会降低，因此推测中性偏碱的环境有利于菌株降解苯酚，这与试验中pH值为6.85及8.0的试样有较好的降解效果相一致［20］.本菌株适应pH值为4.00～8.00，最适pH值为中性稍偏碱.2.5 温度的影响温度影响微生物体内的酶活性，在一定温度范围内，降酚酶表现出最佳催化活性［21］.图6反映的是在不同温度下，接种量3%的菌株36 h后的苯酚降解率.从中可以看到，20℃和40℃下36 h后的苯酚降解率均低于20%，25℃下降解率仍仅为50%，而30℃与35℃条件下，菌株在36 h内能完成100%的苯酚降解.因此，该菌株降解苯酚的适宜温度为30～35℃，最适温度为30℃.本研究温度对该菌株降解苯酚有极大的影响，是影响苯酚降解的显著因素.2.6 装液量的影响溶解氧是好氧微生物生长的重要生长条件，从而溶解氧质量浓度也会影响微生物对苯酚的利用效率.试验中采用改变装液量的方式改变摇瓶内的溶解氧含量，以实现不同溶解氧质量浓度的目的.图7给出了不同装液量情况下，菌株在24 h内的降酚情况.从图7中可以看出，使用250mL的三角瓶，随着装液量的增加，溶液的溶解氧降低，相应的苯酚降解率也逐渐降低.当装液量＞100mL，通气量明显不足，菌体生长较差，苯酚降解率显著下降;而100mL以下的装液量对降酚率影响不大.后续试验中，采用100mL为最适装液量.2.7 外加碳源的影响因高质量浓度苯酚对微生物的毒害作用，导致微生物生长量下降，不利于生物降解，此时投加适量易降解基质可促进微生物量的增殖，有利于难降解化合物的生物降解［22］.本项研究中，通过添加葡萄糖考察了外加碳源对菌株利用苯酚的影响.综合图8、9可以看出，虽然葡萄糖的加入使菌浊迅速增长，但对起始阶段的苯酚降解并没有促进作用.无添加葡萄糖的一组在12 h对苯酚已有20%左右的降解，而添加葡萄糖的试验组反而对苯酚几乎无降解，这是由于菌株获得了更容易利用的基质，因而停止了对苯酚的利用.12 h后，添加少量葡萄糖(0.5 g/L和1.0 g/L)试验组的苯酚降解速率明显加快，这是因为葡萄糖的投入迅速提高了实验组的微生物量，而在葡萄糖被完全利用后，菌株开始转而利用苯酚为营养基质，从而使得苯酚利用率迅速提高.在添加质量浓度≥1.5 g/L的试样中，菌株在试验周期内始终处于富营养阶段，加入的葡萄糖足以满足其全部营养需求，由此降低了其对于苯酚的利用，造成苯酚利用“受抑制”的假象.为提高苯酚降解率，后续试验中投加的葡萄糖质量浓度应控制在0.0 ～1.0 g/L.3 讨论与结论1)采用苯酚选择性培养基从实验室前期培养的苯酚降解颗粒污泥中富集分离出了18株苯酚降解菌株，其中挑选出具有高苯酚耐受和降解率的1#菌株，其可耐受苯酚质量浓度达2000mg/L，24 h内可使初始质量浓度为1000mg/L的苯酚降解达到95%以上，经鉴定为热带假丝酵母(C.tropicalis).2)对该菌株降解苯酚的试验表明，其最佳投加量为3%，最适温度为30～35℃，pH值为6～8，装瓶量为100mL/250mL，初始苯酚质量浓度为1000mg/L. 3)为促进菌株的快速增殖并提高其降酚效率，外加碳源葡萄糖的投加质量浓度应控制在0.0～1.0 g/L，过低则不利于微生物增殖，过高则不利于菌株对苯酚的有效利用.参考文献:［1］金相灿，程振华，徐南妮，等.有机化合物污染化学［M］.北京:清华大学出版社，1999:250－265.［2］黄蓓佳，张兰英，王少平.低温条件下1，2，4－三氯苯降解菌的筛选及降解特性［J］.环境科学研究，2008，21(5):19－22.［3］HA S R，VINTTNANTHARAT S，OZAKI H.Bioregeneration by mixed microorganisms of granular activated carbon loaded with a mixture of phenols［J］.Biotechnology Letters，2000，22(13):1093－1096.［4］SANTOS V L，LINARDI V R.Biodegradation of phenol by a filamentous fungi isolated from industrial effluents－identification anddegradation potential［J］.Process Biochemistry，2004，39(8):1001－1006. ［5］汪晋三，黄新华，程国佩.水化学与水污染［M］.广州:中山大学出版社，1990:367－370.［6］WAGNER M，NICELL J A.Peroxidase－catalyzed removal of phenols from a petroleum refinery wastewater［J］.Water Science Technology，2001，43(2):253－260.［7］佟丽萍，唐霞，朱宝花，等.