人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定

人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定作者：刘晓丹，刘兵，李秀森，毛宁【摘要】本研究旨在探讨人脐带静脉灌注液中是否存在间充质干细胞及其分离和扩增方法。

从正常产妇分娩后的脐带静脉灌注液分离间充质干细胞，观察细胞形态并用流式细胞仪分析其细胞表型和细胞周期，在体外分别诱导其成骨、成脂肪和成软骨细胞分化。

结果表明：脐带静脉灌注液来源的间充质干细胞为成纤维细胞样，高表达CD29、HLA ABC、CD166、CD105、CD73、CD44；不表达造血和内皮标志（CD34、CD45、CD144和CD14）。

它们可向骨、脂肪和软骨细胞分化，符合间充质干细胞的基本功能特征。

结论：人脐带静脉灌注液存在间充质干细胞，能够在体外培养和扩增，可作为今后细胞治疗和组织工程的种子细胞。

【关键词】脐带静脉灌注液Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells from Perfusion of Human Umbilical Cord VeinAbstract This study was aimed to investigate whethermesenchymal stem cells (MSCs) existed in human umbilical cord vein and to establish the methods of isolation and expansion in vitro. The MSCs direved for perfusion of umbilical cord vein (UVMSCs) were collected after parturition of Healthy pregnant women. The morphology of MSCs and their differentiation potential into osteoblast, adipocyte and chondrocyte were observed the phenotype and cell cycle of MSCs were determined by using flow cytometry. The result showed that the mesenchymal stem cells separated from umbilical cord vein gave rise to a population of adherent cells with a typical fibroblast like morphology. Similarly to bone marrow derived MSCs, they highly expressed CD29, HLA ABC, CD166, CD105, CD73 and CD44, and were negative for any hematopoietic and endothelial markers (CD45, CD34, CD14 and CD144). Functionally, they could differentiate into the osteoblast, adipocyte and chondrocyte. It is concluded that MSCs exist in the human umbilical cord vein perfusion. Their read amplification in vitro contribute to clinical applications for cell therapy and tissue engineering.Key words mesenchymal stem cell; umbilical cord vein perfusion; cell isolation; cell identification间充质干细胞（mensenchymal stem cells, MSC）最早自骨髓中分离，是一类具有自我更新及多向分化潜能的中胚层源干细胞［1］。

作为多种骨髓基质的前体细胞，MSC能通过调节造血微环境以促进造血干细胞增殖、分化，它亦能调节淋巴细胞免疫功能，从而减轻移植排斥反应等生物学效应［2］。

MSC的发现为针对性解决造血干细胞移植，尤其是脐血移植中的干细胞数量相对不足及减轻移植物抗宿主病提供了一个有效手段［3，4］。

然而，临床上骨髓取材困难，供体有限，随年龄的增加其增殖和分化能力下降，且有病毒污染的可能［5］。

因此，寻找MSC的新来源具有重要意义。

本研究从易于获取、且组织来源较为原始的脐带静脉灌注液中寻找MSC（UVMSC），并对其进行生物学特性的鉴定。

材料和方法材料与试剂脐带来自北京市中西医结合医院正常分娩产妇，均经父母授权同意。

Ⅳ胶原酶为Sigma公司产品，αDMEM为Hyclone公司产品，胎牛血清为FBS，Stem Cell产品，L谷氨酰胺为Amresco公司产品，EGF为Peprotech公司产品，rh VEGF为R&D公司产品，bFGF 为双鹭药业公司产品，胰蛋白酶为Amresco公司产品，诱导试剂：地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐、3异丁酸1甲基黄嘌呤（IBMX），胰岛素、消炎痛、丙酮酸钠均为Sigma公司产品，TGF β3为R&D公司产品，ITS A为Sigma公司产品；流式相关鼠抗人单克隆抗体：CD29PE、CD166PE、 CD14、CD144PE、CD34 FITC、CD45FITC、HLA ABC FITC、HLA DR FITC、CD44 FITC、CD105FITC均为Becton Dickinson公司产品），碱性磷酸酶检测试剂盒为Sigma公司产品。