含酚废水处理方法的选择［J］.工业水处理，1998，18(5):36－37.［8］邱凌峰，吴芳芳，姚尧.苯酚降解菌TX1的分离鉴定及其降解特性［J］.上海环境科学，2010，29(1):35－40.［9］JEONG J J，KIM J H，KIM C K，et al.3－ and 4－alkylphenol degradation pathway in Pseudomonas sp.strain KL28:genetic organization of the lap gene 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苯酚降解菌株的筛选及菌株特性研究
第35卷第1期2021年1月天津化工Tianjin Chemical IndustryVol.35No.1Jan.2021苯酚降解菌株的筛选及菌株特性研究许宁,马勤清（天津长芦集团有+公司，天津300450）摘要：酚类化合物是一种难以降解的有机污染物,具有较高的生物毒性,环境危害极大。
本文进行了苯酚高效降解菌的分离筛选工作，并对苯酚降解菌株特性进行了研究。
结果表明：从焦化厂曝气池活性污泥中分离得到的3个菌株XL1、XL2、XL3对苯酚均有降解利用的能力，其中以XL1降解能力最强，经过90h的培养，苯酚去除率为91.7%。
菌株XL1为革兰氏阴性杆菌，好氧，最适生长pH值为中性微酸，最适温度范围为25~30!。
关键词：苯酚;降解菌；筛选doi:10.3969/j.issn.1008-1267.2021.01.009中图分类号：X952；TQ09文献标志码:A文章编号：1008-1267（2021）01-0024-03Screening of phenol-degrading strain and research on its charactersXU Ning,MA Qin-qing(Tianjin ChangluHaijing Group CO.LTD.,Tianjin300450#Abstract:Phenolic compound is a kind of organic pollutant that is difficult to degrade,and it has high biological toxicity and great environmental harm.In this paper,the separation and screening of efficient phenol degrading bacteria was carried out,and the characteristics of phenol degrading strains were studied.The results show that all the three strains XL1,XL2,and XL3isolated from the activated sludge in the aeration tank of the coking plant have the ability to degrade and utilize phenol.Among them,XL1has the strongest degradability.After90hours of cultivation,the phenol removal rate reached91.7%.XL1is a kind of aerobic Gram-negative bacilli,and the optimum growth pH is neutral or slightly acid,and the optimum temperature range is25〜30!.Keywords:phenol;degrading bacteria;Screening本文从焦化厂采集活性污泥，进行了含酚废水高效降解菌的分离筛选工作，并对苯酚降解菌株特性进行了研究，为进一步实现含酚废水的生化法无害化处理提供菌种资源。
苯酚生物降解菌的筛选
Screening of phenol biodegrading bacteria
实验目的 实验基本原理
实验用品 方法步骤 实验结果及分析
注意事项
实验目的
1·掌握微生物分离纯 化的基本操作 2·掌握用选择性培养 基从土壤中分离苯酚 生物降解菌的原理和 方法
基本原理
苯酚是芳香烃化合物。苯酚是常用的消毒剂，能 意志柠檬酸循环。但在部分细菌中存在芳香烃的降解 质粒，将其降解为三羧酸循环的原料或中间产物。
在苯酚浓度梯度培养基平板高含药区上分离出的 菌落，对苯酚具有较好的耐受性，可能具有分解酚菌 的能力；然后将其在以苯酚为唯一碳源的培养基里进 行摇床培养，淘汰掉不能利用苯酚的菌株，可筛选到 苯酚降解菌；再用不同浓度的苯酚药物培养基分离，
可筛选出耐受能力好，降解程度高的苯酚降解菌。
实验用品
材料 实验土样采自校园肥沃土
4
5
注意事项
各种培养基的配制 应严格按配方的要
A B
涂布梯度平板 的菌悬液只作 适度稀释，菌
C
涂布平板的菌
悬液不要过多
或过少，0.2mL 为宜
求完成，尤其是苯 酚的称量和pH
浓度不必过低 梯度平板上挑
单碳源实验的
E
D
取菌落时，要 挑取单菌落
培养基和培养 条件一定要严 格把握
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以苯酚为单碳源的菌株的筛选
1
单碳源培养 基配制：按
2
苯酚的浓度 设定：苯酚 的浓度分别 按0.2g/L， 0.4g/L， 0.6g/L， 0.8g/L， 1.0g/L，
3
平行样：
4
1株苯酚高效降解菌的筛选与鉴定
色 阳性 ， 单个细胞呈杆 状 ， 细胞单个或多个链状排列 ， 运动 ， 菌
体平均大小为 １３ ｍ Ｘ ． １ ｍ， ．７ ０ ６ 无荚膜 ， 芽孢椭圆形 、 不膨 大、 靠近中心 。菌株 的生理生化 特性检测 结果见 表 １ 。根据 形态和生理生化特征 ， 可初步确定菌株 Ｊ Ｍ 一 Ｄ ２～２具有芽孢
１５ ｐ ０１ ｂ 。
参 照文献 ［Ｏ 进行菌体形态观察 ； １］ 参照文献 ［ １ 进 行生 １］
理生化 实验 。 １６ １Ｓｒ Ｎ ． ６ Ａ基 因片段分 离与序列分析 Ｄ 细菌总 Ｄ Ａ的提取参照文献 ［２ 的方法进行 。采用细 Ｎ １］ 菌 １ Ｓｒ Ｎ ６ Ｄ Ａ通用引物 Ｆ７ ５ 一Ａ Ａ Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ ２ （ Ｇ Ｇ Ｉ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ
有被降解。 ２ ３ 苯 酚 降 解 菌 株 的初 步 鉴 定 ．
平板培养。根据菌落大小 、 面形状 、 表 隆起程度 、 明程度 、 透 边
缘形状和菌落颜色等差异 ， 挑取单菌落 ， 通过反复划线分离纯
化菌株 ， 号， 编 保存备用 。
１ ３ 苯 酚含 量 测 定 ．
２ ３ １ 菌株的形态及生理生化特征 ．．
富集培 养 基 ： 肉浸 膏 ５ ｓＬ， 白胨 １ ／ 氯 化 钠 牛 ／ 蛋 Ｏ ｇＬ， ５ｇ Ｌ 苯 酚 ０ ５ｇＬ，Ｈ值 ７ ０ ／ ， ． ／ ｐ ．。 筛选 培 养 基 ： Ｋ ２ Ｏ ． ／ 、 ２ Ｐ ０ ５ ｓＬ 以 Ｈ Ｐ ０ ５ ｇ Ｌ Ｋ Ｈ Ｏ ． ／ 、
（ ８ ：７— ２ ２ １４ ５ ．
［４ 陈晓德 ． １］ 植物种群 与群落结 构动态量 化分析方 法研究 ［ ］ Ｊ ．生
酚类降解菌的筛选及作用效果的研究
酚类降解菌的筛选及作用效果的研究发布时间：2021-07-01T15:36:18.710Z 来源：《科学与技术》2021年7期作者：王其辉郝景雯曹琳琳[导读] 针对含酚工业废水，采用原位分离技术从其生物系统中分离得到好氧菌7株，兼氧菌4株，并利用16SrDNA测序方法进行了鉴定王其辉郝景雯曹琳琳天津市工业微生物企业重点实验室针对含酚工业废水，采用原位分离技术从其生物系统中分离得到好氧菌7株，兼氧菌4株，并利用16SrDNA测序方法进行了鉴定，经进一步筛选确定由蜡样芽胞杆菌、腐败希瓦氏菌等4株菌复配成好氧菌剂，贝莱斯芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等3株菌组成兼氧菌剂。
以预处理后的含酚废水为目标，采用48小时酸化水解，72小时好氧曝气处理后，经菌剂降解性能的验证实验，结果表明：所研制的复配菌剂与原位样直接增值的培养液，无论是废水COD降解率，还是酚类物质降解率水平相当，说明研制的菌剂可以强化活性污泥。
关键字：原位分离含酚废水强化污泥高效降解Seven strains of aerobic bacteria and four strains of facultative bacteria were isolated from the biological system of phenol containing industrial wastewater by in-situ separation technology, and were identified by 16S rDNA sequencing method. After further screening, it was determined that four strains of Bacillus cereus, Shigella putrefaciens and three strains of Bacillus belies and Bacillus pumilus were combined to form an aerobic agent. After 48 