中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定UVMSC的分离培养与传代取正常产妇分娩后的脐带静脉，无菌条件下用PBS清洗脐带静脉外表面及脐带静脉，止血钳夹住一端，根据脐带静脉的长度，加入适量的0.1% Ⅳ型胶原酶，37℃孵育30分钟，弃去脐带静脉内液体，用PBS灌注脐带静脉3次，收集灌注液，按1×105/cm2,接种于25 cm2的塑料培养瓶中，培养体系为： 10% FBS、αMEM、EGF（10 ng/ml）、rh VEGF（10 ng/ml），青霉素（100 U/ml ）、链霉素（100 U/ml ）、L谷氨酰胺2 mmol/L，置于37℃和5% CO2条件下孵育72小时后换新鲜培养液，待细胞融合达80%以上，加入0.05%胰蛋白酶EDTA溶液消化，按1∶3或1∶4传代。

待3代后，细胞形态呈纤维细胞状，可停止加入EGF和VEGF。

取3代以上细胞作后续试验。

UVMSC 表面抗原的检测取第5代处于对数生长期UVMSC，按每管2×105个细胞，依次加入10 μl鼠抗人单克隆抗体CD29PE、CD166PE、CD73PE、CD14PE、CD144PE、CD34FITC、CD45FITC、HLA ABC、HLA DR、CD44FITC、CD105FITC，另设1管为对照组，室温避光30分钟；用PBS反复洗2-3次，减少非特异性结合；离心后，加入1%多聚甲醛固定，4℃保存，1周以内进行流式细胞仪检测。

UVMSC的细胞周期检测收集对数生长期UVMSC 1×106，PBS洗2次，0.9% FBS的70%乙醇重悬，4℃保存过夜，然后用PBS洗2次，加1 mg/ml RNase于37℃孵育30分钟，加入150 μg/ml PI,室温避光20分钟，上流式细胞仪进行细胞周期检测。

UVMSC的生长曲线检测收集UVMSC细胞，按每孔500个细胞接种于96孔板内，每组3个复孔，待24小时后，加入MTT 20 μl，4小时后加入100 μl裂解液，于37℃过夜，第2天用酶联仪测定OD540，连续测定6天。

定向诱导UVMSC向成骨细胞分化的方法与鉴定收集消化后UVMSC，按3 000/cm2接种于6孔板内，成骨的诱导体系为：地塞米松0.1 μmol/L、β甘油磷酸钠10 mmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 μmol/L、10% FBS、高糖DMEM，每3天全量换液，维持3周，然后进行碱性磷酸酶检测，方法同文献［6］。

定向诱导UVMSC向脂肪细胞分化的方法与鉴定收集UVMSC后按9 000/cm2接种于6孔板内，待细胞贴壁后，加入脂肪诱导体系:地塞米松1 μmol/L、IBMX 0.5 μmol/L、消炎痛200 μmol/L、10% FBS、高糖DMEM，每3天全量换液，维持3周，然后进行油红染色，显微镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况。

定向诱导UVMSC向软骨细胞分化的方法与鉴定收集第3代到第5代细胞，取2×105细胞放于15 ml塑料管内，300×g离心10分钟，弃上清液，加入0.5 ml软骨培养体系，包括：ITS A 5 μl、地塞米松0.1 μmol/L、抗坏血酸磷酸盐50 μmol/L、丙酮酸钠1 mmol/L、TGFβ3 10 ng/ml、高糖DMEM补足0.5 ml。

每3天全量换液，培养3周后，石蜡包埋，切片，进行甲苯胺蓝染色鉴定。

结果形态学观察Ⅳ型胶原酶消化的细胞接种72小时后全量换液。

此时可见少量形态各异的细胞贴壁，散在分布。

1周左右，贴壁细胞形成集落，绝大多数细胞呈纺锤形或成纤维样细胞，与骨髓来源的MSC形态相似。

细胞折光性较好，核仁明显，胞体较骨髓MSC大，且胞体较宽（图1A）。

同时可见少量鹅卵形细胞，可能为脐带静脉内皮细胞。

约14天后，细胞可长至80%-90%融合，用0.05%胰蛋白酶EDTA消化。

传代1-2次后，细胞形态变得较为均一，脐带静脉Figure 1. Morphology of MSCs from perfusion of umbilical cord vein (UVMSC). A: UVMSC in primary culture for one week. B: UVMSC at passage 5, reaching a 100% confluence and forming a vortex arrangement(10×10).内皮细胞得到抑制。

将培养液更换为含有bFGF(10 ng/ml)、2 mmol/L谷氨酰胺的10% FBS的αMEM。

细胞长100%融合时，细胞呈漩涡状（图1B），细胞可培养20代以上。