hours of acidification and hydrolysis, 72 hours of aerobic aeration treatment, the degradation performance of the microbial agent was verified. The results showed that the degradation rate of COD and phenols in the wastewater of the compound microbial agent was equivalent to that of the in-situ sample, indicating that the developed microbial agent could strengthen the activated sludge.keyword: In situ separation，Phenolic wastewater，Enhanced sludge，Efficient degradation高效降解酚类物质微生物菌种的筛选是生物降解含酚工业废水的技术核心，原位分离技术是一种快速分离和筛选目标微生物的有效途径，由于长期自然驯化的原因，原位分离得到的微生物具有环境适应能力强、共生关系稳定和底物降解针对性好等特点，是一种值得推广的有效方法。
实验8苯酚生物降解菌的筛选
环保领域
除了在废水处理和土壤修复方面 的应用外，苯酚生物降解菌还可 应用于环保领域的其他方面，如 监测苯酚污染情况、评估环境质
量等。
对未来研究的建议与展望
深入研究菌株降解机制
优化菌株培养条件
为了更好地了解苯酚生物降解菌的作用机 制，需要进一步深入研究其降解过程中的 基因表达、酶活性等关键因素。
结果讨论
结合实验结果和相关文献，探讨苯酚 生物降解菌的筛选方法、影响因素以 及在实际应用中的潜在价值。
05
结论与展望
实验结论总结
苯酚生物降解菌的筛选成功
01
通过实验，我们成功筛选出了具有高效降解苯酚能力的菌株，
这为苯酚污染治理提供了新的解决方案。
实验方法的有效性
02
实验过程中采用的方法具有可行性，为后续研究提供了参考和
学习并掌握实验操作技能
1 2
3
培养基配置
学习如何根据配方配置培养基，掌握培养基的灭菌技术。
接种与培养
学习如何进行微生物的接种和培养，掌握无菌操作技术。
菌种分离纯化
学习并掌握菌种的分离、纯化和保藏方法。
理解苯酚生物降解菌在环境保护中的重要性
去除污染物
苯酚生物降解菌能够降解苯酚等有机污染物，降低其对环境的危害{01}
目 录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果与数据分析 • 结论与展望
01 实验目的
了解苯酚生物降解菌的筛选过程
筛选原理
通过富集培养基培养含有苯酚的 废水，从中筛选出能够降解苯酚 的微生物。
筛选步骤
配置富集培养基、接种废水、培 养、观察并记录微生物的生长情 况、分离纯化菌种。
菌种的分离与纯化
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实验三高效苯酚降解菌的筛选及其性能测定
一、实验目的
1、掌握微生物分离纯化的基本操作；
2、掌握用选择性培养基从环境中分离苯酚降解菌的原理和方法；
3、掌握微生物对酚降解能力的测定方法；
4、掌握4-氨基安替比林法测定苯酚含量的方法。
二、实验原理
在工业废水的生物处理中，对污染成分单一的有毒废水，可以选育特定的高效菌株进行处理。
这些高效菌株以有机污染物作为其生长所需的能源、碳源或氮源，从而使有机污染物得以降解，具有处理效率高、耐受毒性强等优点。
苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。
本实验通过筛选苯酚降
解菌来处理含酚废水，将苯酚降解为为二氧化碳和水，消除对环境的污染。
+ COOHCH2CH2COOH CH3COOH
C O2+H2O
从环境中采样后，在以苯酚为唯一碳源的培养基中，经富集培养、分离纯化、降解实验和性能测定，可筛选出高效酚降解菌。
三、实验器材与试剂
1、样品
实验土样采自校园污水处理厂。
2、器材
恒温培养箱、恒温摇床、分光光度计、比色皿、试管、250mL三角瓶、100mL 容量瓶、培养皿、涂布玻棒、量筒、天平、灭菌锅、酒精灯、接种环、棉花、棉
线、牛皮纸、pH 试纸。
3、试剂
葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸钠（Na2B4O7）、4-氨基安替比林、过硫酸铵（（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂。
苯酚标准溶液：称取分析纯苯酚 1.0g，溶于蒸馏水中，稀释至1000mL，摇
匀。
此溶液溶度为1000mg/L。
测定标准曲线时将苯酚浓度稀释至100mg/L。
Na2B4O7 饱和溶液：称取N a2B4O7 40g，溶于1L 蒸馏水中，冷却后使用，此
溶液的pH值为10.1。
3% 4-氨基安替比林溶液：称取分析纯4-氨基安替比林3g，溶于蒸馏水中，
并稀释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。
2% （NH4）2S2O8 溶液：称取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸馏水中，并稀
释至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用两周。
4、培养基
富集培养基：蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.1g，MgSO4 0.05g，水1000mL，调节pH 7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。
基础培养基：K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，NH4NO3 0.5g，MgSO4 0.2g，CaC2l 0.025g，水1000mL，调节pH 7.0-7.5，高压蒸汽灭菌，冷却后视需要添加适量的苯酚。
四、实验步骤
（一）富集培养和驯化
采集活性污泥或土样，接种于装有100mL 富集培养基和玻璃珠并加有适量
苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30℃振荡培养。
待菌生长后，用无菌移液管吸取
1mL 转至另一个装有100mL 富集培养基和玻璃珠并加有适量苯酚的三角瓶中，
如此连续转接2-3 次，每次所加的苯酚量适当增加，最后可得酚降解菌占绝对优
势的混合培养物。
（二）平板分离和纯化
1、用无菌移液管吸取经富集培养的混合液10mL，注入90mL无菌水中，充
分混匀，并继续稀释到适当浓度。
2、取适当浓度的稀释菌液，加一滴于固体平板（由富集培养基加入2%的琼
脂组成，倒平板时添加适量的苯酚，浓度达到200 mg/L。
）中央，用无菌玻璃涂
棒把滴加在平板上的菌液涂平，盖好皿盖，每个稀释度做2-3 个重复。
3、室温放置一段时间，待接种菌液被培养基吸收后，倒置于30℃恒温箱中
培养2-3d。
4、挑选不同菌落形态，在含适量苯酚的固体平板上划线纯化。
平板倒置于
30℃恒温箱中培养2-3d。
（三）转接斜面
将纯化后的单菌落转接至补加适量酚的试管斜面，30℃恒温箱中培养2-3d。
（四）降解实验
用接种环取斜面菌苔一环，接种于100mL基础培养基中，添加适量的苯酚，30℃震荡培养2-3d。
（五）酚含量的测定
1、标准曲线的绘制：取100mL容量瓶7 只，分别加入100mg/L 苯酚标准溶
液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，于每只容量瓶中加入Na2B4O7 饱和溶液10mL，3% 4-氨基安替比林溶液1mL，再加入Na2B4O7 和溶液10mL，2%（NH4）
S2O8 1mL，然后用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。
放置10min 后将溶液转至比色皿中，
2
在560nm 处测定吸光度，根据吸光度和苯酚的量绘制标准曲线。
2、培养液中苯酚含量的测定：取经降解的培养液30 mL，离心，取上清液
10 mL于100 mL容量瓶中，加入N a2B4O7 饱和溶液10mL，3% 4-氨基安替比林溶
液1 mL，再加入N a2B4O7 饱和溶液10mL，2%（NH4）2S2O8 1mL，然后用蒸馏水
稀释至刻度，摇匀。
放置10min 后将溶液转至比色皿中，在560nm 处测定吸光度，从标准曲线上查得苯酚的量。
（六）、计算
C（苯酚，mg/L）=查得的苯酚毫克数/10×1000
苯酚脱除率=（C1-C2）/C1×100%
式中：
C1----降解前溶液中的苯酚浓度；
C2----降解后溶液中的苯酚浓度；
五、注意事项
1、各种培养基的配制应严格按配方的要求完成，尤其是苯酚的称量和pH；
2、涂布平板的菌悬液只作适度稀释，菌浓度不必过低；
3、涂布平板的菌悬液不要过多或过少，0.2mL为宜；
4、平板上挑取菌落时，要挑取单菌落；
5、单碳源实验的培养基和培养条件一定要严格把握。
六、思考题
1、如何从环境中分离高效苯酚降解菌株？
七、参考文献
1、张清敏. 环境生物学实验技术，化学工业出版社，2005
2、王兰. 环境微生物学实验方法与技术，化学工业出版社，2009
3、刘娜等. 环境生物技术实验，清华大学出版社，2012
4、孔志明等. 现代环境生物学实验技术与方法，2005。